DE10326750B4 - Verfahren zur Herstellung einer Zellpräparation und derart hergestellte Zellpräparationen - Google Patents
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Abstract
Verfahren
zur Herstellung einer Zellpräparation
dadurch gekennzeichnet, dass eine unfraktionierte Zellmischung eines
Organs oder Gewebes erzeugt wird und vor oder nach Erzeugung der
unfraktionierten Zellmischung die Zellen mit einem vorbestimmten
Reife- und/oder Differenzierungsgrad selektiv und/oder partiell geschädigt werden.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Zellpräparation sowie derart hergestellte Zellpräparationen. Es betrifft weiterhin als eine besondere Form einer derartigen Zellpräparation, deren Verwendung als Zelltransplantat sowie weitere Verwendungen.
- Derartige Zellpräparationen werden benötigt, um extrakorporale Unterstützungssysteme, wie beispielsweise für die Leberunterstützung, aber auch Zellimplantate herzustellen, die in Organe wie beispielsweise die Leber oder an anderen Stellen in einen Organismus eingebracht werden können.
- Herkömmlicherweise werden Kulturen, z.B. Leberzellkulturen erzeugt, indem Leberzellen verwendet werden, die vorzugsweise von adulten Organen stammen.
- Es ist bekannt, dass beispielsweise die Leber eine bemerkenswerte regenerative und proliferative Fähigkeit besitzt. Die Quelle der proliferierenden Leberzellen ist bis heute jedoch noch nicht eindeutig charakterisiert. Insbesondere gibt es keine einheitlichen Kriterien zur Charakterisierung der Organstammzellen, bzw. Progenitorzellen so dass im Stand der Technik verschiedene und teilweise widersprüchliche Marker zur Charakterisierung der Stammzellpopulationen der verschiedenen Organe verwendet bzw. publiziert werden. Hauptbemühen ist dabei immer, durch eine geeignete Markierung der interessierenden Stammzellen, z.B. Leberprogenitorzellen, lediglich diese Stammzellen aus den übrigen Organzellen zu isolieren. Verwendet werden dabei Oberflächenmoleküle, morphologische oder immunhistochemische Marker, die wie oben schon beschrieben, in unterschiedlichster Weise definiert werden, oder auch Größenunterschiede. Auch die heterogene Terminologie, die verwendet wird, um beispielsweise nicht differenzierte Leberzellen, die zur Proliferation und Differenzierung fähig sind, zu kennzeichnen, zeigt, dass die Situation bezüglich der zur Proliferation und Differenzierung fähigen Organstammzellen noch ungeklärt ist. Hier werden beispielsweise Begriffe wie „Hepatozyten-Precursor", „Leberprogenitorzellen", „Leberstammzellen", „Leberreservezellen", „kleine Leberzellen", „Leberparenchymalzellen mit klonaler Wachstumsfähigkeit" oder auch „unausgereifte Hepatozyten" verwendet.
- Vor dem Hintergrund dieser Versuche, Stammzellen aus adultem Gewebe zu gewinnen, stellt sich die vorliegende Erfindung die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung einer Zellpräparation zu schaffen, mit dem proliferations- und differenzierungsfähige Stammzellen aus beliebigen Geweben oder Organen isoliert werden können. Derart hergestellte Zellpräparationen liegen ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenso wie damit hergestellte Zellimplantate und dergleichen.
- Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren nach Anspruch 1, und die Zellpräparation nach Anspruch 50 das Verfahren zur Herstellung eines Organtransplantats gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der jeweiligen Verfahren und Zellpräparationen werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben.
- Die vorliegende Erfindung grenzt sich vom Stand der Technik durch einen vollständig anderen Ansatz zur Gewinnung von Stammzellpräparaten bzw. mit Proliferations- und/oder differenzierungsfähigen Zellen angereicherten Zellpräparaten ab. Der Ansatz der vorliegenden Erfindung besteht darin, grundsätzlich auf eine aufwendige Markierung gewünschter Zellen und anschließende Trennung/Fraktionierung zu verzichten und eine nicht fraktionierte Zellmischung zu verwenden, die sämtliche Zellen enthält, die auch natürlicherweise in einem Ausgangsgewebe, beispielsweise einer Leber, unter dessen physiologischen Bedingungen vorliegen. Daher enthält das Ausgangsmaterial des vorliegenden Verfahrens sämtliche differenzierten und nicht differenzierten Zellen, also auch Zellen fähig zur Proliferation und Differenzierung, die in dem Ausgangsgewebe vorhanden sind, unabhängig von deren Oberflächenmolekülmuster, der Größe, dem morphologischem oder immunhistochemischem Profil, oder dem Genotyp. Entscheidend bei der vorliegenden Erfindung ist nun, dass diese unfraktionierte Zellmischung einer selektiven und/oder partiellen Schädigung ausgesetzt wird, beispielsweise durch Ischämie, Hypoxie, Temperatureinwirkung, chemi sche Noxen oder auch mechanische Einwirkungen und dergleichen. Hier wird nun bewirkt, dass entweder die reifen hochdifferenzierten Zellen selektiv stärker geschädigt werden als die undifferenzierten Zellen und/oder die undifferenzierten Zellen im Vergleich zu ihrer differenzierten Nachkommenschaft eine bessere Erholung von der Schädigung zeigen. Ein Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens ist also grundlegend, dass die höhere Robustheit gegenüber Umwelteinflüssen der undifferenzierten Zellen im Vergleich zu ihrer differenzierten Nachkommenschaft ausgenutzt wird.
- Die Schädigung erfolgt dabei vor oder auch nach der Erzeugung der unfraktionierten Zellmischung. Es kann zusätzlich auch eine Schädigung gleichzeitig mit der unfraktionierten Zellmischung erfolgen. Dies bedeutet, dass die Schädigung beispielsweise bereits im Ausgangsorgan oder Ausgangsgewebe erfolgen kann, nach Auflösung des Zellverbandes oder auch während einem dieser Prozesse.
- Ein weiteres Prinzip der vorliegenden Erfindung ist es, im Anschluss an die Schädigung der unfraktionierten Zellmischung einer anschließend fraktionierten Zellmischung oder auch einer Stammzellkultur Kulturbedingungen anzubieten, die denjenigen in einem gewünschten Gewebe entsprechen. Das gewünschte Gewebe muss nicht dem Ausgangsgewebe oder Ausgangsorgan entsprechen. Es ist beispielsweise auch möglich, eine unfraktionierte Zellmischung aus Lebergewebe wie oben beschrieben zu gewinnen, jedoch darauf abzuzielen, aus den Leberstammzellen, die wie vorstehend beschrieben, selektiv gewonnen wurden, differenzierte Zellen eines anderen Gewebes zu gewinnen. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von Knochenmarkzellen/peripheren Blutstammzellen zur Erzeugung von Leberzellen. Dies kann auch mit einer bereits bestehenden Stammzellkultur erfolgen. Hierzu werden Zellwachstums-, Zellteilungs- und/oder Zelldifferenzierungsbedingungen geboten, die dem gewünschten Zellgewebe entsprechen. Dies erfolgt vorteilhafterweise, indem die Zellmischung oder die Stammzellkultur in Bioreaktoren kultiviert wird, wie sie beispielsweise in der
EP 93 11 40 76.8 EP 0 590 341 A2 ) sowie den mit der vorliegenden Anmeldung von demselben Anmelder zeitgleich eingereichten Anmeldungen mit den Titeln „Bioreaktor aus einem Block" und „Organabguss" von demselben Anmelder beschrieben sind. Die erfindungsgemäßen Verfahren können besonders vorteilhaft in hybriden Kreislaufsystemen durchgeführt werden, die insbesondere in einer Anmeldung mit dem Titel „Hybrides Kreislaufsystem" beschrieben sind, die von demselben Anmelder zeitgleich mit der vorliegenden Anmeldung zum Patent angemeldet wurde. Die Offenbarung dieser Anmeldungen bezüglich der Gestaltung und Konstruktion von Bioreaktoren und hybriden Kreislaufsystemen wird hiermit ausdrücklich in die vorliegende Anmeldung eingeschlossen. - Auf diese Art und Weise wird die Regeneration der Zellen unter Stimulierung der Vermehrung bzw. Differenzierung der so angereicherten Stammzellen in vitro durch die Simulation von natürlichen Regenerationsprozessen bewirkt. Die untergehenden vorgeschädigten differenzierten Zellen sowie die Stammzellen selbst setzen Faktoren frei, die die Zellproliferation bzw. Differenzierung unterstützen. Dies kann auch bewirkt werden durch Zusatz von autologen Nichtparenchymzellen (mesenchymale Zellen) desselben Organs oder eines anderen Organs oder Gewebes desselben Spenders. Hierdurch werden ebenfalls natürliche chemische Signale erzeugt, die die Zellproliferation und Zelldifferenzierung in die spezifischen Zelltypen des jeweiligen Wirtsgewebes unterstützen. Auch homologe oder heterologe Nichtparenchymzellen (mesenchymale Zellen) desselben Organs oder anderer Organe/Gewebe eines anderen Spenders können zugesetzt werden.
- Durch eine derartige organspezifische Mikroumgebung, in der die angereicherten bzw. isolierten Zellen sich befinden, wird bewirkt, dass die angereicherten/isolierten Zellen regenerieren und gezielt in differenzierte Zellen ausdifferenzieren, welche funktionell und strukturell den Zellen anderer Organe oder Gewebe entsprechen. Durch die Auswahl der Kokulturzellen kann dabei das gewünschte Zielorgan bzw. Zielgewebe festgelegt werden. Um die Regeneration bzw. Proliferation und Differenzierung der isolierten Zellen zu fördern, können die Zellen des Zielgewebes ebenfalls gezielt geschädigt werden. Im Ergebnis wird so bewirkt, dass durch das erfindungsgemäße Verfahren auf einfache und wirkungsvolle Weise Stammzellen gewonnen werden können aus adultem oder auch aus fötalem Gewebe, und diese Zellen dann unter zielorgan- bzw. zielgewebespezifischen Bedingungen gehalten, proliferiert und/oder differenziert werden können. Damit ist es erstmals möglich, auf einfache Art und Weise einen Stammzellpool zu erzeugen und differenzierte Zellen spezifischer Zielgewebe bzw. Zielorgane herzustellen, wobei aus der vorliegenden Erfindung menschliche embryonale Stammzellen sowie menschliche Embryonen ausgeschlossen sind.
- Im Anschluss an die Schädigung können jedoch auch diejenigen Zellen mit einem bestimmten Schädigungsgrad abgetrennt werden, dies bedeutet entweder die nicht oder wenig geschädigten Zellen, also vornehmlich undifferenzierte Stammzellen, oder auch die stark geschädigten Zellen.
- Besonders vorteilhaft kann der erfindungsgemäße Ansatz verwendet werden, um ein Zellimplantat herzustellen.
