CN107699492A - 一种小球藻的保藏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小球藻的保藏方法，其包括如下步骤：将处于对数生长期的、无杂菌的小球藻滴于加了琼脂平板培养基的培养容器中，振荡使其分散，然后放置于温度22～26℃、光照度4000～6000lx的光照培养箱中24h连续光照培养5～10d，再用封口膜密封、倒置、低温弱光照保藏。本发明保藏方法具有操作简便、成本低、不易污染、保藏效果好、保藏时间长等特点，可最大限度的保持小球藻的生物活性，且复苏能力强。

Description

一种小球藻的保藏方法
技术领域
本发明属于微藻保藏技术领域，更具体地说，本发明涉及一种小球藻的保藏方法。
背景技术
小球藻属(Chlorella)是一类普生性单细胞绿藻，属于绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、绿球藻目(Chlorcoccales)、小球藻科(Chlorellaceae)。我国常见的小球藻种类有蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、椭圆小球藻
(Chlorella ellipsoidea)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)和微小小球藻(Chlorella minutissima)等。小球藻的应用价值很高，有“绿藻中的黄金”的美誉。已广泛应用于水体净化、食品添加剂、动物饲料以及医药保健等领域。
小球藻单细胞藻种的保藏一直是制约生产培养单位藻种正常供应和长期保存的重要因素。目前，小球藻保藏方法主要有液体保藏法、固体平板保藏法和超低温保藏法等。液体保藏法和固体平板保藏法保藏时间往往较短(通常为1-2个月)，由于培养基表面易干燥，需要定期传代，但是频繁的传代不仅增加了人力成本和污染的风险，而且易导致藻种优良性状的退化或丢失。超低温保藏法虽然保藏时间较长，但需要昂贵的设备、耗能大、保存条件苛刻，且保存液中需要添加对藻体细胞有毒性作用的抗冻剂，因此难以得到普遍应用。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有小球藻保藏中存在的上述问题，提供一种操作简便、成本低、不易污染、保藏效果好、保藏时间长的、可最大限度保持小球藻生物活性的保藏方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种小球藻的保藏方法，其包括如下步骤：
将处于对数生长期的、无杂菌的小球藻滴于加了琼脂平板培养基的培养容器中，振荡使其分散，然后放置于温度22～26℃、光照度4000～6000lx的光照培养箱中24h连续光照培养5～10d，再用封口膜密封、倒置、低温弱光照保藏；
其中，所述琼脂平板培养基由如下步骤制备得到：
(1)制备每升含有土壤浸提液30～50mL、NaHCO3 0.5～1.0g、KNO3 1.0～1.5g、KH2PO4 0.8～1.0g、琼脂15～20g、余量为水、pH为8.0～8.5的溶液，灭菌得到A液；
(2)制备每升含有100～160g的山梨糖醇溶液，经过滤除菌，得到B液；
(3)在A液凝固前加入B液，B液的加入体积为A液体积的1/200，得到混合液；
(4)将所述混合液加入到培养容器中，紫外光照射15～20min，凝固后得到琼脂平板培养基。
作为本发明小球藻的保藏方法的一种优选技术方案，所述处于对数生长期的小球藻是将小球藻加入到盛有生长培养基的容器中，在光照度4000～6000lx、24h连续光照、温度22～26℃、150～180rpm条件下振荡培养5～7d得到；
