TW201542817A - 體外小腸幹細胞培養基及培養方法 - Google Patents
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Abstract
一種用於體外培養小腸幹細胞之培養基，包含基礎培養液；運鐵蛋白；乙醇胺；抗壞血酸、或其鹽、或其酯；麩胱甘肽或其鹽及亞硒酸鈉，其中，該乙醇胺於該培養基中之濃度範圍為0.5mM至小於5mM。本發明進一步提供一種體外培養小腸幹細胞之方法，其方法包含將所分離之小腸幹細胞培養於本發明之培養基中。
Description
本發明係關於一種小腸幹細胞之培養基，尤係關於一種用於體外培養小腸幹細胞之培養基及培養方法。
幹細胞存在於許多哺乳類組織當中，其具有自我更新(self-renewal)及分化(differenciation)的能力。其中，腸組織主要係由小腸及結腸所組成，小腸的內層在解剖學上稱作黏膜(mucosa)，該黏膜會朝著腸內腔的方向凸出呈長條狀，又稱為絨毛(villi)，而腺窩(crypt)則位於絨毛附近，小腸幹細胞(Intestinal stem cells，簡稱ISCs)存在於小腸腺窩(crypt)底端，其具有分化成轉變放大細胞(transit amplifying cell，簡稱TC細胞)的能力，該細胞會更進一步分化為二種主要細胞類型，包括吸收(absorptive)系統及分泌(secretory)系統。小腸幹細胞是一種有潛力的幹細胞，然而，小腸幹細胞的分離及增殖常面臨缺乏生物標記及有效長期培養方法的困境，良好的培養系統需維持小腸幹細胞的增生及分化能力。先前研究描述了一種能長期培養並維持小腸幹細胞特性的體外長期培養系統，該系統係使用市
面上所購得的已添加必要生長因子之高等DMEM/F12(advanced DMEM/F12)培養基，用以將小腸幹細胞培養在三維培養基中，該小腸幹細胞會形成類器官(organoid)的腺窩-絨毛球狀結構。惟發展體外培養小腸幹細胞培養基對於臨床上之應用及小腸幹細胞的體外增殖培養技術仍有迫切的需要。
一種用於體外培養小腸幹細胞之培養基，該培養基包含基礎培養液；運鐵蛋白(transferrin)；乙醇胺(ethanolamine)；抗壞血酸、或其鹽、或其酯；麩胱甘肽或其鹽(glutathione)及亞硒酸鈉(sodium selenite)，其中，該乙醇胺於該培養基中之濃度範圍為0.5mM至小於5mM。
於本發明之一具體實施例中，該基礎培養液係選自由DMEM培養基、DMEM/F12培養基、RPMI1640培養基及Eagle’s培養基所組成之群組之至少一者。
於本發明之一具體實施例中，該運鐵蛋白於該培養基中之濃度範圍為1.8×10-3mM至小於1.8×10-2mM。
於本發明之一具體實施例中，該抗壞血酸、或其鹽、或其酯於該培養基中之濃度範圍為0.05mM至小於0.617mM。
於本發明之一具體實施例中，該麩胱甘肽或其鹽於該培養基中之濃度範圍為0.05mM至小於0.647mM。
於本發明之一具體實施例中，該亞硒酸鈉於該培養基中之濃度範圍為5×10-4mM至小於6.5×10-3mM。
於本發明之一具體實施例中，經該培養基培養之小腸幹細胞仍具有自我更新性(self-renewal)及幹細胞特性(stemness)。
於本發明之一具體實施例中，經該培養基培養之小腸幹細胞對於Msi1、Bmi1、Lgr5、PTEN、CD24及CD44的一者或多者為陽性。
本發明進一步提供一種體外培養小腸幹細胞之方法，該方法包含使用本發明之培養基以培養小腸幹細胞。
