CN105087459A - 体外小肠干细胞培养基及培养方法 - Google Patents

体外小肠干细胞培养基及培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105087459A
CN105087459A CN201510208071.5A CN201510208071A CN105087459A CN 105087459 A CN105087459 A CN 105087459A CN 201510208071 A CN201510208071 A CN 201510208071A CN 105087459 A CN105087459 A CN 105087459A
Authority
CN
China
Prior art keywords
substratum
stem cell
intestinal stem
little intestinal
culture medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510208071.5A
Other languages
English (en)
Inventor
陈芸
姚少凌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Far Eastern Memorial Hospital
Original Assignee
Far Eastern Memorial Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Far Eastern Memorial Hospital filed Critical Far Eastern Memorial Hospital
Publication of CN105087459A publication Critical patent/CN105087459A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Abstract

本发明提供了一种用于体外培养小肠干细胞的培养基，包含基础培养液；转铁蛋白；乙醇胺；抗坏血酸、或其盐、或其酯；谷胱甘肽或其盐；及亚硒酸钠，其中，乙醇胺于该培养基中的浓度范围为0.5mM至小于5mM。本发明进一步提供一种体外培养小肠干细胞的方法，该方法包含将所分离的小肠干细胞于本发明的培养基中培养。本发明提供的培养基可提供小肠干细胞更佳的生长环境，并维持其未分化的细胞型态及干性胞特性，且不含血清，对于临床上的应用更具潜力。

Description

体外小肠干细胞培养基及培养方法
技术领域
本发明关于一种小肠干细胞的培养基，尤其关于一种用于体外培养小肠干细胞的培养基及培养方法。
背景技术
干细胞存在于许多哺乳类组织当中，具有自我更新(self-renewal)及分化(differenciation)的能力。其中，肠组织主要由小肠及结肠所组成，小肠的内层在解剖学上称作粘膜(mucosa)，该粘膜会朝着肠内腔的方向凸出呈长条状，又称为绒毛(villi)，而腺窝(crypt)则位于绒毛附近，小肠干细胞(Intestinalstemcells，简称ISCs)存在于小肠腺窝底端，其具有分化成短暂扩增细胞(transitamplifyingcell，简称TC细胞)的能力，该细胞会更进一步分化为二种主要细胞类型，包括吸收(absorptive)系统及分泌(secretory)系统。小肠干细胞是一种有潜力的干细胞，然而，小肠干细胞的分离及增殖常面临缺乏生物标记及有效长期培养方法的困境，良好的培养系统需维持小肠干细胞的增生及分化能力。先前研究描述了一种能长期培养并维持小肠干细胞特性的体外长期培养系统，该系统使用市面上购得的已添加必要生长因子的高等DMEM/F12(advancedDMEM/F12)培养基，用以将小肠干细胞培养在三维培养基中，该小肠干细胞会形成类器官(organoid)的腺窝-绒毛球状结构。然而，发展体外培养小肠干细胞培养基对于临床上的应用及小肠干细胞的体外增殖培养技术仍有迫切的需要。
发明内容
本发明提供了一种用于体外培养小肠干细胞的培养基，该培养基包含基础培养液；转铁蛋白(transferrin)；乙醇胺(ethanolamine)；抗坏血酸、或其盐、或其酯；谷胱甘肽或其盐(glutathione)；及亚硒酸钠(sodiumselenite)，其中，乙醇胺于该培养基中的浓度范围为0.5mM至小于5mM。
于本发明的一具体实施例中，该基础培养液选自由DMEM培养基、DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基及Eagle’s培养基所组成组的至少一种。