所述生长培养基，每升含有葡萄糖2.0～3.0g、蛋白胨0.8～1.0g、K2HPO4·3H2O0.4～0.6g、MgSO4·7H2O 0.8～0.9g、NaCl 0.4～0.6g、MnCl2·4H2O 0.008～0.01g、AlCl30.008～0.01g、FeSO4·7H2O 0.009～0.01g、余量为水，pH为7.0～8.0。
作为本发明小球藻的保藏方法的一种优选技术方案，所述培养容器为96孔培养板，所述的将混合液加入到培养容器中是将150～200μL的混合液加入到96孔培养板中。
作为本发明小球藻的保藏方法的一种优选技术方案，每100mL所述土壤浸提液由如下步骤制备得到：采集地表以下10～20cm深处的土壤10g，加水100mL，煮沸30min，冷却后4000rpm离心20min，取上清液，加水至100mL，得到土壤浸提液。
作为本发明小球藻的保藏方法的一种优选技术方案，步骤(2)中，所述过滤除菌为0.22μm滤膜过滤除菌。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明保藏方法具有操作简便、成本低、不易污染、保藏效果好(保藏12个月的藻种存活率在90％以上)、保藏时间长(现有的小球藻琼脂平板保藏法的保藏时间一般为1～2个月，本发明保藏方法的保藏时间在12个月以上)等特点，可最大限度的保持小球藻的生物活性，且复苏能力强，具有良好的应用前景。
(2)本发明优选通过96孔培养板对小球藻进行保藏，可同时保藏多种小球藻藻种，与传统的玻璃培养皿保藏相比，更便于实现批量保藏，不仅节约了人力和成本，也有利于藻种保藏期间的管理和维护,易于推广应用。
(3)本发明通过在琼脂平板培养基中加入山梨糖醇，具有较好的保湿(吸湿)作用，解决了传统琼脂平板培养基表面容易干燥的问题，延长了小球藻的保藏时间。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
以微小小球藻(Chlorella minutissima)为试验藻株，加入到盛有100mL生长培养基的三角瓶中，光照度6000lx、24h连续光照、温度26℃、150rpm条件下振荡培养，可观察到培养液颜色逐渐变绿至深绿色，5d后至对数生长期。
取处于对数生长期的微小小球藻藻液进行镜检，确定无杂菌后，吸取5μL藻液，滴于96孔培养板相应孔中琼脂平板培养基的中间位置上(同一个96孔培养板的不同孔可以同时保藏不同的小球藻藻种，在孔对应的正面或反面培养板上用记号笔做好标记即可)。将盛有琼脂平板培养基的96孔培养板置于振荡器上震荡3min，然后放置于温度26℃，光照度6000lx的光照培养箱中24h连续光照培养，5d后，可观察到琼脂平板上长有微小小球藻藻落。
待微小小球藻藻落生长至布满琼脂平板3/4表面时，将96孔培养板用封口膜密封，倒置于4℃冰箱中，微弱光照保藏。
其中，琼脂平板培养基的制备方法如下：
A液：土壤浸提液30mL，NaHCO3 0.5g，KNO3 1.0g，KH2PO4 0.8g，琼脂15g，余量为水，定容至1L，NaOH调pH至8.0，121℃高压灭菌30min。
B液：称取山梨糖醇10g，溶于100mL水中。
在A液凝固前，将B液用0.22μm滤膜过滤除菌，吸取5mL，加入到A液中，混合均匀，得到混合液。
吸取混合液150μL加入到96孔培养板的孔中，暴露于紫外光下照射15min，待凝固后即成琼脂平板培养基。
土壤浸提液的制备方法如下：采集榕树根际地表面以下10cm处的土壤，称重10g，加水100mL，煮沸30min，待冷却后以4000r/min的速度离心20min，取上清液，加蒸馏水补足到100mL。
生长培养基的制备方法如下：葡萄糖2.0g，蛋白胨0.8g，K2HPO4·3H2O 0.4g，MgSO4·7H2O 0.8g，NaCl 0.4g，MnCl2·4H2O 0.008g，AlCl3 0.008g，FeSO4·7H2O 0.009g，余量为水，定容至1L，NaOH或HCl调节pH至7.0，分装于500mL三角瓶中，121℃高压灭菌30min。
