WO2000066712A2

WO2000066712A2 - Modulare zellträgersysteme für dreidimensionales zellwachstum

Info

Publication number: WO2000066712A2
Application number: PCT/EP2000/001913
Authority: WO
Inventors: Markus Oles; Dierk Landwehr; Beate Kossmann
Original assignee: Creavis Gesellschaft Für Technologie Und Innovation Mbh
Priority date: 1999-04-28
Filing date: 2000-03-04
Publication date: 2000-11-09
Also published as: EP1171572A2; CA2372219A1; DE19919242A1; ZA200109700B; JP2002542817A; WO2000066712A3

Abstract

Die Erfindung betrifft Zellträgersysteme aus Halbschalen eines porösen Materials. Die Halbschalen können durch Kombination untereinander oder mit einer semipermeablen Membran ein Kapillarsystem bilden. Die Zellträgersysteme können zur Kultivierung von eukaryontischen oder organischen Stammzellen bzw. für Bioreaktoren verwendet werden.

Description

Modulare Zellträeersvsteme für dreidimensionales Zellwachstum

Die vorliegende Erfindung betrifft kunstliche Zelltragersysteme für ein dreidimensionales Zellwachstum und deren Verwendung

Die Kultivierung von tierischen, humanen und im zunehmenden Maße auch pflanzlichen Zellen wird heute für eine Vielzahl von Aufgaben eingesetzt Hierzu zahlen neben wissenschaftlichen Zwecken und pharmakologischen Untersuchungen auch zunehmend biotechnische Anwendungen wie die Produktion von Antikörpern und Pharmazeutika All diesen Anwendungen liegt ein zweidimensionales Wachstumsverhalten der Zellen zugrunde, da mit den meisten Zellkultur-Techniken nur eine Zellschicht (Monolayer) gezüchtet werden kann

Wahrend der seriellen Subkultivierung von Zellen oder Primarkulturen wird häufig eine Veränderung in der Genexpression festgestellt Dies gilt auch für viele immortalisierte Zellinien, die häufig nur noch einen Bruchteil ihrer ursprunglichen Differenzierung zeigen Neben der genetischen Instabilität gibt es weitere Ursachen für diese Differenzierung in vitro Im naturlichen Gewebeverband (in vivo) wachsen die Zellen in einer raumlich hoch strukturierten Umgebung Hierdurch ergeben sich andere Zeil-Interaktionen, die eine völlig andere Zellaktivitat und Proliferation zur Folge haben Ein weiteres, sehr wichtiges Merkmal des naturlichen Gewebeverbandes ist die Vaskularisierung Es handelt sich hierbei um ein dichtes Netz von Blutgefäßen (Kapillaren und Venolen) mit denen die Versorgung der Zellen mit Wachstumsfaktoren und Sauerstoff sichergestellt wird

Diese Erkenntnis hat zu verfeinerten Zellkulturtechniken geführt, die naher an der naturlichen Umgebung (in vivo) orientiert sind und die extrazellulare Matrix (ECM) mit in das in vitro System einbeziehen

In-vitro-Zellkulturen wachsen häufig nur zweidimensional (Monolayer) Ein mehrlagiges

Wachstum ist nicht nur zum Aufbau von dickeren Schichten erwünscht, sondern auch, um einen funktionsfähigen Zellverband wie z B ein Organ zu erhalten Zeilverbande weisen neben einer hohen Zelldichte Interaktionen zwischen den Zellen oder anderen Geweben auf Diese Interaktionen sind für die Zell-Proliferation und -Differenzierung notwendige epigenetische Faktoren

In jüngster Zeit wurden deshalb verstärkt Bemühungen unternommen, auch mehrlagige Zellkulturen (Multilayer) zu produzieren Erste Ansätze verwenden hierfür ein dreidimensionales Wachstumsgerust, auf dem die Zellen proliferieren können Die Gestalt solcher Gerüste variiert sehr stark Eine mittlerweile sehr häufig genutzte Technik ist die Herstellung einer extrazellularen Matrix aus Laminin, Matrigel, Fibronetin und Collagen (z B E A Blomme et al "Influence of extracellular matrix macromolecules on normal human keratinocyte phenotype and parathyroid hormone-related protein secretion and expression in vitro" in Experimental Cell Research, (1998), 238, 1, 204-15) Bei dieser Technik werden die Kulturgefaße mit einer mehr oder weniger dünnen Schicht dieser Komponenten beschichtet Die so entstandene Struktur dient dann als Wachstumsgerust für verschiedene Zelltypen