于本发明的一具体实施例中，转铁蛋白于该培养基中的浓度范围为1.8×10-3mM至小于1.8×10-2mM。
于本发明的一具体实施例中，抗坏血酸、或其盐、或其酯于该培养基中的浓度范围为0.05mM至小于0.617mM。
于本发明的一具体实施例中，谷胱甘肽或其盐于该培养基中的浓度范围为0.05mM至小于0.647mM。
于本发明的一具体实施例中，亚硒酸钠于该培养基中的浓度范围为5×10-4mM至小于6.5×10-3mM。
于本发明的一具体实施例中，经该培养基培养的小肠干细胞仍具有自我更新性及干细胞特性(stemness)。
于本发明的一具体实施例中，经该培养基培养的小肠干细胞对于Msi1、Bmi1、Lgr5、PTEN、CD24及CD44的一种或多种为阳性。
本发明进一步提供一种体外培养小肠干细胞的方法，该方法包含使用本发明的培养基以培养小肠干细胞。
附图说明
图1为小肠干细胞体外培养的时程图，其显示以包含2％血清的高等DMEM/F12培养基培养可使小肠干细胞长时间维持在尚未形成类肠状物(enteroid)的阶段，其中，图中的数字表示培养的天数；
图2显示不同生长因子对于体外培养小肠干细胞的影响，其中，小肠干细胞的初始密度为5000个/12孔，培养7日后计算每孔中类肠状物形成的数量，该结果以3个实验的平均值表示，且横杆表示其标准差；
图3显示以部分析因设计(fractionalfactorialdesign，简称FFD)的筛选结果，以1000个/24孔小肠干细胞的密度计算，该结果以3个实验的平均值表示，且横杆表示其标准差，并与控制组(高等DMEM/F12培养基培养，其结果具有108个/孔小肠干细胞)做比较；
图4为依据“取得培养该小肠干细胞最适组成成分的组成浓度的最速上升途径”所得出培养小肠干细胞的最适组成成分的组成浓度及其实验结果，其中，(A)、(B)、(C)是三个不同的实验，小肠干细胞的初始密度为1000个/24孔，其结果与控制组(以高等DMEM/F12培养基培养，其结果具有116个/孔小肠干细胞(平均值))做比较；
图5为小肠干细胞在无血清培养环境下的生长情形，其中，小肠干细胞的初始密度为1000个/24孔，该结果以3个实验的平均值表示，且横杆表示其标准差；
图6为以定量PCR测试小肠干细胞标志基因的相对表达量，收集在各培养基中培养7日的小肠干细胞以进行基因表达分析；(A)在6种不同培养基中Lgr5基因的表达量；(B)Bmi1基因的表达量；(C)Msi1基因的表达量；(D)PTEN基因的表达量；(E)CD24基因的表达量；(F)CD44基因的表达量，将其结果与控制组(新分离的小肠干细胞)做比较，且以小鼠的GAPDH作为内部控制组，又利用2-ΔΔCT方法计算其倍数诱发值(fold-inductionvalue)，且利用GAPDH标准化各该基因的表达情形；
图7为以Lgr5抗体标示的流式细胞仪分析图，其显示小肠干细胞在不同培养基中培养7日后，以Lgr5抗体标记的萤光强度；相较于新分离的小肠干细胞(图中标示为C者)，于(A)在高等DMEM/F12培养基(含胎牛血清)，图中标示为Adv.-Lgr5者、(B)本发明的最佳培养基(含胎牛血清)，图中标示为M-Lgr5者及(C)本发明的最佳培养基(不含胎牛血清)中，图中标示为SF-M-Lgr5者，该小肠干细胞的Lgr5表达量均上升；
图8为CD24抗体的流式细胞仪分析图，其显示小肠干细胞在不同培养基中培养7日后，以CD24抗体标记的萤光强度；相较于新分离的小肠干细胞(图中标示为C者)，于(A)在高等DMEM/F12培养基(不含胎牛血清)，图中标示为Adv.-CD24者及(B)本发明的最佳培养基(不含胎牛血清)，图中标示为SF-M-CD24者；
图9为CD44抗体的流式细胞仪分析图，其显示小肠干细胞在不同培养基中培养7日后，以CD44抗体标记的萤光强度；相较于新分离的小肠干细胞(图中标示为C者)，于(A)在高等DMEM/F12培养基(不含胎牛血清)，图中标示为Adv.-CD44者及(B)本发明的最佳培养基(不含胎牛血清)，图中标示为SF-M-CD44者；以及
图10为在不同培养基配方(高等DMEM/F12培养基、一般DMEM/F12培养基及本发明的最佳培养基)中以及包含或不包含胎牛血清环境下，小肠干细胞的类肠状物的细胞型态。
具体实施方式
以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，该领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的优点及功效。本发明亦可通过其它不同的实施方式加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不悖离本发明所揭示的精神下赋予不同的修饰与变更。