第1圖係小腸幹細胞體外培養的時程圖，其顯示以包含2%血清之高等DMEM/F12培養基培養可使小腸幹細胞長時間維持在尚未形成類腸狀物(enteroid)的階段，其中，圖中的數字表示培養的天數；第2圖係顯示不同生長因子對於體外培養小腸幹細胞之影響，其中，小腸幹細胞之初始密度為5000個/12孔，培養7日後計算每孔中類腸狀物形成的數量，該結果係以3個實驗的平均值表示，且橫桿表示其標準差；第3圖係顯示以部分因子設計(fractional factorial design，簡稱FFD)的篩選結果，以1000個/24孔小腸幹細胞的密度計算，該結果係以3個實驗的平均值表示，且橫桿表示其標準差，並與控制組(高等DMEM/F12培養基培養，其結果具有108個/孔小腸幹細胞)做比較；第4圖係依據「取得培養該小腸幹細胞最適組成成分之組成濃度之最速上升途徑」所得出培養小腸幹細胞之最
適組成成分之組成濃度及其實驗結果，其中，(A)、(B)、(C)係三個不同的實驗，(D)係該三個實驗的平均值，且橫桿表示標準差，又，小腸幹細胞之初始密度為1000個/24孔，其結果與控制組(以高等DMEM/F12培養基培養，其結果具有116個/孔小腸幹細胞)做比較；第5圖係為小腸幹細胞在無血清培養環境下之生長情形，其中，小腸幹細胞之初始密度為1000個/24孔，該結果係以3個實驗的平均值表示，且橫桿表示其標準差；第6圖係為以定量PCR測試小腸幹細胞標誌基因的相對表現量，收集在各培養基中培養7日的小腸幹細胞以進行基因表現分析；(A)在6種不同培養基中Lgr5基因的表現量；(B)Bmi1基因的表現量；(C)Msi1基因的表現量；(D)PTEN基因的表現量；(E)CD24基因的表現量；(F)CD44基因的表現量，又其結果係與控制組(新分離的小腸幹細胞)做比較，且以小鼠之GAPDH作為內部控制組，又利用2-△△CT方法計算其倍數誘發值(fold-induction value)，且利用GAPDH標準化各該基因之表現情形；第7圖係以Lgr5抗體標示之流式細胞儀分析圖，其顯示小腸幹細胞在不同培養基中培養7日後，以Lgr5抗體標記的螢光強度；相較於新分離的小腸幹細胞(圖中標示為C者)，於(A)在高等DMEM/F12培養基(含胎牛血清)，圖中標示為Adv.-Lgr5者、(B)本發明之最佳培養基(含胎牛血清)，圖中標示為M-Lgr5者及(C)本發明之最佳培養基(不含胎牛血清)中，圖中標示為SF-M-Lgr5者，該小腸幹細胞之Lgr5
表現量均上升；第8圖係為CD24抗體之流式細胞儀分析圖，其顯示小腸幹細胞在不同培養基中培養7日後，以CD24抗體標記的螢光強度；相較於新分離的小腸幹細胞(圖中標示為C者)，於(A)在高等DMEM/F12培養基(不含胎牛血清)，圖中標示為Adv.-CD24者及(B)本發明之最佳培養基(不含胎牛血清)，圖中標示為SF-M-CD24者；第9圖係為CD44抗體之流式細胞儀分析圖，其顯示小腸幹細胞在不同培養基中培養7日後，以CD44抗體標記的螢光強度；相較於新分離的小腸幹細胞(圖中標示為C者)，於(A)在高等DMEM/F12培養基(不含胎牛血清)，圖中標示為Adv.-CD44者及(B)本發明之最佳培養基(不含胎牛血清)，圖中標示為SF-M-CD44者；以及第10圖係在不同培養基配方(高等DMEM/F12培養基、一般DMEM/F12培養基及本發明之最佳培養基)中以及包含或不包含胎牛血清環境下，小腸幹細胞之類腸狀物的細胞型態。
以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此專業之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本發明之優點及功效。本發明亦可藉由其它不同之實施方式加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明所揭示之精神下賦予不同之修飾與變更。
本發明係提供一種用於體外培養小腸幹細胞之培養基，其係包括基礎培養液、運鐵蛋白(transferrin)、乙醇胺(ethanolamine)、抗壞血酸鹽(ascorbate)、麩胱甘肽(glutathione)以及亞硒酸鈉(sodium selenite)。該基礎培養液係選自細胞培養相關技術領域中所常用者，例如DMEM培養基、DMEM/F12培養基、RPMI1640培養基及Eagle’s培養基等。