Andere Ansätze nutzen Zellulose Schaume oder Hydrogele als Wachstumsgeruste für Zellkulturen, so beschrieben in EP 0 451 707- A Der Vorteil dieser Schaume liegt in dem sehr guten Oberflachen/Volumenverhaltnis, d h bezogen auf ein kleines Volumen wird eine sehr große Oberfläche als Adhasionsflache für das Zellwachstum zur Verfügung gestellt Häufig werden diese Wachstumsmatrixen ebenfalls mit einer extrazellularen Matrix beschichtet, um eine bessere Proliferation und Differenzierung zu gewahrleisten (siehe z B Y Watanabe et al "TNF-alpha bifünctionally induces proliferation in primary hepatocytes role of cell anchorage and spreading" in Journal of Immunology, (1997), S 4840-7) Als Materialien zur Herstellung von derartigen schaumartigen Zelltragern werden z B Cellulosederivate eingesetzt Wichtig ist die Porenbildung in diesen Schäumen, da die Zellen in den Poren angesiedelt werden oder aber die Nahrstoffversorgung über kleine Poren im Material erfolgt Die Dimensionierung der Poren kann jedoch nur unzureichend gesteuert werden Sind die Poren zu klein, so können dort keine Zellen einwachsen, bei zu großen Poren findet dort ein unerwünschtes, zweidimensionales Zellwachstum statt Die für das Wachstum der Zellen entscheidende Nahrstoffversorgung bzw der Abtransport von Stoffwechselprodukten hangt ebenfalls von einer definierten Porengroßenverteilung ab Die schwer zu kontrollierende Porengroßenverteilung führt somit zu einem ungenügend kontrollierbaren Zellwachstum Bisher konnten mit diesen Konzepten keine f nktionellen Gewebe- oder Organverbande gezüchtet werden Bei Verwendungszwecken, die einen höheren Differenzierungsgrad und dickere Zellschichten erforderten, wie beispielsweise Bindegewebe oder kunstliche Organe, versagten diese Techniken Ein Grund dafür ist die nicht zu gewahrleistende Versorgung dicker Zellschichten mit Nahrmedien und Sauerstoff, wie es in vivo durch eine Vaskularisierung des Gewebes sichergestellt wird Eine Versorgung der Zellen über interzellulare Wege mit Sauerstoff und Nährstoffen ist nur über wenige Zellen bzw Zellschichten möglich

Der Einsatz von semipermeablen Membranen schaffte hier zum Teil Abhilfe Ein System, das den Einsatz von Polymervliesen als Tragersystem in Verbindung mit einer Perfüsionskammer nutzt, wird beispielsweise von M Sittinger et al in "The International Journal of Artificial Organs" 1997, Vol 20 No 1, S 57-62 beschrieben Auf großen Vlies-Flachen werden hier Knorpel im ersten Schritt zu einem möglichst konfluenten Monolayer gezüchtet Danach werden die Zellen in ein Perfüsionskultursystem eingebracht In diesen Kammern können Knorpelzellen gut wachsen, da hier ein für diesen Gewebetyp ausreichender Austausch von Nährstoffen und Abfallprodukten gewahrleistet ist Die Grenzen dieser Technik sind aber auch nach wenigen Zellschichten erreicht, so daß Gewebearten, die eine intensive Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff benotigen, hiermit nicht gezüchtet werden können

Durch geeignetes ubereinanderschichten einzelner Membranen kann ebenfalls eine annähernd dreidimensionale Struktur geschaffen werden Der Nachteil dieser Struktur ist aber, das sie nicht selbst tragend ist, schlecht bzw nur bis zu einer kleinen Hohe stapelbar und die Nahrstoffversorgung durch die aufeinander liegenden Membranbahnen schwierig zu kontrollieren ist

Weiterhin stehen die einzelnen Zellschichten nicht miteinander in Kontakt, es liegen somit aufeinander gestapelte zweidimensionale Schichten und keine dreidimensionale Struktur vor