本发明提供一种用于体外培养小肠干细胞的培养基，其包括基础培养液、转铁蛋白、乙醇胺、抗坏血酸盐、谷胱甘肽以及亚硒酸钠。该基础培养液为选自细胞培养相关技术领域中常用者，例如DMEM培养基、DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基及Eagle’s培养基等。
本发明自公知高等DMEM/F12培养基中所包含的9种生长因子(例如：抗坏血酸磷酸酯、AlbuMAXII、人转铁蛋白、重组胰岛素全链、谷胱甘肽单钠、偏钒酸铵、氯化锰、亚硒酸钠及乙醇胺)筛选出培养小肠干细胞的最适成分，该最适成分包括转铁蛋白、乙醇胺、抗坏血酸盐、谷胱甘肽及亚硒酸钠，之后，再以部分析因设计法及SPSS软件得出各最适成分的浓度，以得出“最佳培养基”，该最佳培养基包含基础培养液、转铁蛋白、乙醇胺、抗坏血酸盐、谷胱甘肽以及亚硒酸钠。该基础培养液选自培养细胞相关技术领域中常用者，例如自由DMEM培养基、DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基及Eagle’s培养基等。
于本发明的一具体实施例中，通过显微镜观察及小肠干细胞标志基因的表达，显示出以公知的高等DMEM/F12(含有胎牛血清)培养基培养的小肠干细胞，可以保持该小肠干细胞在未分化阶段的类肠状物形态，并维持其干细胞的分子生物学特性，而以最佳培养基培养者(不含胎牛血清)，可得到更多的类肠状物，且其小肠干细胞标志基因的表达量亦上升，表示本发明的最佳培养基可提供小肠干细胞更佳的生长环境，并维持其未分化的细胞型态及干性胞特性，且不含血清，对于临床上的应用更具潜力。
本发明说明书中所提及的“抗坏血酸、或其盐、或其酯”意指包含抗坏血酸、抗坏血酸盐(例如：钠盐、镁盐、钙盐等)及抗坏血酸酯。其中，该抗坏血酸、或其盐、或其酯最佳选自抗坏血酸磷酸酯。
本发明说明书中所提及的“谷胱甘肽或其盐”意指包含谷胱甘肽及谷胱甘肽盐(例如：钠盐、镁盐、钙盐等)。其中，该谷胱甘肽盐最佳选自谷胱甘肽单钠。
实施例
实施例1小肠干细胞的分离及体外培养
将重量大约50至60克(g)、3周大的C57BL/6JNarl小鼠(NLAC台湾)牺牲后取出其小肠并以冷磷酸盐缓冲液(phosphate-bufferedsaline，简称PBS)(Hyclone,美国(USA))冲洗，将该小肠切成5毫米(mm)的片状物并纵向展开后移入含有3毫摩尔(mM)乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，简称EDTA)(Sigma,USA)及2％庆大霉素(gentamicin)(GIBCO,USA)的PBS中，以定轨摇床(orbitalshaker)在4℃下振动30分钟。再手持振动30秒后，将该小肠组织片状物移入冷PBS中，再以定轨摇床振动5分钟。接着将该小肠组织于漩涡搅拌器(vortex)上振动以使该小肠组织中的小肠干细胞因震荡而释入于溶液中，再通过70微米(μm)过滤器过滤，将该过滤液在4℃下以200g离心10分钟后获得小肠干细胞沉淀物。
以高等DMEM/F12培养基(GIBCO,USA)将该小肠干细胞沉淀物重新悬浮，将5000个初始小肠干细胞种入含有层连结蛋白(laminin)的基质胶(matrigel)(BDBiosciences,USA)的12孔盘中，并以补充有2mML-谷胱甘肽(L-glutamine)(Sigma,USA)、100单位/毫升(units/mL)的盘尼西林(Gibco,USA)、100毫克/毫升(μg/mL)的链霉素(Gibco,USA)及2％胎牛血清(Fetalbovineserum，简称FBS)(Hyclone,USA)的高等DMEM/F12培养基覆盖，另外再加入50纳克/毫升(ng/ml的上皮生长因子(Epidermalgrowthfactor，简称EGF)(R&Dsystems,USA)、500ng/ml的R-反应蛋白(spondin)、100ng/ml的头蛋白(Noggin)(PeproTechECLtd,USA)、1μMJag-1胜肽(Anaspec,USA)、2.5ng/mlWnt3a(Sigma,USA)及10μMY-27632(Sigma,USA)进行体外培养。该小肠干细胞均培养7至14天，每3天更换培养液。
统计分析
各数据以T检验(Student’st-test)分析，并以p值<0.05认定为具有统计学显著性。
实施例2小肠干细胞在体外(invitro)的生长情形
本实施例以高等DMEM/F12培养基及2％胎牛血清于体外培养小肠干细胞，并观察其生长情形。将小肠干细胞种入培养基后，该小肠干细胞会快速的从常态小肠腺窝构造转变成球体结构(spheroidstructure)的肠球体(enterosphere)；继续培养时，该肠球体转变成充满凋亡细胞(apoptoticcells)的类肠状物；该类肠状物具有绒毛区域(villusdomain)及不断继续出芽的腺窝区域(cryptdomain)。
