CN107988147B

CN107988147B - 基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3d拟表皮构建的方法

Info

Publication number: CN107988147B
Application number: CN201711373861.4A
Authority: CN
Inventors: 张玮莹; 肖婷昱; 吴轩; 曹一平
Original assignee: Jianghan University
Current assignee: Jianghan University
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2037-12-19
Also published as: CN107988147A

Abstract

本发明涉及一种基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法，包括以下步骤：将一面接种有成纤维细胞另一面接种有角质细胞的3D纺丝支架放置于灭菌后的器官芯片中，通入CnT‑07 epidermal keratinocyte medium和DMEM（含10%体积比FBS、1%体积比的青霉素‑链霉素）这两种培养基，分别培养角质细胞和成纤维细胞，实现角质细胞和成纤维细胞的共培养和细胞增殖。本发明中构建方法通过利用干细胞分化技术得到所需细胞，在纳米结构上进行细胞的接种，在器官芯片中实现角质细胞和成纤维细胞的共培养，以用于表皮组织修复成为现在的研究热点和药物模型建立的新方法。

Description

基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，主要承担着保护身体、排汗、感觉冷热和压力等功能，人的皮肤主要有表皮、真皮和皮下组织三层组成，在表皮层中含有可分化为形成角质层的角质细胞，真皮层中含有成纤维细胞，可分泌出多种大分子物质如胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖等。在日常生活中，皮肤受损和皮肤疾病不可避免，因此，需要大量且耐用的皮肤代用品来对受损的表皮进行修复，同时建立表皮疾病模型来进行给药研究，确定药物对表皮疾病的适用性。因此目前表皮组织的建立和表皮疾病模型的建立都需要角质细胞和成纤维细胞这两种细胞材料。

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSC）最初是日本科学家山中伸弥（Shinya Yamanaka）于2006年在《Cell》中发表了利用病毒载体将四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型。因此利用iPSC诱导分化得到角质细胞和成纤维细胞的优势在于：（1）由于iPSC可以由自体的体细胞逆分化得到，因此，可一定程度上避免机体的免疫排斥反应。（2）iPSC的制造不需要利用胚胎，并且它拥有与胚胎干细胞功能很相近的多向分化能力，具有一定的安全性。（3）iPSC摆脱了材料来源和伦理的诸多限制，重编程的效率和程度十分可观。

在生物医学领域，纳米纤维的直径小于细胞，可以模拟天然的细胞外基质的结构和生物功能。人的大多数组织、器官在形式和结构上与纳米纤维类似，这为纳米纤维用于组织和器官的修复提供了可能。一些电纺原料具有很好的生物相容性及可降解性，可作为载体进入人体，并容易被吸收。加之静电纺纳米纤维还有大的比表面积、孔隙率等优良特性，因此，这类材料在生物医学领域引起了研究者的持续关注，并已在药物控释、创伤修复、生物组织工程等方面得到了很好的应用，其中，聚乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)是一种可生物降解的生物高分子材料，具有易于加工成形、生物相容性好及力学性能佳等优点，随着组织工程的兴起和迅速发展，已广泛应用于各类组织工程支架的制作，是组织工程生物支架的首选材料之一。同时，通过紫外光刻技术制备微孔滤膜，可作为纺丝的基底，将纺丝构建于微孔中，可同时在纺丝两面粘附细胞，形成所需组织，有利于细胞间相互渗透。

微流体系统是一种以微流体技术为核心用于生物、化学、生物医学等领域的芯片型微全分析系统。基于微流体技术的芯片对于细胞的培养、检测及分析具有重要的意义，不仅可以为细胞提供适宜的培养环境、实现细胞的培养与操控，可以搭建灵敏度高、精度高、生物兼容性好、便于携带的检测平台，这为细胞的培养、检测、分析和生物芯片的集成化提供了实验检测平台。微流体系统的迅猛发展大大的促进了生物工程、化学工程在分析领域的发展，它改变了传统生化分析的方式，以其微米级别的结构，平方厘米级别的面积减少了传统实验仪器试剂和样品的消耗。同时，可通过加入不同培养基实现不同细胞的共培养，便于组织的构建以及不同组织之间的共培养。