本發明係自習知的高等DMEM/F12培養基中所包含之9種生長因子(例如：抗壞血酸磷酸酯、AlbuMAXII、人類運鐵蛋白、重組胰島素全鍊、麩胱甘肽單鈉、偏釩酸銨、氯化錳、亞硒酸鈉及乙醇胺)篩選出培養小腸幹細胞之最適成份，其最適成分包括運鐵蛋白、乙醇胺、抗壞血酸鹽、麩胱甘肽及亞硒酸鈉，之後，再以部分因子設計法及SPSS軟體得出各該最適成份之濃度，以得出「最佳培養基」，其最佳培養基包含基礎培養液、運鐵蛋白、乙醇胺、抗壞血酸鹽、麩胱甘肽以及亞硒酸鈉。該基礎培養液係選自培養細胞相關技術領域中所常用者，例如自由DMEM培養基、DMEM/F12培養基、RPMI1640培養基及Eagle’s培養基等。
於本發明之一具體實施例中，藉由顯微鏡觀察及小腸幹細胞標誌基因的表現，顯示出以習知的高等DMEM/F12(含有胎牛血清)培養基培養之小腸幹細胞，可以保持該小腸幹細胞在未分化階段的類腸狀物(enteroid)型態，並維持其幹細胞之分子生物學特性，而以最佳培養基培養者(不含胎牛血清)，可得到更多的類腸狀物，且其小
腸幹細胞標誌基因的表現量亦上升，表示本發明之最佳培養基可提供小腸幹細胞更佳的生長環境，並維其未分化的細胞型態及幹性胞特性，且不含血清，對於臨床上之應用更具潛力。
本發明說明書中所提及之「抗壞血酸、或其鹽、或其酯」係意指包含抗壞血酸、抗壞血酸鹽(例如：鈉鹽、鎂鹽、鈣鹽等)及抗壞血酸酯。其中，該抗壞血酸、或其鹽、或其酯最佳係選自抗壞血酸磷酸酯。
本發明說明書中所提及之「麩胱甘肽或其鹽」係意指包含麩胱甘肽及麩胱甘肽鹽(例如：鈉鹽、鎂鹽、鈣鹽等)。其中，該麩胱甘肽最佳係選自麩胱甘肽單鈉。
將重量大約50至60公克(g)、3周大的C57BL/6JNarl小鼠(NLAC臺灣)犧性後取出其小腸並以冷磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline，簡稱PBS)(Hyclone，美國(USA))沖洗，將該小腸切成5毫米(mm)的片狀物並縱向展開後移入含有3毫莫耳(mM)乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，簡稱EDTA)(Sigma,USA)及2%慶大黴素(gentamicin)(GIBCO,USA)的PBS中，以軌道型振動器(orbital shaker)在4℃下振動30分鐘。再以手持振動30秒後，將該小腸組織片狀物移入冷PBS中，再以軌道型振動器振動5分鐘。接著將該小腸組織於漩渦攪拌
器(vortex)上振動以使該小腸組織中的小腸幹細胞因震盪而釋入於溶液中，再通過70微米(μm)過濾器過濾，將該過濾液在4℃下以200g離心10分鐘後獲得小腸幹細胞沉澱物。
以高等DMEM/F12培養基(GIBCO,USA)將該小腸幹細胞沉澱物重新懸浮，將5000個初始小腸幹細胞種入含有層連結蛋白(laminin)的基質膠(matrigel)(BD Biosciences,USA)的12孔盤中，並以補充有2mM L-麩胱甘肽(L-glutamine)(Sigma,USA)、100單位/毫升(units/mL)之盤尼西林(Gibco,USA)、100毫克/毫升(μg/mL)之鏈黴素(Gibco,USA)及2%胎牛血清(Fetal bovine serum，簡稱FBS)(Hyclone,USA)之高等DMEM/F12培養基覆蓋，另外再加入50微克/毫升(ng/ml)之上皮生長因子(Epidermal growth factor，簡稱EGF)(R&D systems,USA)、500ng/ml之R-反應蛋白(spondin)、100ng/ml之頭蛋白(Noggin)(Pepro Tech EC Ltd,USA)、1μM Jag-1胜肽(Anaspec,USA)、2.5ng/ml Wnt3a(Sigma,USA)及10μM Y-27632(Sigma,USA)進行體外培養。該小腸幹細胞均培養7至14天，每3天更換培養液。