如图1所示，使用包含2％胎牛血清的高等DMEM/F12培养基可持续培养小肠干细胞30至45天，直到形成类肠状物的结构。本实施例的结果显示，经由上述实施例1所分离的小肠干细胞确实具有干细胞活性，而且该小肠干细胞功能在以高等DMEM/F12培养基及2％胎牛血清的体外培养基中可以持续维持没有丧失。
实施例3培养小肠干细胞的培养基最适成分分析
1.第一次筛选：
本步骤测试12种不同的培养基，其详细组成分及浓度如表1及表2所示，以测试在分别除去9种生长因子的高等DMEM/F12培养基培养时，该小肠干细胞生长的影响。将实施例1分离所得的小肠干细胞种入各种不同培养基中，培养7天后计算各孔盘中类肠状物形成的数量。
表1、包含在高等DMEM/F12培养基中但不涵盖于一般DMEM/F12培养基的9种生长因子
生长因子 浓度(mM)
抗坏血酸磷酸酯(Ascorbic Acid phosphate) 8.63×10-3
AlbuMAX II 1.3815
人转铁蛋白(Holo)(Human Transferrin(Holo)) 9.74×10-5
重组胰岛素全链(Insulin Recombinant Full Chain) 1.72×10-3
谷胱甘肽单钠(Glutathione,monosodium) 3.26×10-3
偏钒酸铵(Ammonium Metavanadate) 2.6×10-6
氯化锰(Manganous Chloride) 3×10-7
亚硒酸钠(Sodium Selenite) 2.89×10-5
乙醇胺(Ethanolamine) 0.0195
表2、用于小肠干细胞培养的12种细胞培养基的设计
培养基编号 描述
1 高等DMEM/F12培养基(控制组)
2 一般DMEM/F12培养基(-ve GM)
3 一般DMEM/F12培养基+9种生长因子(+ve GM)
4 (+ve GM)扣除抗坏血酸酯
5 (+ve GM)扣除AlbuMAX II
6 (+ve GM)扣除人转铁蛋白
7 (+ve GM)扣除重组胰岛素全链
8 (+ve GM)扣除谷胱甘肽单钠
9 (+ve GM)扣除偏钒酸铵
10 (+ve GM)扣除氯化锰
11 (+ve GM)扣除亚硒酸钠
12 (+ve GM)扣除乙醇胺
-veGM：一般DMEM/F12培养基
+veGM：一般DMEM/F12培养基加入表1所列的9种生长因子
如图2所示，在控制组(即将小肠干细胞培养于高等DMEM/F12培养基)中，类肠状物形成的数量为每孔306±5.7个，而培养基在缺乏转铁蛋白、偏钒酸铵及乙醇胺时，其类肠状物形成数量明显减少至分别为每孔232±2.6、207±27.8及199±51.5个；而培养基在缺乏抗坏血酸酯、谷胱甘肽单钠及亚硒酸钠的实验组中，其结果显示该培养基在缺乏抗坏血酸、谷胱甘肽及亚硒酸钠时，其类肠状物形成数量减少至分别为每孔273.7±3.2、269.0±3.6及241.3±75.4个，对于类肠状物的形成数量上显示影响较小；而当培养基在缺乏AlbuMAXII、重组胰岛素全链及氯化锰的实验组中，其类肠状物形成数量分别为每孔261.3±49.0、275.0±18.0及265.7±12.5个，其结果显示对于类肠状物的形成数量上仅有轻微的影响，虽然经由图2结果可知，在缺乏AlbuMAXII及氯化锰这两组中的数据，平均值较缺乏抗坏血酸及谷胱甘肽低，但是其标准差也较大，统计的后发现其差别不具显著意义，所以不选择AlbuMAXII及氯化锰这两个因子进行第二次的筛选。因此，经第一次筛选的结果获得6种具有影响类肠状物形成的生长因子，即转铁蛋白、偏钒酸铵、乙醇胺、抗坏血酸、谷胱甘肽钠及亚硒酸钠。
2.第二次筛选
将上述第一次筛选所获得6种影响类肠状物形成的生长因子，在减少部分实验组数为目的下，经由一般常见的工程实验设计技术及应用软件(例如：designexpertsoftware)计算下，获得2(6-2)部分析因设计法设计培养小肠干细胞的最适组成分，该设计模型如表3所示，再通过SPSS(StatisticalPackagefortheSocialScience)执行收集自部分析因设计法所获得的实验数据，以获得一阶回归模型(first-orderregressionmodel)，该模式采用下列方程式：
小肠干细胞(类肠状物/孔)＝α0+∑αixi
其中，α及αi为固定系数，且xi为待试验的培养基成分的编码变因。该模型的固定系数可提供建构该最速上升途径(thesteepestascentpath)的信息以获得用于培养小肠干细胞的培养基的最适组成分浓度。详言之，该固定系数越大，其相对应的组成分有越重要的影响，若出现负值，则表示其相对应的组成分具有抑制的效果。后续实验即以此回归模型所显现的梯度为基础，以得出类肠状物数量最大化的方向进行。
表3、利用2(6-2)部分析因设计的模型及实验结果
-1:未加入；+1:添加所指示的浓度(n＝3).