目前在药物开发和毒理学方面的研究工作往往缺乏评估人体对药物化合物和毒素的生理反应的预测模型。尽管基于体外细胞培养技术的各种类型的替代模型的发展，绝大多数这些系统未能重述活体组织和器官的结构和功能复杂性。尽管已经使用三维细胞外基质来诱导分化的组织特异性表型，但是这种方法仍然限制了模拟对于各种生理功能而言至关重要的多种组织类型的基本结构和空间布置的能力。现有的细胞培养模型也缺乏复制器官发育和功能中起关键作用的动态的机械和生物化学微环境。

器官芯片是是一种利用微加工技术，在微流控芯片上制造出能够模拟人类器官的主要功能的仿生系统，用于在连续灌注的微米级腔室中培养活细胞以模拟组织和器官的生理功能的微流体装置。目标不是建立一个完整的生命体，而是要合成最小的功能单位，体现组织和器官级功能。最简单的系统是含有展现一种组织类型功能的一种培养细胞（例如肝细胞或肾小管上皮细胞）的单个灌注微流体室。在更复杂的设计中，两个或多个微通道通过多孔连接通过不同的细胞类型排列在相对的两侧，以重建不同组织（例如，肺泡 - 毛细血管界面或血脑屏障）之间的界面。这些系统可以结合物理力量，包括生理学相关水平的流体剪切应力，循环应变和机械压缩，并能够进行器官特异性反应的分析，包括注入循环免疫细胞，毒素或其他环境扰动。可以用来自不同器官的细胞排列的芯片进行类似的分析，所述细胞直接从一个间质组织室到另一个，或者可能通过衬有血管内皮的第二通道流体连接，以模拟不同器官之间的生理相互作用或研究药物体外分布。研究人员常使用动物实验代替体外培养模式，然而，动物实验也存在周期长、成本高等缺点，且动物模型常常不能预测人体对于各种药物的响应。器官芯片概念的提出，正是为了解决动物实验的诸多不足，希望在芯片上建立更加真实的生理模型，并能成为一种仿生、高效、节能的生理学研究及药物开发工具。经过近几年来的快速发展，研究人员已经在微流控芯片上实现了众多人体器官的构建，如芯片肝、芯片肺、芯片肠、芯片肾、芯片血管、芯片心脏以及多器官芯片等。

目前，用于3D拟表皮的建立主要分为移植和组织工程技术。移植主要包括自体皮肤移植和异体/异种皮肤移植，其中自身皮肤移植是治疗创伤、烧伤及其他因素所致皮肤缺损的常用方法，移植的皮肤能否成活主要取决于移植的皮肤与受皮组织是否建立了有效的血液循环，异种移植指将一个物种的组织移植到另一个物种体内，例如，从猪到人。和同种移植不同的是，异种之间存在很大差异，从而使得这种移植成功的可能性很小。组织工程技术即从机体获取少量的活体组织，用特殊的酶或其他方法将细胞（又称种子细胞）从组织中分离出来在体外进行培养扩增，然后将扩增的细胞与具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料（支架）按一定的比例混合，使细胞黏附在生物材料（支架）上形成细胞-材料复合物；将该复合物植入机体的组织或器官病损部位，随着生物材料在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成相应的组织或器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的。其中，自体移植主要存在的问题是皮肤来源材料不足，无法满足大面积皮肤受损的情况，异体/异种移植会带来一定的免疫排斥反应，组织工程技术所取得的种子细胞在构建疾病模型上存在缺陷，无法实现多种细胞的共培养和药物筛选。