- Die Kultur der Zellpräparation kann dabei vorteilhafterweise in Bioreaktoren erfolgen. Eine besonders effektive Ausgestaltung eines derartigen Bioreaktors ist in der
EP 059 034 A2 - Ein erstes unabhängiges Hohlfasermembransystem dient dabei für den Mediumzufluss. Ein zweites unabhängiges Hohlfasermembran ist für die Versorgung der Mikroorganismen, z.B. mit Sauerstoff bzw. die Entsorgung mit CO2, vorgesehen. Der Mediumabfluss wird durch ein drittes unabhängiges Membransystem sichergestellt.
- Jedes einzelne unabhängige Hohlfasermembransystem besteht dabei aus einer Vielzahl einzelner Hohlfasermembranen, wobei jeweils die Hohlfasern eines Systems mit mindestens einem Einlass bzw. Einlass und einem Auslass kommunizieren. Damit wird sichergestellt, dass die Hohlfasern eines jeweiligen unabhängigen Systems gleichzeitig durch den Einlass z.B. mit Medium versorgt werden können.
- Die unabhängigen Hohlfasermembransysteme bilden nun im Innenbereich des Moduls ein räumlich dicht gepacktes Netzwerk und zwar in der Weise, dass nahezu an jeder Stelle des Netzwerkes wenige Mikroorganismen nahezu identische Bedingungen für die Substratversorgung haben. Dadurch sind die Verhältnisse in physiologischen Organen mit eigenen Arterien und Venen, wie z.B. der Leber, mit der Anordnung von Hepatozyten in Lobuli weitgehend simuliert. Durch die unabhängige Anordnung der verschiedenen Membransystem bietet das Modul den Vorteil eines dezentralen Transportes von z.B. Nährstoffen, Syntheseprodukten und Gasen zu- und von einer Vielzahl von Mikroorganismen unabhängig von ihrer Position im Modul, wie es in der Zellumgebung in natürlichen Organen der Fall ist.
- Der Mediumausfluss wird dabei erfindungsgemäß durch das dritte unabhängige Membransystem gewährleistet. Dieses Membransystem kann nun ebenfalls eine Hohlfasermembrane oder aber auch ein auswechselbare Flachmembran oder eine auswechselbare Kapillarmembran sein. Entscheidend dabei ist, dass auch das dritte Membransystem unabhängig von den beiden anderen Hohlfasermembransystemen ist.
- In einer Ausführungsform wird vorgeschlagen, das dicht gepackte Netzwerk im Innenbereich durch drei unabhängige Hohlfasermembransysteme gebildet. In diesem Fall sind alle unabhängigen Membransysteme Hohlfasermembrane, die im Innenbereich angeordnet sind. Hierbei dient dann ein erstes unabhängiges Hohlfaser membransystem für den Mediumeinfluss, ein zweites für den Mediumausfluss und ein drittes zur zusätzlichen Versorgung z.B. mit Sauerstoff. Das dicht gepackte Netzwerk besteht dann aus diesen drei unabhängigen Systemen.
- Das dicht gepackte Netzwerk kann dabei verschieden aufgebaut sein, solange nur gewährleistet ist, dass jeweils wenige Mikroorganismen im Innenbereich, eine identische Substratversorgung haben. Das räumliche dicht gepackte Netzwerk kann z.B. aus dicht gepackten Schichten bestehen, wobei sich jeweils Schichten von unabhängigen System abwechseln. Eine erste Schicht, die aus einzelnen Hohlfasermembranen besteht, ist dabei horizontal angeordnet. Die zweite Schicht, die jeweils wieder aus einzelnen Hohlfasermembranen besteht, ist dabei ebenfalls in der gleichen Ebene aber gegenüber der ersten Schicht verdreht z.B. in einem Winkel von 90 °C angeordnet. Diese Schichten wechseln sich nun ab und bilden zusammen eine dichte Packung. Das dritte unabhängige Hohlfasermembransystem, das jeweils wiederum aus einzelnen Schichten von Hohlfasermembranen besteht, durchzieht nun diese beiden Schichten z.B. vertikal von oben nach unten und "verwebt" somit die beiden ersten unabhängigen Schichten miteinander.
- Eine weitere Ausführung sieht vor, drei unabhängige Hohlfasermembransysteme in sich abwechselnden Schichten so übereinander zu legen, dass sie alle in einer Ebene liegen, aber jeweils um z.B. 60 °C verdreht angeordnet sind.
- Dieses dicht gepackte Netzwerk ist nun in Innenbereich des Moduls angeordnet. Dadurch, dass jedes unabhängige System mit mindestens einem Einlass bzw. einem Einlass und einen Auslass kommuniziert, ist nun gewährleistet, dass das zuführende Medium an alle Orte im Modul gleichförmig geführt wird, ebenso wie eine gleichförmige Sauerstoffzufuhr erreicht wird. Durch das dritte unabhängige System für den Mediumabfluss kann nun auch kontinuierlich und gleichmäßig das Medium aus dem gesamten Modul, an jeder Stelle, abgeführt werden.
- In einer weiteren Form wird zusätzlich zu den drei Hohlfasermembransystemen im Innenbereich ein weiteres unabhängiges Membransystem für den Mediumabfluss verwendet. Dazu kann am Außengehäuse entweder eine auswechselbare Flachmembran oder eine aus wechselbare Kapillarmembran angebracht werden. Durch diese Ausgestaltung ist sichergestellt, dass ein problemloser Abfluss des Mediums, auch über längere Zeit, erreicht werden kann.
- Eine weitere Ausgestaltung sieht vor, dass das dicht gepackte Netzwerk durch zwei unabhängige Hohlfasermembransysteme gebildet wird, wobei ein erstes für den Mediumzufluss und ein zweites unabhängiges Hohlfasermembransystem für die Sauerstoffversorgung dient, und dass als drittes unabhängiges Membransystem eine auswechselbare Flach- oder Kapillarmembrane, die am Außengehäuse befestigt ist, für den Mediumabfluss dient.
- Das dicht gepackte Netzwerk im Innenbereich, das durch die zwei Hohlfasermembransysteme gebildet wird, ist dabei wieder analog den bisher schon beschriebenen aufgebaut.
- Als Hohlfasermembrane werden bevorzugt Polypropylen, Polyamid, Polysulphon oder Cellulose oder Silikon verwendet. Die Auswahl der Hohlfasermembrane richtet sich dabei nach den Molekülen, die für den Stoffaustausch vorgesehen sind. Es lassen sich aber alle gängigen Hohlfasermembrane, die bereits aus dem Stand der Technik für Stoffaustauschvorrichtungen bekannt sind, anwenden.
- Bei Verwendung von drei unabhängigen Hohlfasermembransystemen, die im Innenbereich ein dicht gepacktes Netzwerk bilden, kann ein Kapillarsystem aus flüssigkeitsimpermeablen Kapillaren, wie z.B. aus Edelstahl oder Glas verwendet werden. Dieses kann dann der Temperierung des Moduls mit seinem Innenraum dienen. Ebenso ermöglicht es ein gleichförmiges Abkühlen des Moduls mit seinem Innenraum und eingebrachten Mikroorganismen unter –20 °C. In einer weiteren Ausgestaltung können aber auch alle weiteren Hohlfasersysteme zur Temperierung bzw. zum Abkühlen bis unter den Gefrierpunkt verwendet werden.
- In einer weiteren Ausgestaltung wird das Außengehäuse durch eine Ausgussmasse gebildet, wobei jeweils immer sichergestellt wird, dass ein Zugang von außen in das Volumen der Kapillaren ermöglicht wird.
- Das Modul weist in einer weiteren Ausgestaltung noch verschiedene Zugänge auf. Ein erster Zugang dient dabei dazu, um die Mikroorganismen in das Modul einzu füllen. Weitere Zugänge dienen zur Druck-, pH- und Temperaturmessung im Innenbereich des Moduls.
- Dieser Bioreaktor zeigt schon in Bezug auf die Substratver- und -entsorgung der Mikroorganismen ausgezeichnete Ergebnisse. Ein weiteres Modul ist aus der taggleich mit dieser Anmeldung eingereichten Anmeldung derselben Erfinder mit dem Titel „Modul zur Züchtung und zur Nutzung der Stoffwechselleistung und/oder zum Erhalt von Mikroorganismen" bekannt. Dieses Modul besteht aus einem Körper, der in einem wasser-/keimdichten Behältnis angeordnet ist, wobei der Körper so ausgebildet ist, dass er Poren aufweist und dass diese Poren miteinander kommunizieren können. Gleichzeitig weist dieser Körper mindestens ein kanalförmiges Hohlgangsystem auf, dessen einzelne Hohlgänge sich kreuzen und/oder überlagern und den Körper durchziehen. Dadurch, dass nun der Körper der in dem Behältnis angeordnet ist selbst aus einem porösen Material besteht, dessen Poren untereinander kommunizieren können, ist auch eine Verbindung der Poren über deren Verbindungen zu den unabhängigen kanalförmigen Hohlgangsystemen gewährleistet. Beim erfindungsgemäßen Modul sind nun die Mikroorganismen, d.h. insbesondere die Zellen in den Poren dieses porösen Körpers fixiert ohne diese voll auszufüllen. Durch die im erfindungsgemäßen Körper angeordneten unabhängigen kanalförmigen Hohlgangsysteme kann nun an jeder Stelle des Körpers eine gleichmäßige Ver- und Entsorgung der in den Poren angeordneten Mikroorganismen, insbesondere der Zellen, mit niedrigen Stoffgradienten erfolgen. Mit diesem Modul wird somit die Versorgung der Zellen ähnlich wie in den natürlichen Organen nachgebildet. Mit diesem Modul steht somit erstmals ein Bioreaktor zur Verfügung, der eine optimale Substratver- und -entsorgung einer ver gleichsweise großen Menge von Mikroorganismen an jeder Stelle des Bioreaktors über längere Zeiträume ermöglicht.
- Ein kanalförmiges Hohlgangsystem ist dabei bevorzugt so ausgebildet, dass es aus in einer Ebene angeordneten parallel zueinander verlaufenden Kanälen besteht. Besonders bevorzugt ist ein kanalförmiges Hohlgangsystem aus mehreren derartigen Ebenen gebildet, die in einem vorbestimmten Abstand übereinander angeordnet sind. Der Abstand der einzelnen Kanäle eines Hohlgangsystems in der Ebene und auch zwischen den einzelnen Ebenen kann im Bereich von 1-5 mm liegen. Der Durchmesser der einzelnen Kanäle ist bevorzugt 0,1-2 mm.
- Der Körper des Moduls kann mindestens zwei derartige Hohlgangsysteme aufweisen, die sich kreuzen und/oder überlagern. Hierdurch wird ein Stoffaustausch über beide Hohlgangsysteme, bzw. zwischen beiden Hohlgangsystemen, im Gegenstromverfahren und somit vergleichsweise hoher Kapazität bei gleichzeitig niedrigen Stoffgradienten möglich.