表4、部分析因设计的分析结果显示各生长析因的平均影响
如图3及表4结果所示，该结果是以部分析因设计法得出的16种培养基组成模式，相较于控制组(高等DMEM/F12培养基及+veGM)，发现转铁蛋白、乙醇胺、抗坏血酸磷酸酯、谷胱甘肽单钠及亚硒酸钠此5种成分，对于小肠干细胞的生长具有显著的影响，故以上述五种成分作为培养该小肠干细胞的最适组成分。
3.第三次筛选：
以第二次筛选所获得的5种最适组成分进行最速上升途径，通过该途径以最少的实验次数找出培养小肠干细胞组成分的最适浓度。
如表5及图4所示，由步骤10的结果可知，培养基中转铁蛋白、乙醇胺、抗坏血酸磷酸酯、谷胱甘肽单钠以及亚硒酸钠的浓度在分别为1.08×10-2mM、5mM、0.617mM、0.647mM及6.5×10-3mM时，结果获得每孔形成90±33.8个类肠状物(平均值)，相较于控制组(以高等DMEM/F12培养基培养)每孔形成116±41.6个类肠状物(平均值)，可知步骤10的培养基对于类肠状物的形成数量并无助益。而在第5步骤时，以浓度分别为5.4×10-3mM、1.5mM、0.185mM、0.194mM及1.95×10-3mM的转铁蛋白、乙醇胺、抗坏血酸磷酸酯、谷胱甘肽单钠以及亚硒酸钠所构成的培养基培养小肠干细胞，其结果获得每孔形成146±50.2个类肠状物，相较于控制组(以高等DMEM/F12培养基培养)每孔形成116±41.6个类肠状物。以下将此组成成分及浓度的培养基称作“最佳培养基”。
表5、根据最速上升途径所得出的培养基组成分浓度
4.第四次筛选：
本步骤测定无胎牛血清培养环境下对于小肠干细胞生长的影响。如表6所示，设计6种不同培养基以测定根据上述第三次筛选所得的最佳培养基，在无胎牛血清环境下，对小肠干细胞的生长影响。本测试在24孔盘中进行。
表6、用于培养小肠干细胞的无胎牛血清培养基
编号 培养基
1 含胎牛血清-高等DMEM/F12培养基(Adv.)
2 无胎牛血清-高等DMEM培养基(Adv.SF)
3 含胎牛血清-一般DMEM/F12培养基(-ve GM)
4 无胎牛血清-一般DMEM/F12(-ve GM.SF)
5 含胎牛血清-最佳培养基(Opt.)
6 无胎牛血清-最佳培养基(SF-ISC)
如图5所示，小肠干细胞在本发明的最佳培养基中(含胎牛血清)形成每孔235±17.6个类肠状物，其结果大于于控制组培养基(含胎牛血清的高等DMEM/F12培养基)的每孔194±31.7个类肠状物。此外，以本发明的最佳培养基(无胎牛血清)培养小肠干细胞，其结果显示与高等DMEM/F12培养基(包含或不包含胎牛血清)的控制组具有类似的生长模式。此结果表示本发明的最佳培养基在不包含胎牛血清的情况下，较其它种类培养基(包含或不包含胎牛血清)，可使小肠干细胞获得较佳的生长结果。
实施例4经培养后的小肠干细胞标志的基因表达
以实时定量逆转录酶-聚合酶链反应(real-timequantitativeRT-PCR)测试本发明的最佳培养基(含或不含血清)，是否可以在培养过程中维持小肠干细胞的自我更新(self-renewal)及其分化能力。
1.选择小肠干细胞标志基因：
本实施例选用先前研究所揭示的小肠干细胞标志基因，其包括RNA结合蛋白武藏同源物1(RNA-bindingproteinMusashihomolog1，简称Msi1)、多梳型复合蛋白Bmi1(PolycombcomplexproteinBmi1，简称Bmi1)、富含白胺酸重复序列的G-蛋白偶联受体5(Leucine-richrepeat-containingG-proteincoupledreceptor5，简称Lgr5)、磷酸酯酶及张力蛋白同源物(Phosphataseandtensinhomolog，简称PTEN)、CD24及CD44作为指针，观察经本发明的小肠干细胞培养基培养后，是否仍维持干细胞的特性。
2.定量聚合酶连锁反应
(1)萃取小肠干细胞的RNA
收取1×106小肠干细胞，利用变性剂-Trizol将细胞裂解，每一样品添加1ml，以破坏细胞结构并溶解蛋白质，使该细胞中的核内蛋白与核酸分离，并使RNA分解酶失去活性后，所得的细胞溶解液再以酸性的氯仿萃取，可有效将RNA分离到水层。将1mlTrizol溶液(Ambion,USA)加入样品并利用吸管来回吸取数次(pipeting)使其均质化。在室温下静置5分钟，使其完全与核蛋白复合体(nucleoproteincomplexes)分离。接着加入200μl的氯仿(Mallinckrodt,USA)，以手震荡试管30次使其均匀混和后，静置于室温下3分钟。再将该试管于13000rpm在4℃下离心30分钟，将上层的水层移至新的试管中并加入450μl异丙醇(Sigma,USA)以沉淀RNA，并将该试管以漩涡搅拌器震荡后，在室温下放置10分钟。之后于13000rpm下将该试管在4℃下离心30分钟，小心地取出上清液后，将所得RNA沉淀物以1ml75％乙醇-焦碳酸二乙酯水溶液(ethanol-diethylpyrocarbonatewater)(BioProtech,Taiwan)清洗。再将该沉淀物以漩涡搅拌器震荡后，于13000rpm下，在4℃下离心15分钟。小心地移除上清液后，将该沉淀物在室温下风干10分钟，干燥后，该沉淀物的颜色将从白色转为无色。此时，加入20μl的焦碳酸二乙酯水溶液使RNA溶解。最后将该RNA样品在50-60℃下加热10分钟后离心沉淀的。
(2)逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)
利用PrimeScriptTMRT试剂盒(TaKaRA,Japan)，其中该试剂如表7所示，进行逆转录酶-聚合酶链反应，将上述所得的RNA转录成互补DNA(complementaryDNA，简称cDNA)。将所得的cDNA稀释五倍以用于以下实验。
表7、RT-PCR试剂组成分
成分 体积(μl)
寡dT引物(Oligo dT primer)(50μM) 0.5
PrimeScript逆转录酶混和物 0.5