因此，研究一种可大量生产、免疫排斥低并可携带致病基因且可同时培养多种表皮细胞的表皮模型以作药物筛选和/或皮肤修复之用成为需要解决的技术问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种可大量生产、免疫排斥低且可同时培养多种表皮细胞模型的3D拟表皮构建的方法。

本发明为解决上述技术问题提出的技术方案是：一种基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法，包括以下步骤：

将一面接种有成纤维细胞另一面接种有角质细胞的3D纺丝支架放置于灭菌后的器官芯片中，通入CnT-07和DMEM培养基，分别培养角质细胞和成纤维细胞，实现角质细胞和成纤维细胞的共培养和细胞增殖，该DMEM培养基含有含10% 体积比的FBS和1%体积比的青霉素-链霉素。

进一步的，所述3D纺丝支架是通过以下方法制得，

首先，利用L-edit软件进行图案设计，设计的薄膜尺寸为1×1厘米，然后根据设计的图案在硅片上进行负光刻胶匀速甩胶，之后进行前烘操作，再在紫外光刻机下曝光处理；随后经过后烘、显影得到具有微凹槽阵列的模板；

其次，按照10:1的比例配置PDMS预聚物和交联剂，所得溶液倾倒于上述模板中，静置5分钟后，在80℃条件下烘2小时，最后经剥离得到3D微柱模板；

然后，将打孔后的3D微柱模板贴合在玻璃片上，配制含有5%安息香双醛的PEGDA溶液，适量注入在模板和玻璃片之间，并在紫外光刻机下曝光处理，经剥离后得到微孔薄膜；

再，配制15%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纺丝溶液，称取1.2g PLGA固体于20ml小玻璃瓶中，随后分别用量筒量取9mlN，N-二甲基甲酰胺(DMF)与3ml的四氢呋喃(THF)，并依次加至玻璃瓶中，静置过夜得10%PLGA纺丝溶液；

最后，使用体积为20ml的注射器吸取上述所得的10%PLGA溶液并倒置放置10min以除去溶液中的气泡，设置流速为0.3ml/h，再将其固定在静电纺丝机中，将所述微孔薄膜放置在接收板上，设置纺丝时间8min，得到所需纳米纺丝支架。

进一步的，所述角质细胞是由经培养的iPSC分化而来，具体步骤如下，

i、在接种密度为30%左右的iPSC贴壁的第二天，加入2ml DKSFM培养基，该DKSFM培养基含1um的all-trans RA、10ng/ml Human BMP4和1.5mm CaCl₂，每两天换液一次，37℃、5%CO₂培养箱培养；

ii、在换三次液之后，吸除旧培养基，加入DKSFM培养基，该DKSFM培养基不含RA、BMP4和CaCl₂，并每两天更换一次至角质细胞初步分化；

iii、在步骤ii中换五次液后，吸除旧培养基，加入CnT-07培养基，每两天换液一次促进角质细胞增殖。

进一步的，所述成纤维细胞是由经培养的iPSC分化而来，具体步骤如下，

制备拟胚体EB，向Aggrewell^TM400中加入DMEM medium，润洗后吸出，加入Aggrewell^TM medium，离心1000rmp，5min，除气泡，用0.5mM的EDTA消化密度为80~90%贴壁的iPSCs，用PBS吹打细胞并离心，吸出上清液；

之后，取出培养箱备用的Aggrewell^TM400，去除其中的Aggrewell^TM medium，重新加入1ml 含10⁷ cell/ml 的iPSCs的悬浮液，离心，培养箱培养24小时；第二天，在生物安全柜中，吹吸出EB，在低粘附的六孔板中用Aggrewell^TM medium，该Aggrewell^TM medium含0.3mM Ascorbic acid、10ng/ml TGF-bata2 Protein和ITS-A supplement和ITS-Asupplement培养4~5天；