- Eine bevorzugte Form sieht deshalb vor, dass die Hohlgangsysteme gekreuzt angeordnet sind. Somit durchzieht ein erstes Hohlgangsystem, bevorzugt aus mehreren übereinander angeordneten Ebenen, den Körper in einer Richtung und das zweite Hohlgangsystem in einem Winkel von z.B. 90° von der anderen Richtung her. Wenn nun die Ebenen in dem vorher definierten Abstand übereinander angeordnet sind, wird sichergestellt, dass an nahezu jeder Stelle im Inneren des Körpers auch eine Substratver- und -entsorgung der in den Poren des porösen Körpers angeordneten Mikroorganismen möglich wird. Dieses Modul umfasst hierbei selbstverständlich auch alle weiteren Ausführungsformen mit Bezug auf die geometrische Anordnung der Hohlgangsysteme zueinander, sofern gewährleistet ist, dass an jeder Stelle im Innern des Körpers eine nahezu identische Substratver- und -entsorgung sichergestellt ist. Die beiden Hohlgangsysteme können sich somit im Innern des Körpers in einem vorbestimmten Winkel kreuzen, sie können aber auch übereinander parallel angeordnet sein, wodurch das Gegenstromprinzip optimal ausgenutzt würde.
- Weist das Modul ein drittes unabhängiges Hohlgangsystem auf, ist diese bevorzugt ebenfalls wieder aus parallel angeordneten Hohlgängen, die in einer Ebene liegen, gebildet. Diese Hohlgangsysteme durchziehen nun ebenfalls wieder den Körper, z.B. vertikal von oben nach unten, und verweben somit die beiden ersten unabhängigen Hohlgangsysteme miteinander, wodurch weitere dezentralisierte Funktionen, wie z. B. Oxygenierung integriert werden können. Das Modul umfasst selbstverständlich auch bei dem dritten unabhängigen Hohlgangsystem alle geometrischen Anordnungen, sofern wiederum sichergestellt ist, dass an jeder Stelle im Innern des Körpers eine nahezu identische Ver- und Entsorgung der Mikroorganismen, d.h. der Zellen, gewährleistet ist.
- Analog kann auch ein viertes oder weiteres Hohlgangsystem integriert werden, wodurch wiederum weitere Funktionen, wie z. B. Zelldrainage zur Zellproduktion ermöglicht werden.
- Bei diesem Modul kann das erste unabhängige Hohlgangsystem z.B. für den Mediumzufluss dienen. Das zweite unabhängige Hohlgangsystem ist dann für die Versorgung der Mikroorganismen, z.B. mit Sauerstoff bzw. die Entsorgung mit CO2 zuständig. Dies kann auch erfolgen, indem in dieses Hohlgangsystem mit Gas durchströmbare Oxygenierungsfasern aus Blutoxygenatoren eingefädelt sind. Der Medienabfluss wird dann durch das zweite unabhängige Hohlgangsystem sichergestellt. Alternativ kann das erste und zweite Hohlgangsystem auch im Gegenstromfluss betrieben werden, wodurch eine Perfusion der Zellen durch sich aufbauende Druckgradienten zwischen beiden Systemen erreicht wird.
- Die vorstehend näher beschriebenen kanalförmigen Hohlgangsysteme durchziehen den porösen Körper des beschriebenen Moduls. Die Poren des porösen Körpers des erfindungsgemäßen Moduls sind dabei in ihrer Dimensionierung so gewählt, dass sie die Größe einer kultivierten Zelle überschreiten. Die Poren des porösen Körpers weisen deshalb einen Durchmesser von bevorzugt 100-1000 μm auf. Wesentlich bei diesem Körper ist nun, dass diese Poren untereinander über Porenwandöffnungen in Verbindung stehen, so dass ein optimaler Zu- und Abfluss der Medien entlang vieler Poren erfolgen kann. Die Poren sind dabei untereinander über ca. 50-300 μm große Öffnungen verbunden. Durch diese Ausgestaltung ist es nun gewährleistet, dass die zuzuführenden Medien über die unabhängige Hohlgangsysteme an jede Stelle des porösen Körpers gelangen genauso wie die abzuführenden Medien von jeder Stelle des Hohlkörpers über die Poren und dessen Verbindungen zu den Kanälen des Hohlgangsysteme abgeführt werden. Der poröse Körper kann deshalb auch als Schaum-/Schwammstruktur bezeichnet werden.
- Der im Behältnis angeordnete poröse Körper kann jede beliebige geometrische Form aufweisen. Im wesentlichen kommt es darauf an, dass der poröse Körper ein Volumen besitzt, das geeignet ist um eine für den je weiligen Anwendungsfall genügende Menge an Zellen bzw. Mikroorganismen aufzunehmen. Der poröse Körper besitzt deshalb bevorzugt ein Volumen von 0,5 ml bis 5 l.
- Die geometrische Form kann an und für sich beliebig sein. Bevorzugt ist es jedoch wenn eine Blockform gewählt wird, da somit auch eine einfache Führung der Hohlgangsysteme von einer Seite des Blocks zur anderen und eines zweiten von einer weiteren Seite zu einer nächsten möglich ist. Von den Blockformen sind insbesondere Quader oder andere rechteckige Hohlblockformen bevorzugt. Erst bei mehr als 3 Hohlgangsystemen wird eine komplexere Außenform erforderlich.
- Der poröse Körper in Blockform kann dabei einstückig ausgebildet sein oder aber der poröse Körper in Blockform ist durch einen Verbund von mehreren übereinander liegenden scheibenförmigen Einzelschichten gebildet, die ihrerseits durch das Behältnis gehalten werden.
- In Bezug auf die vorstehend genannte zweite Alternative, die scheibenförmige Ausbildung, ist es vorteilhaft, wenn die scheibenförmigen Einzelschichten in mindestens einer der Flächen von kanalförmigen Vertiefungen durchzogen sind. Diese kanalförmigen Vertiefungen sind auf der Oberfläche angeordnet und so ausgebildet, dass sie durch Verbund mit der nächstliegenden Einzelschicht ein kanalförmiges Hohlgangsystem bilden. Die Vertiefungen sind deshalb als Halbkanäle ausgebildet, so dass durch Verbund mit der nächstliegenden Einzelschicht ein voller Kanal entsteht. Der Vorteil dieser Ausgestaltung besteht darin, dass es verfahrenstechnisch sehr einfach ist in die Einzelscheiben entsprechende Vertiefungen einzu bringen. Die Einzelscheiben können dabei vorteilhafterweise noch in der Art weitergebildet werden, dass sie von der Stirnseite aus gesehen das zweite kanalförmige Hohlgangsystem in Form von durchzogenen Kanälen aufweisen. Somit wird durch Aufbau dieser Einzelschichten und deren Verbund ein poröser Körper realisiert, der bereits zwei unabhängige Hohlgangsysteme besitzt. Das eine Hohlgangsystem wird durch die Vertiefungen in den Einzelschichten in der Fläche gebildet, wohingegen das zweite Hohlgangsystem durch die in der Einzelscheibe bereits eingebrachten kanalförmigen Hohlgänge resultiert.
- Ein dritten Hohlgangsystem kann durch Bohrungen in der verbleibenden Ebene der Scheiben dargestellt werden.
- Der poröse Körper, wie vorstehend beschrieben, ist in einem Behältnis angeordnet. Die Anordnung aus wasser/keimdichten Behältnis und porösem Körper ist so ausgebildet, dass die kanalförmigen Hohlgänge eines Systems in mindestens einem Anström- und Ausströmkörper münden. Dieser Anströmkörper bzw. Ausströmkörper ist so ausgestaltet, dass er durch das Behältnis hindurch geführt ist, so dass eine Ver- und Entsorgung des im Behältnis angeordneten Hohlkörpers von außen sichergestellt ist. Grundsätzlich sind hierfür zwei verschiedene Ausführungsformen möglich. So ist es zum einen möglich, dass der Anström- und Ausströmkörper Bestandteil des Behältnisses selbst ist und durch Anordnung des Körpers in dem Behältnis die Verbindungen realisiert werden und andererseits kann aber auch der Anström- und Ausströmkörper mit dem Körper aus porösem Material verbunden sein. In diesem Fall umschließt dann das wasser-/keimdichte Behältnis diese Anordnung.
- Das Behältnis kann dabei in Form eines Gehäuses oder einer Folie ausgebildet sein. Bevorzugt ist die Ausführungsform des Gehäuses, wobei hier wiederum ganz besonders bevorzugt ein Spritzgussgehäuse verwendet wird. Bei den Materialien für das Spritzgussgehäuse sind alle an und für sich aus dem Stand der Technik bekannten Materialien z. B. aus Polykarbonat möglich. Vorteilhaft beim erfindungsgemäßen Modul ist, dass das Behältnis und die Anschlüsse auch aus einem resorbierbaren bzw. biologisch abbaubaren Material gefertigt werden können.
- Als Material für den porösen Körper, der die vorstehend definierten Dimensionen in Bezug auf die Poren und auf die Verbindung der Poren aufweist, kann an und für sich jedes aus dem Stand der Technik bekannte Material verwendet werden, das zu einer schaum- bzw. schwammartigen Struktur führt. Es kann auch hier, wie vorstehend beim Behältnis erwähnt, ein Material verwendet werden, das biologisch abbaubar ist.
- Bevorzugt besteht das poröse Material aus einem gesinterten Keramikpulver. Besonders bevorzugt ist hierbei die Verwendung von Hydroxylapatit. Hydroxylapatit gehört zur Gruppe der Kalziumphosphate, worunter keramische Werkstoffe mit unterschiedlichen Anteilen von Kalzium und Phosphor verstanden werden. Hydroxylapatit ist eine Verbindung, die sowohl natürlich vorkommt, wie auch synthetisch hergestellt werden kann. Der medizinische Einsatz von Hydroxylapatit als Knochenersatzwerkstoff ist bereits im Stand der Technik bekannt. Die Motivation für den klinischen Einsatz von Hydroxylapatit ist es, einen Werkstoff mit ähnlicher chemischer Zusammensetzung wie die mineralische Phase des Knochenmarkes anzuwenden. Hydro xylapatit kommt als natürliche Komponente im mineralischen Anteil des Knochenmarkes mit 60 – 70 % vor. Hydroxylapatitpulver wird nach dem Stand der Technik entsprechend, beispielsweise über Fällungsmethoden aus einer wässrigen Lösung, beispielsweise durch Zugabe von Ammoniumphosphat in einer Kalziumnitratlösung bei alkalischem PH hergestellt. Zur Verbindung der Pulverteilchen kann bei Temperaturen um 1000 bis 2000 °C eine Sinterung erfolgen, wobei Wintermantel (Wintermantel et al.: Biokompatibler Werkstoff und Bauweise: Implantate für Medizin und Umwelt Berlin/Springer 1998: 256-257) beschreibt, dass für die Herstellung von porösen Festkörpern aus Hydroxylapatit, beispielsweise offenporigen schaumartigen Strukturen, das Hydroxylapatitpulver mit organischen Zusätzen vermischt wird, die anschließend wieder bei hohen Temperaturen ausgebrannt werden.