各數據係以學生t檢定(Student’s t-test)分析，並以p值<0.05認定為具有統計學上之顯著性。
本實施例以高等DMEM/F12培養基及2%胎牛血清於體外培養小腸幹細胞，並觀察其生長情形。將小腸幹細胞種入培養基後，該小腸幹細胞會快速的從常態小腸腺窩構造轉變成球體結構之(spheroid structure)之腸球體(enterosphere)；繼續培養時，該腸球體轉變成充滿凋零細胞(apoptotic cells)的類腸狀物(enteroid)；該類腸狀物具有絨毛區域(villus domain)及不斷繼續出芽的腺窩區域(crypt domain)。
如第1圖所示，使用包含2%胎牛血清之高等DMEM/F12培養基可持續培養小腸幹細胞30至45天，直到形成類腸狀物的結構。本實施例之結果顯示，經由上述實施例1所分離之小腸幹細胞確實具有幹細胞活性，而且該小腸幹細胞功能在以高等DMEM/F12培養基及2%胎牛血清之體外培養基中可以持續維持沒有喪失。
1.第一次篩選：
本實施例測試12種不同的培養基，其詳細組成分及濃度如表1及表2所示，以測試在分別除去9種生長因子之高等DMEM/F12培養基培養時，該小腸幹細胞生長之影響。將實施例1分離所得之小腸幹細胞種入各種不同培養基中，培養7天後計算各孔盤中類腸狀物形成的數量。
-ve GM：一般DMEM/F12培養基
+ve GM：一般DMEM/F12培養基加入表1所列之9種生長因子
如第2圖所示，在控制組(亦即將小腸幹細胞培養於高等DMEM/F12培養基)中，類腸狀物形成的數量為每孔306±5.7個，而培養基在缺乏運鐵蛋白、偏釩酸銨及乙醇胺
時，其類腸狀物形成數量明顯減少至分別為每孔232±2.6、207±27.8及199±51.5個；而培養基在缺乏抗壞血酸酯、麩胱甘肽單鈉及亞硒酸鈉的實驗組中，其結果顯示該培養基在缺乏抗壞血酸、麩胱甘肽及亞硒酸鈉時，其類腸狀物形成數量減少至分別為每孔273.7±3.2、269.0±3.6及241.3±75.4個，對於類腸狀物的形成數量上顯示影響較小；而當培養基在缺乏AlbuMAX II、重組胰島素全鏈及氯化錳的實驗組中，其類腸狀物形成數量分別為每孔261.3±49.0、275.0±18.0及265.7±12.5個，其結果顯示對於類腸狀物的形成數量上僅有輕微的影響，雖然經由第2圖之結果可知，在缺乏AlbuMAX II及氯化錳這兩組中的數據，平均值較缺乏抗壞血酸及麩胱甘肽低，但是其標準差也較大，統計之後發現其差別不具顯著意義，所以不選擇AlbuMAX II及氯化錳這兩個因子進行第二次的篩選。因此，經第一次篩選的結果獲得6種具有影響類腸狀物形成的生長因子，亦即運鐵蛋白、偏釩酸銨、乙醇胺、抗壞血酸、麩胱甘肽鈉及亞硒酸鈉。
2.第二次篩選
將上述第一次篩選所獲得6種影響類腸狀物形成的生長因子，在減少部分實驗組數為目的下，經由一般常見之工程實驗設計技術及應用軟體(例如：design expert software)計算下，獲得2(6-2)部分因子設計(fractional factorial design，簡稱FFD)法設計培養小腸幹細胞之最適組成分，
該設計模型係如表3所示，再藉由SPSS(Statistical Package for the Social Science)執行收集自部分因子設計法所獲得之實驗數據，以獲得一階迴歸模型(first-order regression model)，該模式採用下列方程式：小腸幹細胞(類腸狀物/孔)=α 0+Σ α i x i
其中，α及α i 係為固定係數，且x i 係為待試驗之培養基成分之編碼變因。該模型之固定係數可提供建構該最速上升途徑(the steepest ascent path)之資訊以獲得用於培養小腸幹細胞之培養基的最適組成分濃度。詳言之，該固定係數愈大，其相對應的組成分愈有重要的影響，若出現負值，則表示其相對應的組成分具有抑制的效果。後續實驗即係以此迴歸模型所顯現的梯度為基礎，以得出類腸狀物數量最大化的方向進行。
-1：未加入；+1：添加所指示的濃度(n=3).