J C Hager et al beschreiben in J Natl Cancer Inst , 69, 6 (1982) ein System von geordneten Bundein aus Hohlfasern zur Züchtung von Tumorzellen Diese Fasern dienen als Oberflache für die Zelladhasion und, über Poren in den Fasern, als Versorgungsweg für die Bereitstellung von Nährstoffen und Sauerstoff Mit ihnen kann ein dreidimensionales Zellwachstum erreicht werden Ein geordnetes Zellwachstum ist durch die schwer zu kontrollierenden Faserabstande nicht möglich Weiterhin bestimmen Lange, Durchmesser und Anordnung der Fasern die Ausdehnung und Struktur des zu zuchtenden Gewebes

WO 90/02796 und US 5 510 254 beschreiben eine weitere Möglichkeit, annähernd dreidimensionale Zellstrukturen aufzubauen Hier werden netzartige Zelltragerstrukturen, gegebenenfalls mit wachstumsfordernden Stoffen beschichtet, eingesetzt Die Gewebe können zu Uberstrukturen angeordnet werden, wobei eine zellulare Verbindung zwischen den einzelnen Schichten von deren Abstand abhangt und somit ebenfalls nur unzureichend beeinflußt werden kann Systeme dieser Art sind für Zellstrukturen mit wenigen Schichten geeignet, eine komplexe, viellagige dreidimensionale Zellstruktur kann mit Hilfe von diesen Geweben nicht gezüchtet werden

Weiterentwickelte Zelltragersysteme sind in E Wintermantel, S -W Ha, "Biokompatible Werkstoffe und Bauweisen" Springer Verlag 1996, S 98-109 beschrieben Hier werden insbesondere die Oberflachentopographie und Oberflachenfünktionalitat von porösen Tragern diskutiert Diese Tragersysteme weisen jedoch ebenfalls keine definierten Porengroßen bzw eine auf den eingesetzten Zelltyp und/oder den angestrebten Verwendungszweck angepaßte Oberflachenbeschaffenheit auf Ein gezielter dreidimensionaler Aufbau von Zellgeweben ist mit diesen Techniken nicht möglich

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es somit, einen Zelltrager zur Verfügung zu stellen, mit dem dreidimensionale Zellgewebe in vitro und in vivo gezüchtet werden können

Es wurde gefunden, daß mit einem Zelltragersystem, bestehend aus modular geformten Segmenten eines porösen Materials auch komplexe dreidimensionale Zellgewebe hergestellt werden können

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Zelltragersystem aus porösem Material, wobei das Zelltragersystem aus modular geformten Segmenten besteht, die ganz oder teilweise aus Halbschalen aufgebaut sind Die Porosität der modular geformten Segmente kann gezielt an den verwendeten Zelltyp angepaßt werden Die modular geformten Segmente können je nach Zelltyp Poren mit einem mittleren Durchmesser von 0,5 bis 5 μm aufweisen Die Verteilung der Poren wird vorteilhaft so gewählt, daß zwischen einer und drei Poren pro angewachsener Zelle für die Versorgung der Zellen bereitstehen, d h die Segmente besitzen vorteilhaft Poren mit einem mittleren Abstand von 1 bis 10 μm Die Segmente der Zelltrager besitzen ganz oder teilweise eine poröse Struktur, wobei ein gezieltes Zellwachstum vorzugsweise nur an den porösen Stellen der Segmente erfolgt

Die nicht-porosen Stellen der Segmente können durch das hier verminderte Zellwachstum für Befestigungszwecke o a eingesetzt werden

Das auf den erfindungsgemaßen Zelltragersystemen gezüchtete Zellgewebe ist aufgrund der hervorragenden Vaskularisierung in vitro und in vivo proliferationsfahig Durch die modulare Form der Segmente können Zelltragersysteme mit nahezu beliebiger Form und Komplexität aufgebaut werden Die optionale Verbindung zwischen zwei oder mehreren Segmenten ermöglicht die Züchtung von praktisch beliebig großen, zusammenhangenden Zeil- und Gewebekulturen

Zelltragersysteme gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglichen den Aufbau von dreidimensionalen Zellgeweben, in dem alle Zellen über eine poröse und damit mikro strukturierte Oberflache mit Nährlösung und Sauerstoff versorgt werden können