- Ein weiterer Bioreaktor ist in der ebenfalls zeitgleich zur vorliegenden eingereichten Anmeldung derselben Erfinder mit dem Titel „Bioreaktor in Form einer Organkopie, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung zur Anzucht, zur Differenzierung, zum Erhalt und/oder zur Nutzung von Zellen" beschrieben. In diesem Falle besitzt der Bioreaktor ein Behältnis, in dem ein poröser Körper angeordnet ist, dessen Poren miteinander kommunizieren. Weiterhin sind in diesem Körper mindestens zwei unabhängige kanalförmige Hohlgangsysteme angeordnet, die sich kreuzen und/oder überlagern und den Körper durchziehen. In diesem Falle siedeln Zellen in den Poren des Körpers ab und werden so bezüglich ihrer Position festgelegt.
- Dabei wird ein Bioreaktor in Form einer Organkopie bereitgestellt. Die Hohlstrukturen dieses Bioreaktors erlauben somit die Versorgung einer größeren Zellmasse in hoher Dichte, wobei der Flüssigkeitsaustausch zu/von den Zellen mittels Blutplasma oder Nährmedien dezentralisiert und unter Vermeidung größerer Stoffgradienten erfolgt. Zu den Hohlstrukturen gehören die zuführenden Gefäße (Arterien), die abführende Gefäße (Venen), sowie weitere organtypische Gefäße, wie z.B. bei der Leber die Leberportalvenen oder Lebergallenwegskanäle und die Heringschen Kanäle mit den Leberstammzellen.
- Wesentlich bei diesem Biorektor ist, dass dessen immunologisch inaktiver poröser Körper Poren aufweist, die miteinander kommunizieren können. Die Poren weisen dabei eine Größe auf die größer als die Größe der Zellen des jeweiligen Organs entspricht. Der Porendurchmesser liegt deshalb bei 50-1000 μm. Die Poren sind dabei über Porenwandöffnungen untereinander verbunden. Diese Öffnungen, die bevorzugt kanalförmig ausgebildet sind, sind 50-300 μm groß. Durch diese Ausgestaltung wird somit sichergestellt, dass die Poren über die Porenwandöffnungen untereinander und mit den Hohlstrukturen der Organkopie in Verbindung stehen. Die vorstehend beschriebene Struktur des porösen Körpers kann auch als Schaum-/Schwammstruktur bezeichnet werden.
- Wichtig ist somit, dass der Bioreaktor aus einer immunologisch inaktiven, perfundierbaren Schaum- bzw. Schwammstruktur gebildet ist, wobei innerhalb der Hohlräume die Zellen eingebracht sind und die Poren der Schaumstruktur miteinander kommunizieren. Über die Poren ist damit eine Mediumperfusion, ein Einspulen der Zellen, die Migration von Zellen sowie der Stoffaustausch möglich. Dadurch wird, wie vorstehend beschrieben, ein Bioreaktor realisiert der hinsicht lich seiner Stoffaustauschstrukturen und damit der Leistungen und Eigenschaften gegenüber den bekannten Bioreaktoren des Standes der Technik deutlich verbessert ist.
- Mit diesem Bioreaktor wird somit eine Vorrichtung beschrieben, die die organtypische Reorganisierung von biologischen Zellen erlaubt. Für die Erfindung charakteristisch ist, dass die spezifischen Hohlstrukturen zur Versorgung der Zellen im Körper so dargestellt sind wie die natürliche Situation im Organ es vorgibt.
- Als Materialien die zu Schaum-/Schwammstrukturen im Sinne der vorliegenden Erfindung führen, eignen sich alle bisher im Stand der Technik bekannten Materialien die offenporige Strukturen bilden. Geeignet hierfür sind z. B. Keramiken. Beispielhaft sei hier Hydroxylapatit genannt. Hydroxylapatit ist bereit im Stand der Technik aus der Medizin bestens bekannt und untersucht, so dass er sich hier für diesen Anwendungsfall besonders eignet. Hydroxylapatit liegt in Form eines Pulvers vor und kann gegebenenfalls unter Zusatz von Porenbildner und anderen Additiven zur gewünschten Schaum-/Schwammstruktur aufgeschäumt und anschließend gesintert werden.
- Dieser Bioreaktor ist bevorzugt in einem keim- und flüssigkeitsdichten Behältnis angeordnet. Geeignet hierfür sind Folien oder entsprechend dimensionierte Gehäuse. In diesem Falle sind selbstverständlich Anschlüsse vorgesehen, die mit mindestens einer Hohlstruktur des Organabgusses in Verbindung stehen, um die entsprechenden Ver- und Entsorgungen im Bioreaktor zu gewährleisten. In Bezug auf die Ausgestaltung der Anschlüsse können selbstverständlich mehrere Zu- und/oder Abgänge des Organs am Behältnis zu einem einigen Zu- und/oder Abgang zusammengefasst werden. Derartige Lösungen für Bioreaktoren sind bereits auch aus WO 00/75275 (Mac Donald, USA) und
EP 1 185 612 (Mac Donald, USA) bekannt. - Vorteilhaft bei diesem Bioreaktor ist weiterhin, dass das Behältnis und die Anschlüsse auch aus einem resorbierbaren bzw. biologisch abbaubarem Material gefertigt werden können.
- Die vorstehend beschriebenen drei Anmeldungen werden bezüglich ihres Offenbarungsgehaltes bezüglich der Ausgestaltung der Module bzw. Bioreaktoren vollständig in die vorliegende Anmeldung aufgenommen, da derartige Bioreaktoren auch in der vorliegenden Erfindung als Bioreaktor eingesetzt werden können.
- Verwendungen der erfindungsgemäßen Verfahren und insbesondere der erfindungsgemäßen Zellpräparationen sind in den Patentansprüchen beschrieben, wobei diese keine abschließende Aufzählung darstellen.
- In
1 sind verschiedene Möglichkeiten zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgezeigt. Beginnend mit einem Organ bzw. Gewebe1 wird dessen Zellverband aufgelöst. Dies kann beispielsweise durch enzymatische oder mechanische Auflösung oder eine Kombination derartiger Auflösungsverfahren bewirkt werden. Es wird so eine unfraktionierte Zellmischung2 erhalten, in der anschließend die voll ausdifferenzierten Zellen selektiv und/oder partiell stärker geschädigt werden als die undifferenzierten Zellen. Damit wird eine behandelte Zellmischung3 erhalten, aus der vorteilhafterweise die geschädigten Zellen abgetrennt werden, um zu einer Stammzellfraktion5 zu ge langen. Diese Stammzellfraktion kann dann in eine organspezifische Umgebung8 übertragen werden, beispielsweise mit einer Zellmischung versetzt werden, die aus einem Zielgewebe gewonnen wurde, oder aber in Ko-Kulturen mit einer solchen Zellmischung die über eine Membran direkte Zell-Zell Kontakte vermeidet, aber Mediatorenaustauch erlaubt. - Alternativ kann die unfraktionierte Zellmischung
2 beispielsweise in einem Bioreaktor eingebracht werden und somit eine unfraktionierte Zellmischung6 in organspezifischer Umgebung, z.B. einer spezifischen Reaktorstruktur, bilden. Oder sie kann unmittelbar in eine organspezifische Umgebung verbracht werden, z.B. indem sie mit einer Zellmischung aus einem Zielgewebe versetzt wird. Anschließend können die differenzierten Zellengeschädigt werden, so dass eine behandelte Zellmischung7 in organspezifischer Umgebung entsteht. Die untergehenden Zielzellen werden dabei nun Signale (beispielsweise chemische Signale) abgeben, die zur Proliferation und/oder Differenzierung der weniger oder nicht geschädigten Stammzellen führen. Auch auf diese Weise gelangt man ebenfalls zu einer Stammzellfraktion8 in organspezifischer Umgebung. - Als weitere Alternative kann das Ausgangsorgan bzw. Ausgangsgewebe
1 unmittelbar selektiv geschädigt werden und erst anschließend das so geschädigte Organ bzw. Gewebe4 aufgelöst werden. So erhält man unmittelbar eine behandelte Zellmischung3 . - Eine weitere Alternative besteht darin, auf herkömmliche Art und Weise aus einem Wirtsorgan bzw. Wirtsgewebe
1 mittels herkömmlicher Verfahren nach dem Stand der Technik Stammzellen bzw. eine Stammzelllinie zu gewinnen, beispielsweise Stammzellen aus der Leber. Es kann auch unmittelbar eine embryonale Stammzelllinie12 erzeugt werden. Diese wird dann in eine organspezifische Umgebung gebracht, also beispielsweise mit einer Zellmischung aus einem Zielgewebe oder Zielorgan versetzt und/oder ein einem Bioreaktor mit organtypischer bzw. organspezifischer Struktur verbracht und so wiederum eine Stammzellfraktion8 in organspezifischer Umgebung erzeugt werden. Als organspezifische Umgebung sind also zellbiologische, biochemische, chemische, physikalische und/oder strukturelle Faktoren von Bedeutung. - Ausgehend von der behandelten Zellmischung
3 , der Stammzellfraktion5 , der Stammzellfraktion8 in organspezifischer Umgebung, der behandelten Zellmischung7 in organspezifischer Umgebung oder dem behandelten Organ/Gewebe4 können nun weitere Verfahrensschritte vorteilhafterweise angeschlossen werden. Diese sind in1 mit den Bezugszeichen9 bis11 bezeichnet. Zum einen können diese einzelnen Zellpräparationen gelagert werden, beispielsweise bei 0 bis 6 °C (Kühllagerung) oder –80 °C (Tiefkühllagerung), bevor sie weiter verarbeitet werden (Bezugszeichen10 und11 ). Diese Zellpräparationen können auch unmittelbar ohne Lagerung kultiviert werden, um die darin angereicherten Stammzellen zu regenerieren, zu vermehren, zu differenzieren bzw. lediglich (z.B. als Stammzellpool) zu erhalten. Hierzu können Wirkstoffe zugegeben werden oder auch Matrixproteine. Die Zellpräparationen können in Kokultur mit Nichtparenchymzellen oder auch in Kokultur mit differenzierten Zellen gehalten werden. Dabei ist es möglich, die Zellpräparation und die kokultivierten Zellen in separaten Kompartimenten beispielsweise eines Bioreaktors zu kultivieren, wobei jedoch ein Signaltransport über die Kompartimenttrennung hinweg gewährleistet sein muss. Dies kann beispielsweise durch eine nichtzellgängige jedoch mediatorengängige Membran als Trennung bewirkt werden. - Alternativ können die Zellpräparationen wie oben beschrieben unmittelbar, nach Lagerung oder auch nach weiterer Kultur gemäß Bezugszeichen
10 zur Vaccinherstellung, zur Virusvermehrung, zu Arzneimittelstudien, für die Zelltransplantation, für ein In-vitrotissue-engineering, ein In-vivo-tissue-engineering, für extrakorporale Therapieverfahren und zur Organ/Geweberegeneration mit in der Zellkultur produzierten Wirkstoffen eingesetzt werden. Die Präparationen können also auch zur Herstellung von Wirkstoffen verwendet werden. - Im Folgenden werden Beispiele-gegeben für die Herstellung von Leberstammzellpräparationen durch selektive Schädigung der differenzierten Leberzellen in einer unfraktionierten Zellmischung.