EB培养4~5天后，吸除旧培养基，加入DMEM，该DMEM含0.3mM Ascorbic acid，20%体积比的FBS和1%体积比的链霉素—青霉素，吸取EB至包被Matrix的培养皿中，每两天更换一次培养基，观察细胞状态；

5天后，吸除旧培养基，加入DMEM，该DMEM含10%体积比的FBS、1%体积比的链霉素—青霉素，培养10天。

进一步的，前述所述经培养的iPSC是经以下步骤培养，

a、将iPSC培养基取出并放至室温，取出包被过Matrix的培养皿，吸去包被液并加入iPSC培养基，置于5%CO₂的37℃恒温细胞培养箱中，37℃水浴预热PBS溶液和0.5mM EDTA传代工作液；

b、吸走旧的iPSC培养基，并且通过加入无钙镁的PBS溶液润洗培养皿底，除去凋亡的iPSC；

c、加入0.5mM EDTA传代工作液使之完全覆盖皿底；

d、37℃孵育3~5min，显微镜下观察到大部分iPSC克隆边缘开始脱离皿底，克隆内部大部分细胞间出现间隙但尚未相互分离，肉眼观察到细胞集落变得不透明且发白；

e、吸去传代工作液，即刻加入新鲜的PSCeasy完全培养基，用枪扇形吹打培养皿底，使皿底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，制成干细胞悬液；

f、将干细胞以30%的密度接种到准备好的培养皿中，调节培养液体积至合适的量；

g、显微镜下观察细胞呈4-20个细胞大小的团块，水平十字振动使细胞均匀分布；

h、将细胞置于5%CO₂的37℃恒温培养箱培养，第二天用于分化，或每天换液直至达到可以传代的标准。

本发明的有益效果是：

本发明中构建方法通过利用干细胞分化技术得到所需细胞，在纳米结构上进行细胞的接种，在器官芯片中实现角质细胞和成纤维细胞的共培养，以用于表皮组织修复成为现在的研究热点和药物模型建立的新方法。特点在于：

1）、利用人源诱导多能干细胞（iPSC）进行定向分化，一定程度上避免免疫排斥反应、安全高效，摆脱了伦理和材料来源的诸多限制。

2）、使用Defined keratinocyte serum-free medium (DKSFM) (Gibco)培养基（含1um all-trans RA (Sigma-Aldrich)、10ng/ml Human BMP4 (R&D Systems)和1.5mmCaCl₂）将iPSC初步定向分化为角质细胞，之后用无任何添加因子的DKSEM稳定细胞的状态，并使用CnT-07促进细胞增殖使得iPSC向角质细胞高效分化。

3）、iPSC定向分化为成纤维细胞过程中，制备拟胚体（EB）并用Aggrewell^TM medium培养能有效促进iPSC向中胚层细胞分化（成纤维细胞属于中胚层分化的细胞），Ascorbicacid(sigma)、TGF-bata2 Protein和 ITS-A supplement有效促进EB向成纤维细胞分化，从而得到由iPSC高效分化的成纤维细胞。

4）、使用生物可降解且相容性良好的纳米纺丝纤维接种细胞，为细胞的培养提供了良好的微环境，有效促进细胞粘附。

5）、利用器官芯片实现细胞的共培养，使两种细胞增殖生长，提供了表皮修复的材料来源和皮肤疾病模型的研究方法。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明。

图1是3D纺丝支架的显微镜图片。

图2是在器官芯片中构建的3D拟表皮免疫荧光染色图。

具体实施方式

本发明中基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法包括以下技术方案。

实施例1：iPSC的接种

当iPSC达到传代状态时，可用于接种，具体步骤如下：

将PSCeasy人多潜能干细胞（ES/iPS）培养基（简称iPSC培养基）取出并放至室温，取出包被过Matrigel Matrix（基质胶，简称Matrigel，源自美国的corning公司）的培养皿，吸去包被液并加入适量iPSC培养基，置于5%CO₂的37℃恒温细胞培养箱中，37℃水浴预热PBS溶液（磷酸缓冲液，简称PBS，源自美国的Gibco公司）和0.5mM EDTA传代工作液（乙二胺四乙酸，简称EDTA，源自美国的赛默飞公司）。