Die Versorgung der Zellen auf den erfindungsgemaßen Zelltragersystemen erfolgt über ein Kapillarsystem, das durch Kombination der Halbschalen je zwei modular geformter Systeme gebildet werden kann Die Segmente können in einer Weise kombiniert werden, daß aus den beiden Halbschalen ein geschlossener Hohlkörper, d h ein Kapillarsystem entsteht Die Kombination von zwei Segmenten kann durch entsprechende Haltestifte vereinfacht werden Die Kapillaren weisen bevorzugt einen Duchmesser von 20-70 μm auf Ein solches System bietet die Möglichkeit, freigesetzte Wachstumsfaktoren in der gesamten Zellkultur zu verteilen und dadurch eine Differenzierung des Gewebes zu ermöglichen Es ist mit der vorliegenden Erfindung möglich, einen kontinuierlichen Ab- und Zufluß von Nährstoffen, Stoffwechselprodukten, Sauerstoff und Wachstumsfaktoren zu den Zellgeweben zu gewahrleisten

Das Zellwachstum wie auch die Zelldifferenzierung werden wesentlich über die Oberflachentopographie des Zelltragers beeinflußt Der Austausch von Nährstoffen und die Verteilung der Zellen auf der Oberflache wird durch die Art und Topographie der MikroStruktur d h im vorliegenden Fall von der Porosität der Oberflache bestimmt Die meisten Anwendungen sind hierbei durch Diffusion der metabolischen Aktivität des Gewebes limitiert Bei der vorliegenden Erfindung nimmt durch die gute Nahrstoffversorgung mit zunehmender metabolischer Aktivität auch die Vaskularisierung des Gewebes zu und reduziert somit die notigen Diffusionswege

Es ist ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung, daß die Zelltragersysteme aus geformten Segmenten bestehen, die einen modularen Aufbau eines Verbundsystems ermöglichen

Geeignete Materialien für die erfindungsgemaßen Zelltragersysteme sind beispielsweise Polycarbonat, Polymethylmethacrylat, Polyurethan, Polyamid, PVC, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol oder Polysulfonat, sowie deren Gemische oder Copolymere

Die Fixierung von zwei Segmenten zur Bildung eines Kapillarsystems kann durch Kleben, Mikrowellen- oder Hochfrequenztechniken erfolgen Dies muß selbstverständlich in einer Weise erfolgen, das die Poren des Material nicht oder nur wenig beeinträchtigt werden

Weiterhin können die Zelltragersysteme, seien es einzelne Segmente oder bereits vorgeformte Kapillarsysteme, miteinander verbunden werden Dies kann durch den Einsatz von Abstandhaltern, die vorteilhaft bereits mit der Herstellung der Segmente an diesen fixiert werden, erreicht werden Durch die Abstandhalter wird darüber hinaus ein konstanter Abstand zwischen einzelnen Segmentschichten eingestellt, so daß auch hier Zellen wachsen können Die modular geformten Segmente weisen bevorzugt Abstandhalter mit einer Hohe von 20 bis 200 μm auf Sofern die Abstandhalter hohl und für einen Flussigkeitstransport geeignet sind, kann so die Nährlösung durch das gesamte System geführt werden

Die modulare Ausführung der Segmente bewirkt ein Minikry der naturlichen Umgebung der Zellen, so daß eine Proliferation, Differenzierung oder die Ausführung der physiologischen Funktionen der Zellen so lange erfolgt, wie die Zellen mit Nährlösung durch das poröse Material versorgt werden können Diese Versorgung erfolgt in der Regel über 2 bis 20 Zellschichten, wobei die Anzahl der versorgten Zellschichten stark vom Stoffwechsel der Zellen abhangt Leber- und Nierenzellen müssen auf Zelltragersystemen mit kleinen Abstanden (20-40 μm) gezüchtet werden, da sie auch im Korper eine hohe Blutversorgung benotigen Der Abstand der Zelltragersysteme bei Fibroblasten und Knorpelzellen kann dagegen sehr groß, bis zu 200 μm, sein

Die einzelnen Segmente können mittels der Mikro Systemtechnik hergestellt werden Ein geeignetes Verfahren ist beispielsweise das LIGA- Verfahren, einem Strukturierungsverfahren, das auf Grundprozessen der Rontgen-LIthographie, Galvanik und Abformung beruht Mit den durch LIGA-Technik hergestellten Formeinsatzen können dann im Spritzguß, Reaktionsharzguß oder durch Prageverfahren beliebig viele Kopien aus diversen Kunststoffen mit hoher Detailtreue und mit relativ geringen Kosten hergestellt werden Die Poren können durch geeignete Dornfortsatze an den Formeinsatzen in das Material eingebracht werden