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1 die oben beschriebene Übersicht bezüglich Verfahren zur Herstellung von Stammzellpräparationen und -
2 eine Darstellung von Leberstammzellkulturen. - Prinzip der im Folgenden beschriebenen Methoden zur Leberstammzellgewinnung aus humanem Lebergewebe ist es, zunächst eine Vorschädigung differenzierter Leberzellen durch Langzeit-Sauerstoffausschluss (Hypoxie bzw. Anoxie) zu erzielen. Durch eine anschließende aggressive Proteaseeinwirkung wird sowohl eine Auslösung der Zellen aus dem Gewebeverband, als auch eine weitere Schädigung differenzierter Leberzellen erreicht, die schließlich im Untergang dieser Zellen münden. Aufgrund ihrer größeren Unempfindlichkeit werden in diesem Verfahren die undifferenzierten Leberzellen nicht oder nur gering geschädigt, so dass sie anschließend kultiviert, vermehrt und/oder differenziert werden können. Eine Regeneration kann in den genannten Bioreaktoren erfolgen. Eine selektive Schädigung differenzierter Zellen kann auch durch Temperaturänderungen (Hypothermie, Hyperthermie), chemische Noxen, mechanische Belastung, Ultraschall, pH-Änderung, hypotone Bedingungen, oder andere Schädigungsfaktoren, einzeln oder kombiniert, erfolgen.
- Beispiel 1: Gewinnung von Leberstammzellen aus hu manen Leberteilresektaten
- Zur Gewinnung von Leberstammzellen aus humanen Leberteilresektaten wurde Gewebe aus dem morphologisch intakten Randbereich der Resektate verwendet. Die Gewebestücke (4,7 – 46,4 g) wurden jeweils nach Entnahme unter sterilen Bedingungen in ein Kunststoffgefäß mit 20-100 ml (je nach Größe des Gewebestückes) Williams'Medium E (Williams GM, Weisburger EK, Weisburger JH. Exp Cell Res 1971; 69, 106) mit Zusatz von 10% fetalem Kälberserum (FCS), 15 mmol/l Hydroxyethylpiperazinethansulfonsäure (HEPES), 2 mmol/l L-Glutamin, 100.000 IE/l Penicillin, 100.000 μg/l Streptomycin und 2,5 mg/l Amphotericin B verbracht und bei 4 °C unter Sauerstoffausschluss über einen Zeitraum von 48 bis 72 h inkubiert. Anschließend wurden sie mit Pinzette und Skalpell in Stückchen von 1-2 mm3 zerkleinert. Zur Auflösung des Gewebeverbandes und zur Schädigung differenzierter Leberzellen wurden die Leberstückchen in eine Enzymlösung aufgenommen, welche 0,1 % Kollagenase Typ IV (Clostridiopeptidase A; Kollagenverdauungsaktivität: 478 Einheiten/g, FALGPA-Hydrolyseaktivität: 2,5 Einheiten/g) und 0,1% Pronase E (Aktivität: 4.000.000 PU-Einheiten/g) in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Dulbecco R, Vogt M. J Exp Med 1954; 99: 167) ohne Kalzium- und Magnesiumzusatz enthielt (2 ml Enzymlösung pro g Leber). Die Enzymlösung mit den Gewebestückchen wurde über einen Zeitraum von 60 min bei 37 °C im Wasserbad unter wiederholtem Schwenken inkubiert. Anschließend wurde sie nochmals kurz aufgeschüttelt. Nachdem sich die Gewebereste abgesetzt hatten, wurden die Überstände abgenommen und bei 600 Umdrehungen pro Minute (Upm) über 6 min bei 4 °C zentrifugiert, um die geschädigten Zellen abzutrennen. Die Zellpellets, welche die weniger empfindlichen Zellen enthielten, wurden in eine hypotone Lösung, bestehend aus 10 mmol/l KHCO3, 155 mmol/l NH4CL, 0,13 mmol/l Ethylendiethyltetraacetat (EDTA) in Aqua dest., pH 7,5, aufgenommen (1 ml pro g Leber) und in der Lösung über 5 min bei 4 °C inkubiert, um die in der Suspension enthaltenen Erythrozyten zu zerstören. Anschließend wurden die Suspensionen nochmals bei 600 Upm über 6 min bei 4 °C zentrifugiert, um die geschädigten Erythrozyten abzutrennen. Die Zellpellets wurden zuletzt in Kulturmedium aufgenommen (0,5 ml pro g Leber). Als Kulturmedium wurde Williams'Medium E mit Zusatz von 5% fetalem Kälberserum (FCS), 2 mmol/l L-Glutamin, 5 mg/l Humaninsulin (Aktivität: 29 Internationale Einheiten/mg), 0,8 mg/l Transferrin (porcin), 3μg/l Glucagon (porcin), 100.000 IE/l Penicillin, 100.000 μg/l Streptomycin und 2,5 mg/l Amphotericin B verwendet. Die gewonnenen Zellpräparationen wurden in Kulturgefäße ausgesät (0, 1 ml/cm2 Kulturfläche) , welche zuvor für 30 min mit einer Kollagenlösung, bestehend aus 0,05 % Kollagen aus Rinderplazenta in PBS, behandelt worden waren. Die Kulturen wurden bei einer Temperatur von 37 °C, einem CO2-Gehalt von 5% in Raumluft und einer Luftfeuchtigkeit von 95% gehalten. Nach 24 h wurde das Kulturmedium durch frisches Medium (0,2 ml/cm2 Kulturfläche) ersetzt. Während der anschließenden Kulturphase wurde alle 3 Tage das Kulturmedium erneuert. Nach einem bis sieben Tagen wurden lichtmikroskopisch einzelne Zellen sowie zusammenhängende, runde bis ovale Zellverbände aus drei bis zu etwa 30 Stammzellen al beobachtet, welche im Weiteren als Kolonien bezeichnet werden (
2a ). Je nach Ausgangsbeschaffenheit und -größe des Gewebestückes wurden bis zu 50 solcher Kolonien aus einem Resektat gewonnen. Die Zellen in den Kolonien waren überwiegend von runder bis ovaler Form, mit einem Durchmesser von durchschnittlich 15 μm; die Zellkerne füllten durchschnittlich etwa 30% der Gesamtzellfläche aus. Im weiteren Kulturverlauf wurden insbesondere in den Randbereichen der Kolonien abweichende Zelltypen b2, c2 sichtbar (2b ,2c ). Diese zeigten eine polygonale Form mit zum Teil langen Zytoplasmaausläufern. Der Durchmesser dieser Zellen betrug durchschnittlich 40 μm; die Zellkerne füllten durchschnittlich etwa 10% der Gesamtzellfläche aus. Zahlreiche Übergangsformen wurden ebenfalls beobachtet. Im Kulturverlauf nahm der Anteil der größeren, polygonalen Zellen b2, c2 deutlich zu, während derjenige der kleineren, ovalen Zellen zurückging. Zur Identifizierung der Zellen und zur Beurteilung ihres Differenzierungsgrades wurde die Expression von spezifischen Markern für Leberstammzellen/Lebervorläuferzellen (CD34, c-kit, Alpha-Fetoprotein [AFP]) bzw. für differenzierte Hepatozyten (Albumin, Cytokeratin [CK] 18) und Gallenepithelzellen (CK 7, CK 19) in den Kulturen mittels indirekter Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Untersuchungen zeigten, dass die kleineren, ovalen Zellen b1, c1 nicht bzw. unvollständig differenzierte Zellen (CD34-, c-kit-, AFP-positiv) darstellten, während die in den Randbereichen vorkommenden größeren, polygonalen Zellen b2, c2 differenzierte Hepatozyten (Albumin, Cytokeratin [CK] 18) repräsentierten. Einige der gering differenzierten Zellen b1, c1, sowie die im Übergangsbereich zwischen differenzierten b2, c2 und undifferenzierten Zellen b1, b2 lokalisierten Zellen wiesen zusätzlich Marker für Gallenepithelzellen (CK 7, CK 19) auf. Zur näheren Charakterisierung des Zellverhaltens in vitro wurden die Kulturen mittels Videozeitrafferinikroskopie über einen Zeitraum von 24-96 Stunden beobachtet. Anhand der Videosequenzen wurden regelmäßig Zellteilungen in den Kolonien nachgewiesen. C3 bezeichnet in2c derartige, in Zellteilung befindliche Zellen, kenntlich an ihrem großen kernlosen Zellleib, welcher die bereits aufgeteilten Chromosomen enthält. Durch den immunfluoreszenzmikroskopischen Nachweis des Proliferationsmarkers Ki-67 in den Kulturen wurden die beobachteteten Mitoseaktivitäten bestätigt. Die Videoaufnahmen zeigten weiterhin, dass die anhand morphologischer und immunfluoreszenzmikroskopischer Kriterien als differenziert bezeichneten Zellen aus den als undifferenziert charakterisierten Zellen hervorgingen. - Im Folgenden werden Verfahrensschritte beschrieben, die auch für die weiteren Beispiele gelten. Die Proliferation und das Differenzierungsverhalten der Zellen wurden durch Variation des verwendeten FCS-Gehaltes (0-20%) beeinflusst, sowie durch den Zusatz von Hühnerembryoextrakt, Pferdeserum, Wachstumsfaktoren, z.B. hepatocyte growth factor (HGF), transforming growth factor (TGF), insulin-like growth factor II (IGF 11), epidermal growth factor (EGF), stem cellfactor (SCF) keratinocyte growth factor (KGF) und fibroblast growth factor (FGF), welche einzeln oder in Kombination zugesetzt wurden.