吸走旧的iPSC培养基，并且通过加入无钙镁的PBS溶液润洗培养皿底，除去凋亡的iPSC。

加入0.5mM EDTA传代工作液使之完全覆盖皿底。

37℃孵育3-5min，显微镜下观察到大部分iPSC 的克隆边缘开始脱离皿底，克隆内部大部分细胞间出现间隙但尚未相互分离，肉眼观察到细胞集落变得不透明且发白，表明细胞消化时间理想。

吸去传代工作液，即刻加入新鲜的PSCeasy完全培养基，用枪扇形吹打培养皿底，使皿底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，制成干细胞悬液。

将干细胞以30%的密度接种到Matrigel包被的培养皿中。

显微镜下观察细胞呈4-20个细胞大小的团块，水平十字振动使细胞均匀分布。

将细胞置于5%CO₂的37℃恒温培养箱培养，第二天用于分化，或者，每天换液直至达到可以传代的标准。

实施例2：iPSC向角质细胞分化

Day0，在接种密度为30%左右的iPSC贴壁的第二天，加入2 ml Definedkeratinocyte serum-free medium (角质形成细胞无血清培养基，简称DKSFM，源自美国的Gibco公司)培养基（1um all-trans RA (维甲酸，简称RA，源自美国的Sigma公司)、10ng/mlRecombinant Human BMP-4 Protein(骨形成蛋白，简称BMP-4，源自美国的R&D Systems公司)和1.5mm CaCl₂），每两天换液一次，37℃、5%CO₂培养箱培养。

Day6，吸除旧培养基，加入2 ml Defined keratinocyte serum-free medium(DKSFM) 培养基，该DKSFM培养基不含RA、BMP4和CaCl2，并每两天更换一次至角质细胞初步分化。

Day16，吸除旧培养基，加入适量CnT-07 epidermal keratinocyte medium （上皮角质培养基，简称CnT-07，源自瑞士CELLnTEC公司），每两天换液一次促进角质细胞增殖。

实施例3：iPSC向成纤维细胞分化

制备拟胚体（EB）：首先向Aggrewell^TM400（微孔培养皿，简称Aggrewell^TM400，源自加拿大的STEMCELL公司）中加入DMEM medium，润洗后吸出。加入Aggrewell^TM medium，离心1000rmp，5min，除气泡，用0.5mM的EDTA消化密度为80~90%贴壁的iPSCs，用PBS吹打细胞并离心，吸出上清液。

之后，取出培养箱备用的Aggrewell^TM400，去除其中的Aggrewell^TMmedium，重新加入1ml 含10⁷cell/ml 的iPSCs的悬浮液，离心，培养箱培养24小时。第二天，在生物安全柜中，吹吸出EB，在低粘附的六孔板中用Aggrewell^TMmedium（含0.3mM Ascorbic acid(抗坏血酸，简称AA，源自美国的sigma公司)、10ng/ml Recombinant Human TGF-beta 2 Protein（转化生长因子，简称TGF-β2，源自美国的R&D Systems公司）和ITS-A supplement（胰岛素，转铁蛋白，硒，丙酮酸钠溶液，简称ITS-A，源自美国的Gibco公司)）培养4~5天。

EB培养4~5天后，吸除旧培养基，加入适量DMEM培养基（含0.3mM AA，20%体积比的FBS、1%体积比的链霉素—青霉素），吸取EB至包被Matrix的培养皿中，每两天更换一次培养基，观察细胞状态。