Fig 2 zeigt beispielhaft den Aufbau eines erfindungsgemaßen Zelltragers aus zwei Segmenten Ein Segment besteht aus einem zentralen Versorgungsrohr, von dem senkrecht, in periodisch sich wiederholenden Abstanden, Abzweigungen abgehen Diese Abzweigungen bilden ein Kapillarsystem Die Oberflache der Segmente sind mit kleinen Poren versehen, die abhangig vom verwendeten Zelltyp einen Durchmesser von 0,5-5 μm besitzen Die Poren besitzen einen mittleren Abstand von 1 bis 10 μm, der Abstand der Abzweigungen zueinander (Ll) kann dem Zelltyp angepaßt zwischen 20 und 200 μm betragen

Durch das zentrale Versorgungsrohr wird das Nahrmedium aktiv oder passiv durch ein entsprechendes Gefalle gepumpt Die Verteilung des Nahrmediums und der Atemgase zum Gewebe wird durch Diffusion sichergestellt Der Nahrstoffkreislauf ist so gestaltet, daß das Medium über einen Abfluß wieder ablaufen und dem Kreislauf erneut zugeführt oder zur Weiterverarbeitung/Entsorgung gesammelt werden kann

Die einzelnen Segmente sind modular aufgebaut, so daß sie paßgenau zu größeren, dreidimensionalen Objekten zusammengesteckt werden können Hierdurch entsteht ein kunstliches Kapillarnetz, das eine nahezu naturliche Vaskularisierung der Zellen ermöglicht Geeigneterweise besitzen die Segmente entsprechende Abstandhalter als Steckvorrichtungen, um eine einfache und paßgenaue Verbindung zwischen zwei Segmenten zu ermöglichen

Um die gewünschten Abstände zwischen den erfindungsgemaßen Segmenten einzustellen, sind diese mit Abstandhaltern versehen Zweckmäßig dienen die Abstandhalter als Steckvorrichtung zur Fixierung von zwei Segmenten (AH in Fig 3) Der Zu- und Abfluß ist ebenfalls so konstruiert, daß die einzelnen Segmente miteinander in einer flussigkeitsführenden Verbindung stehen können Für die Verbindung der Zu- und Abflüsse von Segmenten können hohl ausgeführte Abstandhalter eingesetzt werden

Die Segmente können auch versetzt zu einander gestapelt werden

Die gewünschten Zelltypen können nach erfolgtem Aufbau des Zelltragers aus den einzelnen Segmenten auf diese aufgebracht werden Das System wird hierzu in eine Rollerflasche mit einer Zellsuspension von hoher Dichte gebracht In dieser Flasche bleibt das System bei mittlerer Umdrehungszahl der Rollerflasche solange, bis sich genügend Zellen auf der Oberflache festgesetzt haben Dies ist typischerweise nach 3 bis 8 Stunden abgeschlossen Anschließend wird das System, vorzugsweise unter sterilen Bedingungen, in eine Petrieschale überführt und es wird durch die Versorgungsanschlusse der Segmente standig frisches Medium durch die Zelltrager gepumpt Nach wenigen Tagen bildet sich auf den Segmentoberflachen und damit zwischen den Kanalwanden ein mehrlagiges Zellgewebe

Alternativ kann der Aufbau des Zellgewebes auch schrittweise erfolgen Es wird zunächst eine Ebene der erfindungsgemaßen Zelltrager mit Zellen inkubiert Nachdem auf dieser, untersten Ebene eine Zellschicht gewachsen ist, wird das System um eine Zelltragerschicht schrittweise erweitert, um auch hier eine Zellschicht anwachsen zu lassen Das sukkzessive Vorgehen hat den Vorteil, das durch unterschiedliche Abstände der Segmente bzw der Tragerschichten auch eine unterschiedliche Differenzierung eines Zelltyps erzwungen werden kann Die unterschiedliche Differenzierung eines Zelltyps ist z B bei Hautzellen von Bedeutung In der Praxis haben sich Segmentabstande von 3-6 Zellagen bewahrt

Die erfindungsgemaßen Zelltrager ermöglichen eine gute Versorgung der Zellen mit Nährstoffen Dies kann durch eine Verästelung der Segmente erreicht werden Fig 4 a bis e zeigt eine beispielhafte Ausführung eines solchen Systems, basierend auf einer Wabenstruktur In dieses System wird durch einen Zulauf Nahrmedium gepumpt Über den Abfluß kann das Medium ablaufen und wieder dem Kreislauf zugeführt werden oder zur Weiterverarbeitung/Entsorgung gesammelt werden Die Oberflache der Segmente ist mit kleinen Poren mit Große und Verteilung wie bereits beschrieben, versehen Durch Kombination der Segmente entsteht auch bei dieser Ausfuhrungsvariante ein kunstliches Kapillarnetz