- Alternativ zu Kollagen wurden auch folgende extrazelluläre Matrixkomponenten zur Beschichtung der Kulturgefäße eingesetzt: Kollagen, Fibronektin, Laminin, Matrigel, Heparansulfat. Kokulturen, bestehend aus Leberstammzellen in Kombination mit autologen (vom selben Spender) oder homologen (von anderen Spendern) nichtparenchymalen Leberzellen, wurden wie folgt angelegt: Nichtparenchymale Leberzellen wurden nach etablierten Verfahren isoliert. Die Zellen wurden entweder unbehandelt eingesetzt oder vorher nach einem Standardverfahren bestrahlt, um die Vermehrung der Nichtparenchymzellen zu hemmen. In einem der Ansätze wurden Endothelzellen, Kupfferzellen und/oder Itozellen gemeinsam als Zellmischung eingesetzt. In weiteren Ansätzen wurde jeweils nur ein einzelner Zelltyp eingesetzt. Die gewonnenen Zellpräparationen wurden in unbeschichtete oder mit extrazellulären Matrixkomponenten beschichtete Kulturgefäße ausgesät und unter Standardbedingungen (s. oben) gehalten. Nachdem die nichtparenchymalen Zellen angehaftet und abgeflacht waren, wurden Stammzellpräparationen auf die Zellen aufgebracht. Anschließend wurden die Kulturen wie oben beschrieben behandelt. Kokulturen, bestehend aus Leberstammzellen in Kombination mit autologen oder homologen differenzierten parenchymalen Leberzellen, wurden wie folgt angelegt: Differenzierte parenchymale Leberzellen wurden nach etablierten Verfahren isoliert. In einem der Ansätze wurden die differenzierten Zellen mit Stammzellpräparationen gemischt und in mit extrazellulären Matrixkomponenten beschichtete Kulturgefäße ausgesät. In einem anderen Ansatz wurden zunächst die differenzierten Zellen ausgesät. Nachdem die Zellen angehaftet und abgeflacht waren, wurden die Stammzellpräparationen auf die Zellen aufgebracht (0,1 ml/cm2 Kulturfläche). Anschließend wurden die Kulturen wie oben beschrieben behandelt. Kokulturen, bestehend aus Leberstammzellen in Kombination mit parenchymalen Leberzellen sowie nichtparenchymalen Leberzellen, wurden wie folgt angelegt: Zunächst wurden die nichtparenchymalen Leberzellen in unbeschichtete oder mit extrazellulären Matrixkomponenten beschichtete Kulturgefäße ausgesät. Anschließend wurden die differenzierten Zellen mit Stammzellpräparationen gemischt und zu den Nichtparenchymalzellkulturen gegeben. In einem weiteren Ansatz wurden die einzelnen Zellfraktionen nacheinander aufgebracht.
- Beispiel 2: Gewinnung von Leberstammzellen aus Rattenlebern
- Zur Gewinnung von Leberstammzellen aus Rattenlebern wurden Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 180-220 g verwendet. Die Leber wurde unter Narkose der Ratte freigelegt und in situ über die Pfortader unter Eröffnung der kranialen Hohlvene mit 20 ml PBS innerhalb von drei Minuten von Blut frei gespült. Anschließend wurde die Leber entnommen und das Verfahren zur Zellgewinnung wie unter Beispiel 1 beschrieben fortgeführt. Aufgrund des geringeren Bindegewebegehaltes der Rattenlebern wurden die verwendeten Kollagenase- und Pronasekonzentrationen auf jeweils 0,05 und die Inkubationszeit auf 30 min reduziert. Bei Verringerung der verwendeten Kollagenase- und Pronasekonzentrationen auf jeweils 0,025% und Verkürzung der Inkubationszeit auf 15 min blieben die nichtparenchymalen Leberzellen zum Teil erhalten. Dieses Verfahren kann zum Anlegen von Kokulturen, bestehend aus Leberstammzellen in Kombination mit autologen nichtparenchymalen Leberzellen genutzt werden.
- Beispiel 3: Gewinnung von Leberstammzellen aus humanen Ganzorganen
- Zur Gewinnung von Leberstammzellen aus humanen Ganzorganen wurden für die Transplantation vorgesehene Spenderorgane verwandt, welche aufgrund einer Schädigung, z.B. aufgrund einer Leberzirrhose, Verfettung oder traumatischen Einwirkung, nicht transplantiert werden konnten. Alternativ können auch die entnommenen, verworfenen Organe von Transplantatempfängern verwendet werden. Um den Anforderungen der größeren Gewebemasse ganzer humaner Lebern (durchschnittlich 1,5 kg) gerecht zu werden, wurde die Methode entsprechend adaptiert.
- Ansatz 1:
- Die Leber wurde zunächst mit einer Standard-Konservierungslösung (University of Wisconsin [UW]-Lösung) von Blut frei gespült, und anschließend über 48 bis 72 h bei 4 °C unter Sauerstoffausschluss aufbewahrt. Anschließend wurde die Konservierungslösung mit 3 l einer auf 37 °C temperierten PBS-Lösung ohne Kalzium- und Magnesiumzusatz, enthaltend 2 mmol/l ED-TA ausgespült. Im nächsten Schritt wurde die Leber zur Auflösung des Gewebeverbandes und zur Schädigung differenzierter Leberzellen zunächst mit 2 l einer ebenfalls auf 37 °C vorgewärmten Enzymlösung, enthaltend 0,025% Kollagenase Typ IV (Aktivitäten: s. Beispiel 1) in PBS ohne Kalzium- und Magnesiumzusatz rezirkulierend über 20-30 min, je nach Ausgangsbeschaffenheit des Gewebes, perfundiert. Sobald das Organ Anzeichen einer Auflösung des Gewebeverbandes zeigte, wurde die Perfusion über weitere 20-30 min mit 2 l einer Enzymlösung, enthaltend 0,1 % Kollagenase und 0,1 % Pronase E (Aktivität: s. Beispiel 1) in PBS ohne Kalzium- und Magnesiumzusatz fortgeführt. Im Falle eines vorzeitigen Gewebszerfalls wurde die Perfusion abgebrochen, und das Gewebe mit der Kollagenase-Pronase-Lösung über den gleichen Zeitraum bei 37 °C inkubiert. Nach dem Verdau wurde das Verfahren zur Zellgewinnung wie unter Beispiel 1 beschrieben fortgeführt. Bei Verkürzung der verwendeten Kollagenase- und Pronasekonzentrationen bzw. der Inkubationszeit bleiben außer den Leberstammzellen auch die nichtparenchymalen Leberzellen, wie Endothelzellen, Kupfferzellen oder Itozellen zum Teil erhalten. Dieses Verfahren kann daher zum Anlegen von Kokulturen, bestehend aus Leberstammzellen in Kombination mit autologen nichtparenchymalen Leberzellen genutzt werden.
- Ansatz 2:
- In einem alternativen Verfahren wurde die Leber maximal über 24 h bei 4 °C unter Sauerstoffausschluss mit einer Standard-Konservierungslösung (University of Wisconsin [UW]-Lösung) konserviert. Anschließend wurde die Leber nach einem etablierten Mehrschritt-Perfusionsverfahren mittels Kollagenaseeinwirkung verdaut. Die gewonnene unfraktionierte Zellmischung, welche sowohl die differenzierten parenchymalen und nichtparenchymalen Leberzellen, wie beispielsweise Endothelzellen, Kupfferzellen, Itozellen, als auch die in der Leber situierten Stammzellen enthielt, wurde nochmals über 24-48 h bei 4 °C unter Sauerstoffausschluss aufbewahrt. Anschließend wurde die Suspension bei 600 Upm über 6 min bei 4 °C zentrifugiert. Die Zellpellets wurden in PBS aufgenommen und nochmals bei 600 Upm über 4 min bei 4 °C zentrifugiert. Zuletzt wurden die Zellen in Kulturmedium aufgenommen und ausgesät, wie unter Beispiel 1 beschrieben. Das Verfahren ermöglicht es, aus demselben Organ zusätzlich auch differenzierte parenchymale und nichtparenchymale Leberzellen zu gewinnen. Dies kann zum Anlegen von Kokulturen, bestehend aus Leberstammzellen in Kombination mit autologen differenzierten Hepatozyten und/oder mit autologen nichtparenchymalen Leberzellen genutzt werden. Hierzu ist es notwendig, einen Teil der unfraktionierten Zellmischung für die Isolierung der gewünschten Zelltypen zu verwenden.
- Ansatz 3:
- Prinzip des Ansatzes ist es, den Isolierungsprozess zu nutzen, um gleichzeitig die Vermehrung bzw. Differenzierung von Stammzellen in vitro durch die Simulation von natürlichen Regenerationsprozessen zu stimulieren. Dies wird ermöglicht durch die Generierung einer die Stammzellproliferation unterstützenden Umgebung, welche aus partiell geschädigten, differenzierten, parenchymalen und nichtparenchymalen Leberzellen und Bindegewebsfragmenten besteht. Signale der untergehenden differenzierten Zellen nach gezielter Schädigung sowie Faktoren, die von den Stammzellen selbst freigesetzt werden, werden genutzt, um die Vermehrung der Stammzellen sowie deren Differenzierung in spezifische Leberzelltypen anzuregen. In dem Ansatz wurde die Leber, wie unter Ansatz 2 beschrieben, nach einem etablierten Mehrschritt-Perfusionsverfahren mittels Kollagenaseeinwirkung verdaut. Die gewonnene unfraktionierte Zellmischung, welche sowohl die differenzierten parenchymalen und nichtparenchymalen Leberzellen, wie beispielsweise Endothelzellen, Kupfferzellen, Itozellen, als auch die in der Leber situierten Stammzellen enthielt, wurde entweder ohne weitere Behandlung zur Kultur eingesetzt, oder aber zur Abtrennung von Zellfragmenten und Verunreinigungen, zunächst gewaschen. Dazu wurde die Zellmischung bei 600 Upm über 6 min bei 4 °C zentrifugiert. Die Zellpellets wurden in Kulturmedium aufgenommen und nochmals bei 600 Upin über 6 min bei 4 °C zentrifu giert. Zuletzt wurden 500 ml der Zellpellets mit 500 ml Kulturmedium versetzt. Die Zellpräparation wurde in einen perfundierbaren 3-D-Hochdichtekultur-Bioreaktor mit integraler Oxygenierung und dezentralem Sauerstoffaustausch eingefüllt.
- Die eingefüllte Zellmischung enthielt sowohl die in der Leber enthaltenen Stammzellen als auch differenzierte parenchymale und nichtparenchymale Leberzellen, wie beispielsweise Endothelzellen, Kupfferzellen, Itozellen. Der Anteil von Stammzellen und nichtparenchymalen Zellen war bei Verwendung zentrifugierter Zellfraktionen geringer als in der unfraktionierten Zellmischung. In letzterer entsprach das Verhältnis der einzelnen Leberzelltypen zueinander demjenigen in der Leber in vivo. Die Kulturen wurden zunächst über einen Zeitraum von 24-96 h unter hypoxischen Bedingungen perfundiert, um eine partielle Schädigung der differenzierten parenchymalen bzw. nichtparenchymalen Leberzellen zu erreichen. Alternativ kann eine selektive Schädigung der differenzierten Zellen auch durch Temperaturänderungen (Hypothermie, Hyperthermie), chemische Noxen, mechanische Belastung, Ultraschall, pH-Änderung, hypotone Bedingungen, oder andere Schädigungsfaktoren, einzeln oder kombiniert, erfolgen. Die Zellkomposition, Gewebsorganisation und Ultrastruktur der Leberzellen nach dreitägiger bis fünfwöchiger Kultur in 3-D-Bioreaktoren wurde immunhistochemisch und elektronenmikroskopisch charakterisiert. Nach drei- bis zehntägiger Kultur waren weiträumige Areale mit untergegangenen Zellen sichtbar. In diesen Bereichen wurden regelmäßig CD34- und c-kit-positive Zellen beobachtet, die morphologische Eigenschaften (Größe, Kern-Zytoplasma-Verhältnis) der unter Beispiel 1 beschriebenen Leberstammzellen aufwiesen. Daneben waren auch Inseln mit Hepatozyten (albumin-positiv) und Endothelzellen (CD 31-positiv) ausgebildet, welche teilweise zu in vivo-ähnlichen Zellverbänden angeordnet waren. Es fanden sich sinusoidähnliche, anastomosierende Hohlräume, welche mit Endothelzellen und weiteren Nichtparenchymzellen (Kupfferzellen, Itozellen, Pitzellen) ausgekleidet waren. Daneben waren auch einige gallengangsähnliche Strukturen (CK 19-positiv) ausgebildet. Endothelzellen und Gallenepithelzellen zeigten Proliferationsaktivitäten (Ki-67). Nach zwei- bis fünfwöchiger Kultur waren die Areale mit untergegangenen Zellen überwiegend durch parenchym-ähnliches Gewebe mit zahlreichen, verzweigten gallengangsähnlichen Strukturen (CK 19-positiv) ersetzt. CD-34- und c-kit-positive Zellen waren nur mehr vereinzelt zu finden.