随机的6种含氮碱基(random 6mers)(100μM) 0.5
5倍PrimeScript缓冲液 2.0
总RNA(≥1μg) 6.5
焦碳酸二乙酯水溶液 0
总和 10.0
(3)SYBRGreen定量聚合酶链反应(QuantitativePCR)
使用Primer3软件设计所需的引物(primer)，其引物如表10所示，再利用KAPAFASTqPCR试剂盒(KapaBiosystems,USA)，该试剂盒的试剂及qPCR反应条件如表8及9所示，以进行实时聚合酶链反应(real-timePCR)，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，简称GAPDH)标准化mRNA的表达量，以测量mRNA的相对表达量。最后以ΔΔCT比较方法(ΔΔCcomparativemethod)分析各基因的表达情形。
表8、SYBRGreen定量聚合酶连锁反应试剂组成分
表9、SYBRGreen定量聚合酶连锁反应的反应条件
步骤 温度(℃) 时间(秒) 循环
酶活化 95 20 保持
变性 95 3 40
黏合/延展 60 30
表10、目标基因的引物序列
基因 序列(5’端→3’端)
LGR5 正向引物 GAGTCAACCCAAGCCTTAGTATCC
反向引物 CATGGGACAAATGCAACTGAAG
Bmi1 正向引物 CACCCACAGTTCCCTCACATT
反向引物 TCGAGGTCTACTGGCAAAGGA
Msi-1 正向引物 TGGTCGCTTTTATTTATTTTTGGAT
反向引物 CCGGAGGAGAGGGCAGAT
PTEN 正向引物 AATTCCCAGTCAGAGGCGCTATGT
反向引物 GATTGCAAGTTCCGCCACTGAACA
CD24 正向引物 GAAAGGGGGCTTGGTTCTAC
反向引物 GTAGCTTCGGGTCTGTGAGC
CD44 正向引物 GCCTCAACTGTGCACTCAAA
反向引物 GTGTTTCAGGGGTGGTCATC
GAPDH 正向引物 TGCACCACCAACTGCTTA
反向引物 GGATGCAGGGATGATGTTC
如图6A至6F结果所示，于本发明的最佳培养基中(包含或不包含胎牛血清)培养一星期，小肠干细胞的Lgr5基因表达量，均高于刚分离出的小肠干细胞；而于本发明的最佳培养基(含胎牛血清)中培养的小肠干细胞的Lgr5基因表达量，则较培养于高等DMEM/F12者(含胎牛血清)多出一倍；另外，在本发明的最佳培养基(无胎牛血清)培养的小肠干细胞的Lgr5基因表达量，又比培养于高等DMEM/F12者(无胎牛血清)多出二倍。于本发明的最佳培养基(包含或不包含胎牛血清)培养的小肠干细胞的Bmi1、PTEN及CD24基因表达量，均分别较培养于高等DMEM/F12者(包含或不包含胎牛血清)为多。然而，于本发明的最佳培养基(包含胎牛血清)中培养的小肠干细胞的Msi1基因表达量，相较于培养于高等DMEM/F12者(包含胎牛血清)轻微地减少，但在本发明的最佳培养基(无血清)及高等DMEM/F12(无血清)培养的小肠干细胞的Msi1基因表达量则相近。另一方面，于本发明的最佳培养基(包含或不包含胎牛血清)培养的小肠干细胞的CD44基因表达，均高于培养于高等DMEM/F12者(包含或不包含胎牛血清)。综上，本测试结果显示于本发明的最佳培养基(包含或不包含胎牛血清)中培养小肠腺窝细胞，可维持小肠干细胞的再生性及分化能力。
实施例5以流式细胞仪分析小肠干细胞表面抗原标记
本实施例以Lgr5、CD24及CD44抗体标记自类肠状物所分离的细胞，并以BD的C6流式细胞仪分析。小肠干细胞培养至第7天时，将各孔中的类肠状物收集并以机械方法将其消化分解成单一细胞。取密度为1×106的细胞，将该细胞以PBS清洗后，以2000rpm离心5分钟，除去上清液后将沉淀物重新悬浮于500μlPBS。之后，加入10μl的Lgr5初级抗体(Abgent,USA)并在4℃下避光反应90分钟。反应后，再将该样品以PBS清洗后，以2000rpm离心5分钟，除去上清液，再将沉淀物重新悬浮于500μlPBS中。接着，加入4μl的萤光异硫氰酸盐(Fluoresceinisothiocyanate，简称FITC)所结合的羊抗兔(FITC-conjugatedgoat-anti-rabbit)次级抗体(BDBiosciences,USA)，并在4℃下避光反应40分钟。再将该样品以PBS清洗后以2000rpm离心5分钟，除去上清液后将沉淀物重新悬浮于500μlPBS，并直接以BDC6流式细胞仪分析。在CD24及CD44标记的试验中，使用如上述标记方法进行试验，但分别加入4μlCD24及12μlCD44并在4℃下避光反应30分钟。最后以流式细胞仪进行样品的分析。
如图7所示，相较于刚分离的小肠干细胞，于本发明的最佳培养基中(包含或不包含胎牛血清)培养的小肠干细胞的Lgr5蛋白质表达量显著的增加。同样地，如图8所示，相较于刚分离的小肠干细胞，于本发明的最佳培养基中(无胎牛血清)中培养的小肠干细胞的CD24蛋白质表达量亦显著的增加。然而，如图9所示，于本发明的最佳培养基(无胎牛血清)中培养的小肠干细胞的CD44的蛋白质表达量，相较于培养在高等DMEM/F12者(无胎牛血清)，只有些微地增加。因此，此结果确认本发明的最佳培养基(包含或不包含胎牛血清)可维持小肠干细胞体外培养时的增生、再生性及分化能力。
实施例6小肠干细胞在无血清环境中的培养及其细胞型态
本实施例测试小肠干细胞在无血清环境中培养，可与于含血清环境中培养形成相同的细胞型态。将小肠干细胞分别于高等DMEM/F12培养基(包含或不包含胎牛血清)、一般DMEM/F12培养基(包含或不包含胎牛血清)及本发明的最佳培养基(包含或不包含胎牛血清)培养7日后，观察其细胞型态。