实施例2
以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)为试验藻株，加入到盛有100mL生长培养基的三角瓶中，光照度4000lx、24h连续光照、温度22℃、180rpm条件下振荡培养，可观察到培养液颜色逐渐变绿至深绿色，7d后至对数生长期。
取处于对数生长期的蛋白核小球藻藻液进行镜检，确定无杂菌后，吸取5μL藻液，滴于96孔培养板相应孔中琼脂平板培养基的中间位置上(同一个96孔培养板的不同孔可以同时保藏不同的小球藻藻种，在孔对应的正面或反面培养板上用记号笔做好标记即可)。将盛有琼脂平板培养基的96孔培养板置于振荡器上震荡3min，然后放置于温度22℃，光照度4000lx的光照培养箱中24h连续光照培养，10d后，可观察到琼脂平板上长有蛋白核小球藻藻落。
待蛋白核小球藻藻落生长至布满琼脂平板3/4表面时，将96孔培养板用封口膜密封，倒置于4℃冰箱中，微弱光照保藏。
其中，琼脂平板培养基的制备方法如下：
A液：土壤浸提液50mL，NaHCO3 1.0g，KNO3 1.5g，KH2PO4 1.0g，琼脂20g，余量为水，定容至1L，NaOH调pH至8.5，121℃高压灭菌30min。
B液：称取山梨糖醇16g，溶于100mL水中。
在A液凝固前，将B液用0.22μm滤膜过滤除菌，吸取5mL，加入到A液中，混合均匀，得到混合液。
吸取混合液200μL加入到96孔培养板的孔中，暴露于紫外光下照射20min，待凝固后即成琼脂平板培养基。
土壤浸提液的制备方法如下：采集榕树根际地表面以下20cm处的土壤，称重10g，加水100mL，煮沸30min，待冷却后以4000r/min的速度离心20min，取上清液，加蒸馏水补足到100mL。
生长培养基的制备方法如下：葡萄糖3.0g，蛋白胨1.0g，K2HPO4·3H2O 0.6g，MgSO4·7H2O 0.9g，NaCl 0.6g，MnCl2·4H2O 0.01g，AlCl3 0.01g，FeSO4·7H2O 0.01g，余量为水，定容至1L，NaOH或HCl调节pH至8.0，分装于500mL三角瓶中，121℃高压灭菌30min。
实验例3
以实施例1方法保藏的微小小球藻活藻细胞数量和活化后的藻液中藻细胞的生物量为衡量指标，评价实施例1的保藏方法对微小小球藻的保藏效果。
无菌条件下刮取采用实施例1的保藏方法保藏3个月、6个月、9个月和12个月的微小小球藻，加入到无菌水中，配成藻液，采用平板藻落计数法测定藻液中活藻密度，每一组实验设三个平行对照组。计算藻细胞存活率的平均值，测定方法参考《工业微生物实验技术手册》(中国轻工业出版社，1997)。采用实施例1的保藏方法保藏3个月、6个月、9个月和12个月后的微小小球藻，其存活率的平均值分别为：96.7％、95.8％、95.0％和91.8％。该结果表明采用实施例1的保藏方法保藏微小小球藻，可最大限度的保持藻种的存活率。
分别取等量的采用实施例1的保藏方法保藏3个月、6个月、9个月和12个月的微小小球藻，加入到盛有100mL生长培养基的三角瓶中，光照度6000lx，24h连续光照，温度26℃，150rpm条件下振荡培养5d。每一组实验设三个平行对照组。取相同体积的藻液，4500rpm离心，去除上清液，藻体置于85℃恒温烘箱烘干至恒重，称取藻体细胞的干重，计算各组测定值的平均值。结果：采用实施例1的保藏方法保藏3个月、6个月、9个月和12个月的微小小球藻，其藻体细胞干重的平均值分别为1.51g/L、1.46g/L、1.43g/L和1.42g/L。该试验结果表明，采用实施例1的保藏方法保藏3个月、6个月、9个月和12个月的微小小球藻，活化后的藻液中藻细胞的生物量变化不明显，且藻种复苏能力强。
实验例4
以实施例2方法保藏的蛋白核小球藻活藻细胞数量和活化后的藻液中藻细胞的生物量为衡量指标，评价实施例2的保藏方法对蛋白核小球藻的保藏效果。