- Eine Beeinflussung der Proliferation/Differenzierung der Zellen konnte durch Variation des verwendeten Serumgehaltes, die Zugabe von Wachstumsfaktoren, extrazellulären Matrixkomponenten, sowie allen im Beispiel 1 genannten Substanzen und Faktoren, erreicht werden.
- Beispiel 4: Kokultur von Leberzellen mit autologen Knochenmarkszellen.
- Theise et al. (Hepatology 2000, Bd. 31(1), 5.235-240) weist auf die Herkunft von Lebervorläuferzellen aus zirkulierenden multipotenten Stammzellen hin, welche im Knochenmark produziert werden. Prinzip des Verfahrens ist es, den Knochenmarkstammzellen eine leberspezifische Umgebung zu bieten, um eine Differenzierung der Zellen in Richtung Leberzellen zu induzieren.
- Humane Knochenmarkstammzellen wurden aus dem Brust bein oder aus Wirbelkörperaspiraten von Organspendern gewonnen, deren Leber aufgrund einer Schädigung, z.B. Leberzirrhose, Verfettung oder traumatische Einwirkung, nicht zur Transplantation geeignet war. Die Aspirate wurden mit 1% Heparin und 10% Terasaki-Park-Medium versetzt. Mononukleäre Zellen wurden durch Dichtgradientenzentrifugation mittels Ficoll-Trennlösung (Dichte 1,077) gewonnen, gefolgt von zweimaliger Zentrifugation in Hanks balanced salt solution (HBSS) zum Waschen der Zellen. Anschließend wurden die Zellen in Terasaki Park Medium mit 0,5% FCS aufgenommen. Die Zellen wurden zur morphologischen Charakterisierung mit einer Zytozentrifuge auf Objektträger aufgebracht, und nach Pappenheim gefärbt. Die Klonogenität der mononukleären Zellen wurde mit Hilfe klonogener Assays getestet (MethoCUItTm GF H4434, StemCell Technologies). Die mononukleären Zellen wurden mit autologen Leberzellen, welche nach einem der unter Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gewonnen wurden, im Verhältnis 1:10 bis 1:100 gemischt und in basales ISCOVE-Medium aufgenommen, welches 20% durch Hitze inaktiviertes FCS, 1 mmol/l Natriumpyruvat, 2 mmol/l L-Glutamin, 100.000 IE/l Penicillin, 100.000 μg/l Streptomycin und 2,5 mg/l Amphotericin B enthielt.
- Ansatz 1:
- Die Zellpräparationen wurden in Kulturgefäße ausgesät (0,1 ml/cm2 Kulturfläche), welche zuvor für 30 min mit einer Kollagenlösung, bestehend aus 0,05 % Kollagen aus Rinderplazenta in PBS, behandelt worden war. Zur Identifizierung der Zellen und zur Beurteilung ihres Differenzierungsgrades wurde die Expression von spezifischen, gemeinsamen Markern für Knochenmarkstammzellen und Leberstammzellen (CD34, Thy-1) sowie Lebervorläuferzellen (AFP) bzw. differenzierte Hepa tozyten (Albumin, CK 18) und Gallenepithelzellen (CK 7, CK 19) in den Kulturen mittels indirekter Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Es wurden sowohl Zellen/Kolonien, die nur CD34- und Thy-1 -positiv waren, als auch Kolonien, die zusätzlich AFP sowie CK 18 und CK 19 exprimierten, und solche, die Marker für differenzierte Leberzellen aufwiesen, beobachtet. Im Vergleich zu den beschriebenen Leberzell-Monokulturen war die Zahl der resultierenden Kolonien mit undifferenzierten Leberzellen, deutlich höher.
- Ansatz 2:
- Die Knochenmarkstammzellen wurden mit autologen Leberzellen in Bioreaktoren kokultiviert (siehe auch Beisp. 2, Ansatz 3). Dazu wurden die Knochenmarkstammzellen mit Leberstammzellpräparationen bzw. mit der unfraktionierten Leberzellmischung im Verhältnis 1:10 bis 1:100 gemischt und in Bioreaktoren gefüllt. In einem weiteren Ansatz wurden zunächst Leberzellen eingefüllt und erst nach der Reorganisation der Leberzellen im Bioreaktor wurden Knochenmarkstammzellen zu den Kulturen gegeben. Einige Bioreaktorkulturen wurden zunächst über einen Zeitraum von 24-96 h unter hypoxischen Bedingungen perfundiert, um eine partielle Schädigung der differenzierten parenchymalen bzw. nichtparenchymalen Leberzellen zu erreichen. Die Zellkomposition, Gewebsorganisation und Ultrastruktur der Zellen nach dreitägiger bis fünfwöchiger Kultur in 3-D-Bioreaktoren wurde immunhistochemisch und elektronenmikroskopisch charakterisiert. Nach drei- bis zehntägiger Kultur wurden zahlreiche Inseln aus Knochenmarkstammzellen (CD34-positiv), umgeben von parenchymalen und nichtparenchymalen Leberzellen beobachtet. In einigen Inseln wurden zusätzlich Lebervorläuferzellen (CD34- und AFP-positiv) beobachtet, die morphologische Eigenschaften (Größe, Kern- Zytoplasma-Verhältnis) der unter Beispiel 1 beschriebenen Leberstammzellen aufwiesen. Daneben waren auch Inseln mit Hepatozyten (albumin-positiv) und Endothelzellen (CD31 -positiv) ausgebildet, welche zu in vivo-ähnlichen Zellverbänden angeordnet waren, wie unter Beispiel 3, Ansatz 3 beschrieben. Nach zwei- bis fünfwöchiger Kultur enthielten die Bioreaktoren überwiegend parenchymähnliches Gewebe. Knochenmarkstammzellen waren nur mehr vereinzelt zu finden.
- In weiteren Ansätzen wurden die Knochenmarkstammzellen mit autologen Knochenmarkstromazellen und/oder nichtparenchymalen Leberzellen (siehe Beispiel 1 kokultiviert. Eine Beeinflussung der Proliferation/Differenzierung der Zellen konnte auch durch Variation des verwendeten Serumgehaltes, die Zugabe von Wachstumsfaktoren, extrazelluläre Matrix-Komponenten, sowie alle im Beispiel 1 genannter Substanzen und Faktoren, erreicht werden.
Claims (78)
- Verfahren zur Herstellung einer Zellpräparation dadurch gekennzeichnet, dass eine unfraktionierte Zellmischung eines Organs oder Gewebes erzeugt wird und vor oder nach Erzeugung der unfraktionierten Zellmischung die Zellen mit einem vorbestimmten Reife- und/oder Differenzierungsgrad selektiv und/oder partiell geschädigt werden.
- Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit einem vorbestimmten Reife- und Differenzierungsgrad zusätzlich gleichzeitig mit der Erzeugung der unfraktionierten Zellmischung geschädigt werden.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass aus der Zellpräparation Zellen mit einem vorbestimmten Schädigungsgrad und/oder mit einem vorbestimmten Reife- und/oder Differenzierungsgrad abgetrennt werden.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass anschließend die Zellpräparation unter Kulturbedingungen zur weiteren Vermehrung, zur Differenzierung und/oder zum Erhalt gehalten wird.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor, gleichzeitig oder anschließend an die selektive und/oder partielle Schädigung die Zellen in Kokultur mit weiteren differenzierten Zellen des gleichen und/oder eines anderen bestimmten Organ- und/oder Gewebetyps eines Organs und/oder Gewebes desselben und/oder eines anderen Organismus genommen werden.
- Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die weiteren differenzierten Zellen vor und/oder nach der Herstellung der Kokultur selektiv und/oder partiell geschädigt werden.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die unfraktionierte Zellmischung von den weiteren differenzierten Zellen durch eine für Zellen undurchlässige Barriere getrennt gehalten werden.
- Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass eine für Wirkstoffe, Mediatoren und/oder Stoffwechselprodukte von Zellen permeable oder semipermeable Barriere verwendet wird.
- Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Barriere eine für Zellen nicht durchgängige Membran, insbesondere Hohlfaser oder Flachmembran, verwendet wird.
- Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass eine Membran ver wendet wird, die Poren aufweist, über die Zell-Zell-Kontakte möglich sind.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass anschließend an die selektive und/oder partielle Schädigung der Zellen Nichtparenchymzellen und/oder mesenchymale Zellen desselben und/oder eines anderen Organ- und/oder Gewebetyps desselben und/oder eines anderen Organismus zugegeben werden.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Zellpräparation Biomatrixproteine, insbesondere Collagen, zugegeben werden.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor, gleichzeitig mit und/oder nach der selektiven und/oder partiellen Schädigung die Zellpräparation in einer organ- und/oder gewebespezifischen Umgebung kultiviert wird.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellpräparation in einem Modul kultiviert wird, bestehend aus einem Außengehäuse, mindestens drei unabhängigen Membransystemen, wobei mindestens zwei unabhängige Membransysteme als Hohlfasermembrane ausgebildet und im Innenbereich des Moduls angeordnet sind, und dass diese Hohlfasermembrane ein dicht gepacktes räumliches Netzwerk bilden und Zellen, die sich in den Hohlräumen des Netzwerkes befinden und/oder an den Hohlfasermembra nen adhäriert sind, wobei das Netzwerk aus sich kreuzenden und/oder überlagernden Hohlfasermembranen besteht und so aufgebaut ist, dass die Zellen an jeder Stelle im Innenbereich des Moduls nahezu gleiche Bedingungen der Substratversorgung und -entsorgung haben.
- Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das dicht gepackte Netzwerk im Innenbereich durch drei unabhängige Hohlfasermembransysteme gebildet wird.
- Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich am Außengehäuse eine auswechselbare Flachmembrane oder Kapillarmembrane angeordnet ist.
- Verfahren nach Anspruch 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das dicht gepackte Netzwerk zusätzlich ein weiteres flüssigkeitsimpermeables unabhängiges Kapillarsystem aufweist.
- Verfahren nach Anspruch 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Außengehäuse durch eine Ausgussmasse gebildet wird, wobei ein Zugang von außen in das Lumen der Kapillaren oder Hohlfasermembranen ermöglicht ist.