如图10所示，所有的小肠干细胞的类肠状物均形成一样的细胞型态，表示于本发明的最佳培养基及无血清环境中培养的小肠干细胞，并不会形成不良的细胞型态。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何该领域技术人员均可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，举凡所属技术领域中具有此项专业知识者，在未脱离本发明所揭示的精神与技术原理下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由权利要求书所涵盖。

Claims (13)

1.一种用于体外培养小肠干细胞的培养基，包含：
基础培养液；
转铁蛋白；
乙醇胺，其中，乙醇胺于该培养基中的浓度范围为0.5mM至小于5mM；
抗坏血酸、或其盐、或其酯；
谷胱甘肽或其盐；以及
亚硒酸钠。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，还包含胎牛血清或胎牛血清衍生物。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，该基础培养液选自由DMEM培养基、DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基及Eagle’s培养基所组成组的至少一种。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，该转铁蛋白于该培养基中的浓度范围为1.8×10-3mM至小于1.8×10-2mM。
5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，该抗坏血酸、或其盐或其酯于该培养基中的浓度范围为0.05mM至小于0.617mM。
6.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，该谷胱甘肽或其盐于该培养基中的浓度范围为0.05mM至小于0.647mM。
7.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，该亚硒酸钠于该培养基中的浓度范围为5×10-4mM至小于6.5×10-3mM。
8.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，经该培养基培养的小肠干细胞仍保持其自我更新性及干细胞特性。
9.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，经该培养基培养的小肠干细胞对于Msi1、Bmi1、Lgr5、PTEN、CD24及CD44的一种或多种为阳性。
10.一种体外培养小肠干细胞的方法，包含使用权利要求1所述的培养基培养小肠干细胞。
11.权利要求10所述的方法，其特征在于，该培养基进一步包含胎牛血清或胎牛血清衍生物。
12.权利要求10所述的方法，其特征在于，经该培养基培养的小肠干细胞仍保持其自我更新性及干细胞特性。
13.权利要求10所述的方法，其特征在于，经该培养基培养的小肠干细胞对于Msi1、Bmi1、Lgr5、PTEN、CD24及CD44的一种或多种为阳性。
CN201510208071.5A 2014-05-08 2015-04-28 体外小肠干细胞培养基及培养方法 Pending CN105087459A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW103116366 2014-05-08
TW103116366A TWI522467B (zh) 2014-05-08 2014-05-08 體外小腸幹細胞培養基及培養方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105087459A true CN105087459A (zh) 2015-11-25

Family

ID=54568795

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510208071.5A Pending CN105087459A (zh) 2014-05-08 2015-04-28 体外小肠干细胞培养基及培养方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN105087459A (zh)
TW (1) TWI522467B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111849860A (zh) * 2020-06-01 2020-10-30 浙江大学 一种利用铁元素调控肠道干细胞分化的方法及应用
CN113450868A (zh) * 2020-11-26 2021-09-28 东莞太力生物工程有限公司 一种基于培养指标评价的基础培养基开发方法
CN116121178A (zh) * 2022-12-18 2023-05-16 广东格林邦卡新材料生物科技有限公司 肠道干细胞及其在改善肠道微环境以及抗肠道衰老中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012168930A2 (en) * 2011-06-10 2012-12-13 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen (Knaw) Culture media for stem cells
CN103060264A (zh) * 2012-12-20 2013-04-24 上海市第十人民医院 一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012168930A2 (en) * 2011-06-10 2012-12-13 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen (Knaw) Culture media for stem cells