Der Durchmesser der einzelnen Waben („Schlusselweite") ist abhangig vom verwendeten Zelltyp und kann zwischen 70 und 180 μm betragen Um eine optimale Versorgung der Zellen sicherzustellen, kann der nächste wabenformige Zelltrager um 90 Grad (Fig 4 c) gedreht über den vorhergehenden Zelltrager gestapelt werden

Wie bei der leiterformigen Struktur beschrieben, kann auch mit wabenformigen Segmenten eine dreidimensionale Zellkultur aufgebaut werden Auch hier ermöglichen entsprechend ausgeführte Steckverbindungen zwischen den Waben ein schichtubergreifendes Zellwachstum (Fig 4 e)

Die wabenformigen Zelltrager sind, wie in Fig 1 skizziert, aus zwei fest miteinander verbundenen Halbschalen oder einer Halbschale und einer Membrane aufgebaut

Die erfindungsgemaßen Zelltrager können auch aus eher flachigen Segmenten aufgebaut werden Fig 5 zeigt schematisch den Aufbau eines solchen Zelltragers in einer pyramidenförmigen Ausführung in der Auf- (Fig 5 a) und Seitenansicht (Fig 5 b und c) Die

Segmente sind in parallel geführten Reihen periodisch angeordnet (Fig 5 c und d) Zwischen den Reihen bleibt ein Abstand, vorzugsweise von der halben Grundflache einer Pyramide Die einzelnen Segmentreihen können wiederum durch ggf für den Flussigkeitstransport geeignete Abstandhalter miteinander verbunden werden Über einen Zulauf wird Nahrmedium durch die Elemente gepumpt Über einen Abfluß kann das Medium ablaufen, dem Kreislauf wieder zugeführt oder zur Weiterverarbeitung/Entsorgung gesammelt werden Die Oberflachen der Pyramiden sind mit kleinen Poren mit Große und Verteilung wie beschrieben, versehen Die Pyramiden selbst sind hohl, an der Grundflache offen und bilden somit ebenfalls eine Halbschale Die Seitenansicht in Fig 5 c zeigt die Verbindung zweier Segmente zu einem geschlossenen Zelltragersystem

Eine Zellkultur mit erfindungsgemaßen, pyramidenförmigen Zelltragersegmenten kann wie folgt aufgebaut werden In ein geeignetes Zellkultursystem werden als Basiselement einige pyramidenförmige Segmente auf dem Boden aufgebracht Oberhalb von diesen Strukturen können nun weitere Segmente positioniert werden Durch die Kombination von Segmenten entstehen die Zelltrager (siehe Seitenansicht Fig 5 c) Die Segmente können so ineinander verschachtelt werden, daß zwischen den Oberflachen der Pyramiden ein Abstand, in dem die Zellen wachsen können, besteht

Der Vorteil dieser Struktur ist, daß die geometrischen Abmessungen der Elemente unabhängig vom gewählten Zelltyp sind Nur der Schichtabstand und der Porendurchmesser der Elemente muß an den verwendeten Zelltyp angepaßt werden Um eine möglichst hohe Zelldichte bzw ein kleines Totvolumen innerhalb der Pyramiden d h der Versorgungselemente zu erreichen, empfiehlt sich eine kleine Hohe der einzelnen Pyramidenelemente im Vergleich zu ihrer Grundflache Die in Fig 5 d gezeigten Zelltrager besitzen folgende Abmaße