如第3圖及第4圖結果所示，該結果係以部分因子設計法得出的16種培養基組成模式，相較於控制組(高等DMEM/F12培養基及+ve GM)，發現運鐵蛋白、乙醇胺、抗壞血酸磷酸酯、麩胱甘肽單鈉及亞硒酸鈉此5種成分，對於小腸幹細胞的生長具有顯著的影響，故以上述該五種成分作為培養該小腸幹細胞之最適組成分。
3.第三次篩選：
以第二次篩選所獲得之該5種最適組成分進行最速上升途徑，藉該途徑以最少的實驗次數找出培養小腸幹細胞組成分之最適濃度。
如表5及第4圖所示，在步驟1及步驟10之培養基組成分對於類腸狀物的形成數量上並無顯著差異，由步驟10之結果可知，培養基中在分別超過最適濃度為1.08×10-2mM、5mM、0.617mM、0.647mM及6.5×10-3mM之運鐵蛋白、乙醇胺、抗壞血酸磷酸酯、麩胱甘肽單鈉以及亞硒酸鈉時，對於類腸狀物的形成數量並無助益。而在第5步驟時，以濃度分別為5.4×10-3mM、1.5mM、0.185mM、0.194
mM及1.95×10-3mM之運鐵蛋白、乙醇胺、抗壞血酸磷酸酯、麩胱甘肽單鈉以及亞硒酸鈉所構成的培養基培養小腸幹細胞，其結果獲得每孔形成146±50.2個類腸狀物，相較於控制組每孔形成116±41.6個類腸狀物。以下將此組成成分及濃度之培養基稱作「最佳培養基」。
4.第四次篩選：
本實施例測定無胎牛血清培養環境下對於小腸幹細胞
生長的影響。如表6所示，設計6種不同培養基以測定根據上述第三次篩選所得之最佳培養基，在無胎牛血清環境下，對小腸幹細胞之生長影響。本測試係在24孔盤中進行。
如第5圖所示，小腸幹細胞在本發明之最佳培養基中(含胎牛血清)形成每孔235±17.6個類腸狀物，其結果係大於於控制組培養基(含胎牛血清之高等DMEM/F12培養基)之每孔194±31.7個類腸狀物。此外，以本發明之最佳培養基(無胎牛血清)培養小腸幹細胞，其結果顯示與高等DMEM/F12培養基(包含或不包含胎牛血清)之控制組具有類似的生長模式。此結果表示本發明之最佳培養基在不包含胎牛血清之情況下，較其他種類培養基(包含或不包含胎牛血清)，可使小腸幹細胞獲得較佳之生長結果。
以即時定量反轉錄酶-聚合酶連鎖反應(real-time quantitative RT-PCR)測試本發明之最佳培養基(含或不含血清)，是否可以在培養過程中維持小腸幹細胞之自我更新(self-renewal)及其分化能力。
1.選擇小腸幹細胞標誌基因：
本實施例選用先前研究所揭示之小腸幹細胞標誌基因，其包括RNA結合蛋白武藏同源物1(RNA-binding protein Musashi homolog 1，簡稱Msi1)、多梳型複合蛋白Bmi1(Polycomb complex protein Bmi1，簡稱Bmi1)、富含白胺酸重複序列之G-蛋白偶聯受體5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5，簡稱Lgr5)、磷酸酯酶及張力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homolog，簡稱PTEN)、CD24及CD44作為指標，觀察經本發明之小腸幹細胞培養基培養後，是否仍維持幹細胞之特性。
2.定量聚合酶連鎖反應
(1)萃取小腸幹細胞的RNA
收取1×106小腸幹細胞，利用變性劑-Trizol將細胞裂解，每一樣品添加1ml，藉以破壞細胞結構並溶解蛋白質，使該細胞中之核內蛋白與核酸分離，並使RNA分解酶失去活性後，所得之細胞溶解液再以酸性之氯仿(chloroform)萃取，可有效將RNA分離到水層。將1ml Trizol溶液(Ambion,