CN103060264A (zh) * 2012-12-20 2013-04-24 上海市第十人民医院 一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DHARAM P.CHOPRA等: "Intestinal Epithelial Cells In Vitro", 《STEM CELLS AND DEVELOPMENT》 *
MOTOHIRO YAMAUCHI等: "A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation", 《JOURNAL OF RADIATION RESEARCH》 *
平晓春等: "肠黏膜更新的源泉——小肠干细胞", 《中华细胞与干细胞杂志》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111849860A (zh) * 2020-06-01 2020-10-30 浙江大学 一种利用铁元素调控肠道干细胞分化的方法及应用
CN111849860B (zh) * 2020-06-01 2021-12-21 浙江大学 一种利用铁元素调控肠道干细胞分化的方法及应用
CN113450868A (zh) * 2020-11-26 2021-09-28 东莞太力生物工程有限公司 一种基于培养指标评价的基础培养基开发方法
CN116121178A (zh) * 2022-12-18 2023-05-16 广东格林邦卡新材料生物科技有限公司 肠道干细胞及其在改善肠道微环境以及抗肠道衰老中的应用
CN116121178B (zh) * 2022-12-18 2023-09-19 深圳迈吉赛尔生物科技有限公司 肠道干细胞及其在改善肠道微环境以及抗肠道衰老中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
TWI522467B (zh) 2016-02-21
TW201542817A (zh) 2015-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6948261B2 (ja) 多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞の凍結保存方法
Krishnan et al. Dynamic interaction between breast cancer cells and osteoblastic tissue: comparison of two‐and three‐dimensional cultures
Xue et al. Retinal organoids on-a-chip: a micro-millifluidic bioreactor for long-term organoid maintenance
CN102147417B (zh) 苹果属植物生长素免疫组织定位的方法及其应用
US20190185818A1 (en) Novel chicken egg-based metastasis model for cancer
CN102822333A (zh) 监控干细胞的分化状态的方法
WO2014061244A1 (ja) 毒性スクリーニング方法
CN110373388A (zh) 一种用于类器官培养的培养基及类器官培养方法
Bouchalova et al. Current methods for studying metastatic potential of tumor cells
KR20180130121A (ko) 오가노이드 배양을 위한 조성물 및 방법
US20210189351A1 (en) Epithelial cell spheroids
CN105087459A (zh) 体外小肠干细胞培养基及培养方法
CN107075443A (zh) 三维细胞培养系统和使用该系统的细胞培养方法
CN104673743A (zh) 一种从动物组织中获得原代细胞的组织块培养方法
US6998264B2 (en) Replication of biological tissue
Bulut et al. Three‐Dimensional Vessels‐on‐a‐Chip Based on hiPSC‐derived Vascular Endothelial and Smooth Muscle Cells
JP7097942B2 (ja) 細胞培養
US20130196349A1 (en) In Vitro Tumor Metastasis Model
CN102471761A (zh) 获得肌成纤维细胞的方法
US20230077412A1 (en) 3d printed micro-millifluidic bioreactors for long-term retinal organoid maintenance
CN102057037A (zh) 平滑肌干细胞的分离方法
JP6265385B2 (ja) アミノ酸製剤による細胞増幅法
RU2517112C2 (ru) Способ культивирования мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга
Wiegand Pancreatic Islet Microphysiology System for Disease Modeling of Type 2 Diabetes
Jaime-Rodríguez et al. Are genetic drift and stem cell adherence in laboratory culture issues for cultivated meat production?

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20151125