Pyramidenhohe al 20 - 40 μm

Hohe Grundflache a2 20 - 40 μm

Breite der Segmente a3 150 - 300 μm Lange der Segmente a5 ganzzahlige Vielfache von a3 Abstand der Zelltrager a4 50 - 300 μm Alternativ zu den aus zwei Halbschalen aufgebauten Zelltragersystemen können diese auch durch Kombination einer Halbschale eines modular geformten Segments mit einer semipermeablen Membrane unter Aufbau eines Kapillarsystems gebildet werden Hierbei wird auf der Ruckseite eines Segments eine permeable Membrane gespannt Durch geeignete Atzverfahren können die überstehenden Membranteile entfernt werden Diese Technik hat den Vorteil, daß nicht zwei Segmente passgenau zusammengesetzt werden müssen Semipermeable Membran wie Gorotex, Simpatex oder keramische Membranen sind hierfür geeignet Als bevorzugtes Atzverfahren hat sich Plasmaatzen erwiesen Es handelt sich hierbei um eine Trockenatzvariante, die bei der Herstellung von Strukturen im μm-Bereich genutzt wird Nach dem Aufbringen durch Phaseninversionsprozeß der Membrane auf die Ruckseite eines Segmentes werden in einem Plasmareaktor mit Plasmagasen wie F₂, Cl₂, CF₃7F, CC1₃ ⁺/C1 und O₂ die überstehenden Membranteile weggeatzt Auch diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erzeugt letztendlich geschlossene Hohlräume bzw Kapillare Die Porengroße und Verteilung der Membranen entspricht denen der Segmente mit einem mittleren Abstand von 1 bis 10 μm und einem mittleren Durchmesser von 0,5 bis 5 μm

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der dreidimensionalen Zelltragersysteme für Bioreaktoren und zur Kultivierung von eukaryontischen oder organischen Stammzellen

Wichtige Stammzellen sind Heptozyten, Nierenzellen, Endothelzellen, Epithelzellen oder Myozyten

In der Biotechnologie werden zur Produktion von Hormonen, Cytokinen und anderen gentechnisch herstellbaren Arzneimitteln Zellkulturen verwendet, deren Erbgut so verändert wurde, daß sie zur Produktion der gewünschten Stoffe in der Lage sind Da diese Zellen bisher fast ausschließlich in zweidimensionalen Kulturen gezüchtet werden, differenzieren diese Zellen sehr schnell Dies hat zur Folge, daß die gewünschten Stoffe von der Zelle nicht sehr lange produziert werden und die Zellen ausgetauscht oder das Erbgut der Zellen erneut verändert werden muß Der Einsatz der erfindungsgemaßen, dreidimensionalen Zelltragern zur Kultivierung bietet den Vorteil, daß der Phanotyp der eingesetzten Zellen weitgehend erhalten bleibt und die Differenzierung spater oder gar nicht einsetzt Hierdurch können entscheidende Produktionsvorteile erzielt werden

Durch den Einsatz von erfindungsgemaßen Zelltragern, die für humane Zelltypen optimiert sind, können somit auch humane Proteine synthetisiert werden Dies bedeutet, daß der Aufbau und insbesondere die Faltung der synthetischen Proteine der naturlichen Proteine des menschlichen Korpers entspricht

Da die Zellen auf den erfindungsgemaßen Zelltragern adhariert und nicht in einer Suspension vorliegen, können die von den Zellen produzierten Proteine oder sonstigen Stoffe standig über den Kreislauf der Nahrstoffversorgung entnommen werden Bei nicht adharenten Systemen gelingt dies nur durch eine Filtration oder durch Zentrifügation der Suspensionen Dies ermöglicht z B den Aufbau von Zellkulturen als Implantat bis hin zu kunstlichen Hybridorganen

Die kunstliche Herstellung von Ersatzorganen bereitet noch immer sehr große Schwierigkeiten Klinische Losungsansatze gibt es bisher nur für eine kunstliche Leber (H G Koebe, F W Schildberg in "Die kunstliche Leber - ein Zwischenbericht ", Wiener klinische Wochenschrift, 110, 16, 551-563, 1998) Hier wird eine Suspension aus Hepatotzyten in einer Perfüsionskammer gehalten, die an den Blutkreislauf des Patienten angeschlossen und die Funktion der ausgefallenen Leber übernehmen kann Diese Technik kann bisher nur bei akuten Leberversagen genutzt werden, da die begrenzte Lebensdauer und der veränderte Phanotyp der Kulturen deren längere Verwendung zur Zeit ausschließt

Der Einsatz von erfindungsgemaßen Zelltragersystemen bietet den Vorteil, daß die Hepatozyten nicht in einer Suspension vorliegen, sondern organotypisch wachsen können Hierdurch ist sichergestellt, daß die Heptatozyten einen Differenzierungsgrad erreichen, wie er auch in vito vorliegt