USA)加入樣品並利用吸管來回吸取數次(pipeting)使其均質化。在室溫下靜置5分鐘，使其完全與核蛋白複合體(nucleoprotein complexes)分離。接著加入200μl的氯仿(Mallinckrodt,USA)，以手震盪試管30次使其均勻混和後，靜置於室溫下3分鐘。再將該試管於13000rpm在4℃下離心30分鐘，將上層之水層移至新的試管中並加入450μl異丙醇(isopropanol)(Sigma,USA)以沉澱RNA，並將該試管以漩渦攪拌器震盪後，在室溫下放置10分鐘。之後於13000rpm下將該試管在4℃下離心30分鐘，小心地取出上清液後，將所得RNA沉澱物以1ml 75%乙醇-焦碳酸二乙酯水溶液(ethanol-diethylpyrocarbonate water)(Bio Protech,Taiwan)清洗。再將該沉澱物以漩渦攪拌器震盪後，於13000rpm下，在4℃下離心15分鐘。小心地移除上清液後，將該沉澱物在室溫下風乾10分鐘，乾燥後，該沉澱物的顏色將從白色轉為無色。此時，加入20μl的焦碳酸二乙酯水溶液使RNA溶解。最後將該RNA樣品在50-60℃下加熱10分鐘後離心沉澱之。
(2)反轉錄酶-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)
利用PrimeScriptTM RT試劑套組(TaKaRA,Japan)，其中該試劑係如表7所示，進行反轉錄酶-聚合酶連鎖反應，將上述所得之RNA轉錄成互補DNA(complementary DNA，簡稱cDNA)。將所得之cDNA稀釋五倍以用於以下實驗。
(3)SYBR Green定量聚合酶連鎖反應(Quantitative PCR)
使用Primer3軟體設計所需的引子(primer)，其引子係如表10所示，再利用KAPA SYBR® FAST qPCR套組(Kapa Biosystems,USA)，其套組的試劑及qPCR反應條件係如表8及9所示，以進行即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)，並以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，簡稱GAPDH)標準化mRNA的表現量，以測量mRNA之相對表現量。最後以△△CT比較方法(△△C comparative method)分析各基因之表現情形。
如第6圖A至F結果所示，於本發明之最佳培養基中(包含或不包含胎牛血清)培養一星期，小腸幹細胞的Lgr5基因表現量，均高於剛分離出的小腸幹細胞；而於本發明之最佳培養基(含胎牛血清)中培養的小腸幹細胞之Lgr5基因表現量，則較培養於高等DMEM/F12者(含胎牛血清)多出一倍；另外，在本發明之最佳培養基(無胎牛血清)培養
的小腸幹細胞之Lgr5基因表現量，又比培養於高等DMEM/F12者(無胎牛血清)多出二倍。於本發明之最佳培養基(包含或不包含胎牛血清)培養的小腸幹細胞之Bmi1、PTEN及CD24基因表現量，均分別較培養於高等DMEM/F12者(包含或不包含胎牛血清)為多。然而，於本發明之最佳培養基(包含胎牛血清)中培養的小腸幹細胞之Msi1基因表現量，相較於培養於高等DMEM/F12者(包含胎牛血清)輕微地減少，惟在本發明之最佳培養基(無血清)及高等DMEM/F12(無血清)培養的小腸幹細胞之Msi1基因表現量則相近。另一方面，於本發明之最佳培養基(包含或不包含胎牛血清)培養的小腸幹細胞之CD44基因表現，均高於培養於高等DMEM/F12者(包含或不包含胎牛血清)。綜上，本測試結果顯示於本發明之最佳培養基(包含或不包含胎牛血清)中培養小腸腺窩細胞，可維持小腸幹細胞之再生性及分化能力。
本實施例以Lgr5、CD24及CD44抗體標記自類腸狀物所分離的細胞，並以BD之C6流式細胞儀分析。小腸幹細胞培養至第7天時，將各孔中的類腸狀物收集並以機械方法將其消化分解成單一細胞。取密度為1×106的細胞，將該細胞以PBS清洗後，以2000rpm離心5分鐘，除去上清液後將沉澱物重新懸浮於500μl PBS。之後，加入10μl的Lgr5初級抗體(Abgent,USA)並在4℃下避光反應90分
鐘。反應後，再將該樣品以PBS清洗後，以2000rpm離心5分鐘，除去上清液，再將沉澱物重新懸浮於500μl PBS中。接著，加入4μl之螢光異硫氰酸鹽(Fluorescein isothiocyanate，簡稱FITC)所接合的山羊抗兔子(FITC-conjugated goat-anti-rabbit)之次級抗體(BD Biosciences,USA)，並在4℃下避光反應40分鐘。再將該樣品以PBS清洗後以2000rpm離心5分鐘，除去上清液後將沉澱物重新懸浮於500μlPBS，並直接以BD C6流式細胞儀分析。在CD24及CD44標記的試驗中，使用如上述標記方法進行試驗，除了分別加入4μl CD24及12μl CD44並在4℃下避光反應30分鐘之外。最後以流式細胞儀進行樣品的分析。