5天后，吸除旧培养基，加入适量DMEM（含10%体积比的FBS、1%体积比的链霉素—青霉素）培养10天。

实施例4：纳米纺丝支架的制备

利用L-edit软件进行图案设计，设计的薄膜尺寸为1×1厘米，然后根据设计的图案在硅片上进行负光刻胶（SU8-3050）匀速甩胶，之后进行前烘操作，再在紫外光刻机下曝光处理；随后经过后烘、显影得到具有微凹槽阵列的模板。

按照10:1的比例配置PDMS预聚物和交联剂，所得溶液倾倒于上述模板中，静置5分钟后，在80℃条件下烘2小时，最后经剥离得到3D微柱模板

将打孔后的3D微柱模板贴合在玻璃片上，配制含有5%安息香双醛的PEGDA溶液，适量注入在模板和玻璃片之间，并在紫外光刻机下曝光处理，经剥离后得到微孔薄膜。

配制15%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纺丝溶液，称取1.2g PLGA固体于20ml小玻璃瓶中，随后分别用量筒量取9mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)与3ml的四氢呋喃(THF)，并依次加至玻璃瓶中，静置过夜得10%PLGA纺丝溶液。

使用体积为20ml的注射器吸取上述所得的10%PLGA溶液并倒置放置10min以除去溶液中的气泡，设置流速为0.3ml/h，再将其固定在静电纺丝机中，将第3步制得的微孔薄膜放置在接收板上，设置纺丝时间8min，得到所需纳米纺丝支架。图1中显示的是3D纺丝支架的显微镜图片。

实施例5：利用器官芯片构建3D拟表皮

将纳米纺丝支架在生物安全柜中紫外照射30min，75%酒精浸泡1min并吸除，将支架置于培养皿中，matrigel包被过夜。

用胰酶将分化所得的成纤维细胞消化下来，接种在包被过的纺丝支架上，用DMEM（含15%FBS、1%双抗）培养，两天后在另一面接种分化所得的角质细胞。

将两面都接种有细胞的3D纺丝支架放置于灭菌后的器官芯片中，通入两种培养基CnT-07 epidermal keratinocyte medium和DMEM（含10%体积比的FBS、1%体积比的链霉素—青霉素），分别培养角质细胞和成纤维细胞，实现角质细胞和成纤维细胞的共培养，实现细胞增殖。

图2是在器官芯片中构建的3D拟表皮免疫荧光染色图，绿色（图中主体部亮色部位）：角质细胞标记物keratin 1，红色（图中主体部灰色部位）：成纤维细胞标记物vimentin，蓝色（图中主体部深色部位）：细胞核标记物hoechst。

本发明的不局限于上述实施例，本发明的上述各个实施例的技术方案彼此可以交叉组合形成新的技术方案，另外凡采用等同替换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。

Claims

1.一种基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法，包括以下特征步骤：将一面接种有成纤维细胞另一面接种有角质细胞的3D纺丝支架放置于灭菌后的器官芯片中，通入CnT-07和DMEM培养基，分别培养角质细胞和成纤维细胞，实现角质细胞和成纤维细胞的共培养和细胞增殖，该DMEM培养基含有含10% 体积比的FBS和1%体积比的青霉素-链霉素；

所述3D纺丝支架是通过以下方法制得，首先，利用L-edit软件进行图案设计，设计的薄膜尺寸为1×1厘米，然后根据设计的图案在硅片上进行负光刻胶匀速甩胶，之后进行前烘操作，再在紫外光刻机下曝光处理；随后经过后烘、显影得到具有微凹槽阵列的模板；其次，按照10:1的比例配置PDMS预聚物和交联剂，所得溶液倾倒于上述模板中，静置5分钟后，在80℃条件下烘2小时，最后经剥离得到3D微柱模板；然后，将打孔后的3D微柱模板贴合在玻璃片上，配制含有5%安息香双醛的PEGDA溶液，适量注入在模板和玻璃片之间，并在紫外光刻机下曝光处理，经剥离后得到微孔薄膜；再，配制15%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纺丝溶液，称取1.2g PLGA固体于20ml小玻璃瓶中，随后分别用量筒量取9mlN，N-二甲基甲酰胺与3ml的四氢呋喃，并依次加至玻璃瓶中，静置过夜得10%PLGA纺丝溶液；最后，使用体积为20ml的注射器吸取上述所得的10%PLGA溶液并倒置放置10min以除去溶液中的气泡，设置流速为0.3ml/h，再将其固定在静电纺丝机中，将所述微孔薄膜放置在接收板上，设置纺丝时间8min，得到所需纳米纺丝支架；