Mit Hilfe der erfindungsgemaßen Zelltragersysteme und der so möglichen Vaskularisierung können die Hepatozyten ausreichend versorgt werden Die einzelnen Segmente werden so geschaltet, daß nur ein Zu- und ein Ablauf vorliegt Zur besseren Handhabbarkeit und zum Schutz vor Infektionen wird das System durch eine äußere Verkapselung geschlossen Der Blutkreislauf eines Patienten kann dann über den nach außen zugeführten Zu- und Ablauf abgeschlossen werden Im Reaktor übernehmen die Zellen dann die Funktion der Leber Mit dieser Technik können auch andere kunstliche Organe wie z B eine Niere aufgebaut werden

Humane Nierenzellen können heute bereits gut in Kultur gehalten werden Bisher scheiterte der fünktionelle Einsatz dieser Zellen im Bereich der Dialyse aber an der Nachbildung von Nephronen in Verbindung mit fünktionell differenzierten Nierenzellen Durch die Kombination von Mikrosystemtechnik und Zellkulturtechnik ist es möglich, solche funktioneilen Einheiten der Niere nachzubilden Hierfür sind allerdings zwei getrennte Kreislaufsysteme, ein System für den Harn und ein System für den Blutkreislauf, notig Auch hier muß eine geeignete Verkapselung geschaffen werden

Weitere Einsatzgebiete für die Verwendung der erfindungsgemaßen Zelltrager sind Langerhansche Inselzellen des Pankreas, deren Funktion bei Diabetikern eingeschränkt ist Bringt man gesunde Zellen dieses Types auf ein Gerüst von Zelltragern, kann kunstlich Insulin erzeugt werden Die Zelltrager werden mit den Blutkreislauf des Patienten verbunden Wie bei der Verwendung als Organersatz muß das System durch eine äußere Verkapselung geschlossen werden

Die Nachbildung von kunstlichen Gewebe und Gewebeersatz auf erfindungsgemaßen Zelltragern bietet bei der Toxizitatsprufüng entscheidende Vorteile Für die Nachbildung der Haut ist eine Verkapselung nicht notwendig In Nachahmung des anatomischen Vorbildes muß bei der Züchtung von kunstlicher Haut die Blutversorgung zur Lederhaut hin immer mehr abnehmen Technisch kann dies durch immer großer werdende Abstände der Segmente in der Zellkultur erreicht werden Da die kunstliche Vaskularisierung durch diese Bauweise in genau definierten Zellschichten liegen, kann dies auch für Penetrationsversuche genutzt werden Für solche Untersuchungen muß die Versorgung der Elemente in der Zellkultur aber schichtweise vorgenommen werden, so daß nur in der gewünschten Zellschicht Nahrmedium zur Analyse entnommen werden kann Der Einsatz von erfindungsgemaßen Zelltragern bringt insbesondere bei der Schaffung von Krankheitsmodellen Vorteile Hierzu werden die Zellen, die auf zellularer Ebene die charakteristischen Merkmale der Krankheit tragen, in eine Zellkultur gebracht und durch Segmente in einer 3D-Kultur gehalten werden Durch diese Technik bleiben die Zellen langer im "krankhaften" physiologischen Zustand und redifferenzieren nicht wieder so schnell Der Einsatz solcher Modelle liegt primär in der Pharmaindustrie, die an solchen Modellen neue Arzneimittel testen kann Außerdem können solche Modelle entscheidend zum Verständnis einiger Krankheiten beitragen

Claims

Patentansprüche:

1 Zelltragersystem aus porösen Materialien, dadurch gekennzeichnet, daß das Zelltragersystem aus modular geformten Segmenten besteht, die ganz oder teilweise aus Halbschalen aufgebaut sind

2 Zelltragersystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß je zwei modular geformte Segmente durch Kombination der Halbschalen ein

Kapillarsystem bilden

3 Zelltragersystem nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß eine Halbschale eines modular geformten Segments durch Kombination mit einer semipermeablen Membrane ein Kapillarsystem bildet

Zelltragersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die modular geformten Segmente Poren mit einem mittleren Durchmesser von 0,5 bis

5 μm aufweisen

Zelltragersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, daß die modular geformten Segmente Poren mit einem mittleren Abstand von 1 bis 10 μm aufweisen

Zelltragersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, daß die modular geformten Segmente Abstandhalter mit einer Hohe von 20 bis 200 μm aufweisen Zelltragersystem nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Abstandhalter hohl sind und für einen Flussigkeitstransport geeignet sind

Verwendung der Zelltragersysteme gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Kultivierung von eukaryontischen oder organischen Stammzellen

Verwendung der Zelltragersysteme gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 für Bioreaktoren