无菌条件下刮取采用实施例2的保藏方法保藏3个月、6个月、9个月和12个月的蛋白核小球藻，加入到无菌水中，配成藻液，采用平板藻落计数法测定藻液中活藻密度，每一组实验设三个平行对照组。计算藻细胞存活率的平均值，测定方法参考《工业微生物实验技术手册》(中国轻工业出版社，1997)。采用实施例2的保藏方法保藏3个月、6个月、9个月和12个月后的蛋白核小球藻，其存活率的平均值分别为：97.5％、96.1％、94.7％和92.1％。该结果表明采用实施例2的保藏方法保藏蛋白核小球藻，可最大限度的保持藻种的存活率。
分别取等量的采用实施例2的保藏方法保藏3个月、6个月、9个月和12个月的蛋白核小球藻，加入到盛有100mL生长培养基的三角瓶中，光照度4000lx，24h连续光照，温度22℃，180rpm条件下振荡培养7d。每一组实验设三个平行对照组。取相同体积的藻液，4500rpm离心，去除上清液，藻体置于85℃恒温烘箱烘干至恒重，称取藻体细胞的干重，计算各组测定值的平均值。结果：采用实施例2的保藏方法保藏3个月、6个月、9个月和12个月的蛋白核小球藻，其藻体细胞干重的平均值分别为2.3g/L、2.1g/L、1.96g/L和1.94g/L。该试验结果表明，采用实施例2的保藏方法保藏3个月、6个月、9个月和12个月的蛋白核小球藻，活化后的藻液中藻细胞的生物量变化不明显，且藻种复苏能力强。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (5)

1.一种小球藻的保藏方法，其特征在于，包括如下步骤：
将处于对数生长期的、无杂菌的小球藻滴于加了琼脂平板培养基的培养容器中，振荡使其分散，然后放置于温度22～26℃、光照度4000～6000lx的光照培养箱中24h连续光照培养5～10d，再用封口膜密封、倒置、低温弱光照保藏；
其中，所述琼脂平板培养基由如下步骤制备得到：
(1)制备每升含有土壤浸提液30～50mL、NaHCO3 0.5～1.0g、KNO3 1.0～1.5g、KH2PO40.8～1.0g、琼脂15～20g、余量为水、pH为8.0～8.5的溶液，灭菌后得到A液；
(2)制备每升含有100～160g的山梨糖醇溶液，经过滤除菌，得到B液；
(3)在A液凝固前加入B液，B液的加入体积为A液体积的1/200，得到混合液；
(4)将所述混合液加入到培养容器中，紫外光照射15～20min，凝固后得到琼脂平板培养基。
2.根据权利要求1所述小球藻的保藏方法，其特征在于，所述处于对数生长期的小球藻是将小球藻加入到盛有生长培养基的容器中，在光照度4000～6000lx、24h连续光照、温度22～26℃、150～180rpm条件下振荡培养5～7d得到；
所述生长培养基，每升含有葡萄糖2.0～3.0g、蛋白胨0.8～1.0g、K2HPO4·3H2O 0.4～0.6g、MgSO4·7H2O 0.8～0.9g、NaCl 0.4～0.6g、MnCl2·4H2O 0.008～0.01g、AlCl3 0.008～0.01g、FeSO4·7H2O 0.009～0.01g、余量为水，pH为7.0～8.0。
3.根据权利要求1所述小球藻的保藏方法，其特征在于，所述培养容器为96孔培养板，所述的将混合液加入到培养容器中是将150～200μL的混合液加入到96孔培养板中。
4.根据权利要求1所述小球藻的保藏方法，其特征在于，每100mL所述土壤浸提液由如下步骤制备得到：采集地表以下10～20cm深处的土壤10g，加水100mL，煮沸30min，冷却后4000rpm离心20min，取上清液，加水至100mL，得到土壤浸提液。
5.根据权利要求1所述小球藻的保藏方法，其特征在于，步骤(2)中，所述过滤除菌为0.22μm滤膜过滤除菌。
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