所述角质细胞是由经培养的iPSC分化而来，具体步骤如下， i、在接种密度为30%左右的iPSC贴壁的第二天，加入2ml DKSFM培养基，该DKSFM培养基含1um的all-trans RA、10ng/ml Human BMP4和1.5mm CaCl₂，每两天换液一次，37℃、5%CO₂培养箱培养； ii、在换三次液之后，吸除旧培养基，加入DKSFM培养基，该DKSFM培养基不含RA、BMP4和CaCl₂，并每两天更换一次至角质细胞初步分化； iii、在步骤ii中换五次液后，吸除旧培养基，加入CnT-07培养基，每两天换液一次促进角质细胞增殖；

所述成纤维细胞是由经培养的iPSC分化而来，具体步骤如下，制备拟胚体EB，向Aggrewell^TM400中加入DMEM medium，润洗后吸出，加入Aggrewell^TMmedium，离心1000rmp，5min，除气泡，用0.5mM的EDTA消化密度为80~90%贴壁的iPSCs，用PBS吹打细胞并离心，吸出上清液；之后，取出培养箱备用的Aggrewell^TM400，去除其中的Aggrewell^TM medium，重新加入1ml 含10⁷ cell/ml 的iPSCs的悬浮液，离心，培养箱培养24小时；第二天，在生物安全柜中，吹吸出EB，在低粘附的六孔板中用Aggrewell^TM medium培养4~5天，该Aggrewell^TMmedium含0.3mM Ascorbic acid、10ng/ml TGF-bata2 Protein和ITS-A supplement； EB培养4~5天后，吸除旧培养基，加入DMEM，该DMEM含0.3mM Ascorbic acid，20%体积比的FBS和1%体积比的链霉素-青霉素，吸取EB至包被Matrix的培养皿中，每两天更换一次培养基，观察细胞状态； 5天后，吸除旧培养基，加入DMEM，该DMEM含10%体积比的FBS、1%体积比的链霉素-青霉素，培养10天。

2.根据权利要求1所述基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法，其特征在于：所述经培养的iPSC是经以下步骤培养， a、将iPSC培养基取出并放至室温，取出包被过Matrix的培养皿，吸去包被液并加入iPSC培养基，置于5%CO₂的37℃恒温细胞培养箱中，37℃水浴预热PBS溶液和0.5mM EDTA传代工作液； b、吸走旧的iPSC培养基，并且通过加入无钙镁的PBS溶液润洗培养皿底，除去凋亡的iPSC； c、加入0.5mM EDTA传代工作液使之完全覆盖皿底； d、37℃孵育3~5min，显微镜下观察到大部分iPSC克隆边缘开始脱离皿底，克隆内部大部分细胞间出现间隙但尚未相互分离，肉眼观察到细胞集落变得不透明且发白； e、吸去传代工作液，即刻加入新鲜的PSCeasy完全培养基，用枪扇形吹打培养皿底，使皿底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，制成干细胞悬液； f、将干细胞以30%的密度接种到准备好的培养皿中，调节培养液体积至合适的量； g、显微镜下观察细胞呈4-20个细胞大小的团块，水平十字振动使细胞均匀分布； h、将细胞置于5%CO₂的37℃恒温培养箱培养，第二天用于分化，或每天换液直至达到可以传代的标准。