- Verfahren nach Anspruch 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass für den Ein- und/oder Auslass, in das Lumen der Kapillaren oder Hohlfasermembranen entsprechende Ein- und/oder Auslassköpfe vorgesehen sind, die mit den jeweiligen unabhängigen Kapillarsystemen kommunizieren.
- Verfahren nach Anspruch 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass im Außengehäuse des Moduls ein oder mehrere Zugänge vorgesehen sind, die in den Innenbereich führen, um Mikroorganismen in das Modul einzufüllen und/oder Druck, Temperatur und/oder pH-Messungen durchzuführen.
- Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Zugänge sich als perforierte Röhren in das Modul hinein fortsetzen, wodurch eine gleichmäßige Verteilung der Mikroorganismen in den Innenbereich ermöglicht wird.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellpräparation in einem Modul kultiviert wird, bestehend aus einem in einem wasser-/keimdichten Behältnis angeordneten Körper aus einem porösen Material, dessen Poren miteinander kommunizieren, und mindestens einem kanalförmigen Hohlgangsystem dessen einzelne Hohlgänge sich kreuzen und/oder überlagern und den Körper durchziehen.
- Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens zwei unabhängige kanalförmige Hohlgangsysteme aufweist.
- Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass ein kanalförmiges Hohlgangsystem aus mindestens in einer Ebene angeordneten parallel verlaufenden einzelnen Kanälen besteht.
- Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass ein Hohlgangsystem aus mehreren übereinander angeordneten Ebenen die jeweils aus pa rallel angeordneten einzelnen Kanälen bestehen, gebildet ist.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass drei unabhängige kanalförmige Hohlgangsysteme vorhanden sind.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass vier unabhängige Hohlgangsysteme vorhanden sind.
- Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser eines einzelnen Kanals des kanalförmigen Hohlgangsystems 0,1-2 mm beträgt.
- Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand der einzelnen in einer Ebene angeordneten parallel zueinander verlaufenden Kanäle eines Hohlgangsystems in der Ebene und/oder zwischen einer Ebene 1-5 mm aufweisen.
- Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Poren des Körpers einen Durchmesser von 100-1000 μm aufweisen.
- Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Poren untereinander über 50-300 μm große Hohlräume miteinander verbunden sind.
- Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass der Körper ein Verbund von mehreren übereinander liegenden scheibenförmigen Einzelschichten ist, der durch das Behältnis gehalten wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die scheibenförmigen Einzelschichten in mindestens einer Fläche von kanalförmigen Vertiefungen durchzogen sind, die so angeordnet und dimensioniert sind, dass durch Verbund mit der nächstliegenden Einzelschicht ein kanalförmiges Hohlgangsystem entsteht.
- Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, dass die scheibenförmigen Einzelschichten von der Stirnseite aus von einem kanalförmigen Hohlgangsystem durchzogen sind.
- Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass die scheibenförmigen Einzelschichten von einer Fläche zur anderen Fläche von Hohlgängen durchzogen sind.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die kanalförmigen Hohlgänge eines Systems in mindestens einen Anström- und Ausströmkörper münden.
- Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass der Anström- und Ausströmkörper mit dem Körper aus porösem Material verbunden ist.
- Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass der Anström- und Ausströmkörper Bestandteil des Behältnisses ist.
- Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass das poröse Material aus einem gesinterten Keramikpulver besteht.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellpräparation in mindestens einem Bioreaktor in Form einer perfundierbaren Organkopie, der aus einem immunologisch inaktiven porösen Körper, dessen offene Poren miteinander kommunizieren und organspezifischen Hohlstrukturen besteht, kultiviert wird.
- Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass die Poren des Bioreaktors einen Durchmesser von 100-1000 μm aufweisen.
- Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass die Poren untereinander über 50 – 300 μm große Hohlräume miteinander verbunden sind.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass die Organkopie in einem flüssigkeits- und keimdichten Behältnis angeordnet und dass das Außengehäuse mit Anschlüssen versehen ist, die mit mindestens einer Hohlstruktur der Organkopie in Verbindung stehen.
- Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 40 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass das Behältnis und die Anschlüsse aus einem biologisch abbaubaren Material bestehen.
- Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 40 bis 44, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Körper aus einem biologisch abbaubaren Material besteht.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 40 oder 44, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Körper aus einem gesinterten Keramikpulver besteht.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 46, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Kopie der Leber, Knochenmark, Lymphknoten, Thymus, Milz, Niere, Bauchspeicheldrüse, Inselorgan, Schleimhaut, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Nebenniere, Knochen, Hoden, Gebärmutter, Placenta, Eierstöcke, Blutgefäße, Herz, Lunge, Muskel, Darmwand, Blase, Herzmuskel und/oder weitere Säugetierorgane ist.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellpräparation gekühlt oder tiefgefroren gelagert wird.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor und/oder nach der selektiven und/oder partiellen Schädigung die Regeneration, Vermehrung und/oder Differenzierung der Zellen durch Zugabe von Wirkstoffen, Wachstumsfaktoren und/oder Differenzierungsfaktoren angeregt wird.
- Zellpräparation enthaltend eine unfraktionierte Zellmischung eines Organs und/oder Gewebes, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit einem vorbestimmten Reife- und/oder Differenzierungsgrad vor oder nach Erzeugung der unfraktionierten Zellmischung selektiv und/oder partiell geschädigt wurden.
- Zellpräparation nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen zusätzlich gleichzeitig mit Erzeugung der unfraktionierten Zellmischung geschädigt wurden.
- Zellpräparation nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit einem vorbestimmten Schädigungsgrad und/oder mit einem vorbestimmten Reife- und/oder Differenzierungsgrad abgetrennt sind.
- Zellpräparation nach einem der Ansprüche 50 bis 52, dadurch gekennzeichnet, dass sie weitere differenzierte Zellen des gleichen und/oder eines anderen bestimmten Organs- und/oder Gewebetyps eines Organs und/oder Gewebes desselben und/oder eines anderen Organismus enthält.
- Zellpräparation nach einem der Ansprüche 50 bis 53, dadurch gekennzeichnet, dass sie therapeutisch nutzbare, organregenerierende Faktoren erzeugt.
- Zellpräparation nach einem der Ansprüche 53 bis 54, dadurch gekennzeichnet, dass die weiteren differenzierten Zellen selektiv und/oder partiell geschädigt sind.
- Zellpräparation nach einem der Ansprüche 53 bis 55, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen von den weiteren differenzierten Zellen durch eine für Zellen undurchlässige Barriere getrennt sind.
- Zellpräparation nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Barriere für Wirkstoffe und/oder Stoffwechselprodukte von Zellen permeabel oder semipermeabel ist.
- Zellpräparation nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Barriere eine für Zellen nicht durchgängige Membran ist.
- Zellpräparation nach einem der Ansprüche 53 bis 58, dadurch gekennzeichnet, dass sie Nichtparenchymzellen und/oder mesenchymale Zellen desselben und/oder eines anderen Organ- und/oder Gewebetyps desselben und/oder eines anderen Organismus enthält.
- Zellpräparation nach einem der Ansprüche 50 bis 59, dadurch gekennzeichnet, dass sie Biomatrix proteine insbesondere Collagen oder Fibronectin, enthält.
- Zellpräparation nach einem der Ansprüche 50 bis 60, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einer organ- und/oder gewebespezifischen Umgebung eingebracht ist.
- Zellpräparation nach einem der Ansprüche 50 bis 61, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellpräparation in einem Modul kultiviert wird, das ein Außengehäuse und mindestens drei unabhängige Membransysteme aufweist, wobei mindestens zwei unabhängige Membransysteme als Hohlfasermembranen ausgebildet sind und diese Hohlfasermembrane ein dicht gepacktes räumliches Netzwerk bilden, wobei das Netzwerk aus sich kreuzenden und/oder überlagernden Hohlfasermembranen besteht.
- Zellpräparation nach Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellpräparation in einem Modul kultiviert wird, das ein Außengehäuse und einen darin eingeschlossenen porösen Körper aufweist, dessen Poren miteinander kommunizieren, wobei dieser Körper mindestens zwei unabhängige Kanalsysteme enthält, die sich kreuzen und/oder überlagern und den Körper hochziehen.
- Zellpräparation nach einem der Ansprüche 50 bis 63, dadurch gekennzeichnet, dass sie gekühlt oder tiefgefroren ist.
- Zellpräparation nach einem der Ansprüche 50 bis 64, dadurch gekennzeichnet, dass sie Wirkstoffe zur Regeneration, Vermehrung, Differenzierung und/oder Erhalt von Zellen enthält.
- Verwendung eines Verfahrens oder einer Zellpräparation nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung einer Stammzellkultur oder einer Progenitorzellkultur bzw. einer Kultur von Stammzellen eines Säugetieres oder eines Menschen.
- Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch zur Herstellung einer Kultur somatischer Stammzellen.
- Verwendung nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung einer Stammzellkultur aus Organen und/oder Geweben.
- Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch zur Herstellung einer organspezifischen Stammzellkultur aus Leber, Pankreas, Pankreasinseln, Schleimhaut, Muskel, Herzmuskel, Knochenmark, Lymphknoten, Thymus, Milz, Niere, Nebenschilddrüse, Nebenniere, Knochen, Hoden, Gebärmutter, Placenta, Eierstock, Blutgefäßen, Darm, neuralem Gewebe, Gehirn oder weiterer Säugetierorgane.
- Verwendung eines Verfahrens oder einer Zellpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 65, zur Untersuchung der Wirkung des Metabolismus und/oder der Toxizität von Chemikalien und/oder Arzneimitteln und/oder zur Entwicklung von Pharmaka.
- Verwendung eines Verfahrens oder einer Zellpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 65, zur Gewinnung von Stoffen, die die Vermehrung und/oder die Differenzierung von Stammzellen in vivo und/oder in vitro stimulieren und/oder unterstützen.
- Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch zur Gewinnung von Differenzierungsfaktoren, Vermehrungsfaktoren, Wachstumsfaktoren, Mediatoren, Zytokinen und/oder Hormonen.
- Verwendung eines Verfahrens oder einer Zellpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 65 als Zellimplantat oder zum extrakoporalen Organ- oder Gewebeersatz.
- Verwendung eines Verfahrens oder einer Zellpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 65, zur Gewinnung von Substanzen, welche die Regeneration erkrankter Organe anregen und in der regenerativen Medizin lokal, oral oder systemisch appliziert werden können.
- Verwendung eines Verfahrens oder einer Zellpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 65, zur Produktion von Bindegewebszellen bzw. Stromazel len für die Feeder-layer-Kultur und Ko-Kultur von Stammzellen.
- Verwendung eines Verfahrens oder einer Zellpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 65 für in vitro Virus-Replikationssysteme sowie die Vaccinherstellung.
- Verwendung eines Verfahrens oder einer Zellpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 65 zur Herstellung eines hybriden haematopoietischen Knochenmarks.
- Verwendung eines Verfahrens oder einer Zellpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 65 zur Herstellung eines hybriden Immunsystems zur Produktion immunkompetenter Zellen, Antikörper oder Vaccine.
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