如第7圖所示，相較於剛分離之小腸幹細胞，於本發明之最佳培養基中(包含或不包含胎牛血清)培養的小腸幹細胞之Lgr5蛋白質表現量顯著的增加。同樣地，如第8圖所示，相較於剛分離之小腸幹細胞，於本發明之最佳培養基中(無胎牛血清)中培養的小腸幹細胞之CD24蛋白質表現量亦顯著的增加。然而，如第9圖所示，於本發明之最佳培養基(無胎牛血清)中培養的小腸幹細胞之CD44的蛋白質表現量，相較於培養在高等DMEM/F12者(無胎牛血清)，只有些微地增加。因此，此結果確認本發明之最佳培養基(包含或不包含胎牛血清)可維持小腸幹細胞體外培養時之增生、再生性及分化能力。
本實施例測試小腸幹細胞在無血清環境中培養，可與於含血清環境中培養形成相同的細胞型態。將小腸幹細胞分別於高等DMEM/F12培養基(包含或不包含胎牛血清)、一般DMEM/F12培養基(包含或不包含胎牛血清)及本發明之最佳培養基(包含或不包含胎牛血清)培養7日後，觀察其細胞型態。
如第10圖所示，所有的小腸幹細胞之類腸狀物均形成一樣的細胞型態，表示於本發明之最佳培養基及無血清環境中培養之小腸幹細胞，並不會形成不良的細胞型態。
上述實施例僅例示性說明本發明之原理及其功效，而非用於限制本發明。任何熟習此項專業之人士均可在不違背本發明之精神及範疇下，對上述實施例進行修飾與改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有此項專業知識者，在未脫離本發明所揭示之精神與技術原理下所完成之一切等效修飾或改變，仍應由後述之申請專利範圍所涵蓋。
Claims (13)
- 一種用於體外培養小腸幹細胞之培養基，包含：基礎培養液；運鐵蛋白；乙醇胺，其中，該乙醇胺於該培養基中之濃度範圍為0.5mM至小於5mM；抗壞血酸、或其鹽、或其酯；麩胱甘肽或其鹽；以及亞硒酸鈉。
- 如申請專利範圍第1項所述之培養基，復包含胎牛血清或胎牛血清衍生物。
- 如申請專利範圍第1項所述之培養基，其中，該基礎培養液係選自由DMEM培養基、DMEM/F12培養基、RPMI1640培養基及Eagle’s培養基所組成之群組之至少一者。
- 如申請專利範圍第1項所述之培養基，其中，該運鐵蛋白於該培養基中之濃度範圍為1.8×10-3mM至小於1.8×10-2mM。
- 如申請專利範圍第1項所述之培養基，其中，該抗壞血酸、或其鹽或其酯於該培養基中之濃度範圍為0.05mM至小於0.617mM。
- 如申請專利範圍第1項所述之培養基，其中，該麩胱甘肽或其鹽於該培養基中之濃度範圍為0.05mM至小於0.647mM。
- 如申請專利範圍第1項所述之培養基，其中，該亞硒酸鈉於該培養基中之濃度範圍為5×10-4mM至小於6.5×10-3mM。
- 如申請專利範圍第1項所述之培養基，其中，經該培養基培養之小腸幹細胞仍保持其自我更新性(self-renewal)及幹細胞特性(stemness)。
- 如申請專利範圍第1項所述之培養基，其中，經該培養基培養之小腸幹細胞對於Msi1、Bmi1、Lgr5、PTEN、CD24及CD44的一者或多者為陽性。
- 一種體外培養小腸幹細胞之方法，係包含使用如申請專利範圍第1項所述之培養基培養小腸幹細胞。
- 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中，該培養基進一步包含胎牛血清或胎牛血清衍生物。
- 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中，經該培養基培養之小腸幹細胞仍保持其自我更新性(self-renewal)及幹細胞特性(stemness)。
- 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中，經該培養基培養之小腸幹細胞對於Msi1、Bmi1、Lgr5、PTEN、CD24及CD44的一者或多者為陽性。
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