CN106701582A - 一种微藻藻种长期保藏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微藻藻种长期保藏方法。它是将微藻接种于固体培养基上培养，无菌条件下将携带有微藻细胞的固体培养基风干，弱光条件下保藏。本发明的微藻藻种长期保藏方法，具有操作简单，工作量小，保存时间长，不易污染，能很好的维持藻细胞活性及特性，易复苏，耗能低，运输便捷等优点，为实验及生产保藏微藻藻种具有非常重要的意义。

Description

一种微藻藻种长期保藏方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种微藻藻种长期保藏方法。
背景技术：
微藻种类繁多，是世界上生物量最大、最古老的一类生物(比三叶虫还早)；微藻的光合利用效率较高，地球每年固定的生物质中有40％来源于微藻；同时，微藻的存在决定着生命起始至今地球的大气成分与变化。
微藻因其生长周期短、生长速率快、光合作用效率高、可生产丰富多样的生物质(特别是具有生物活性的高附加值产品)、不与粮食生产竞争资源、环境效益显著(可回收废水废气中的碳氮硫元素)等优势，成为了全球新型生物质能源领域的研究前沿和热点。
地球上已知的微藻种类超过40,000种，它们的种间甚至株系间的生长特性、含有的生物质种类及含量和在环境中的功能差异很大。藻类的生境类型广阔多样，可在淡水、海水、咸水、半咸水、高盐度水及土壤等环境中生存。许多微藻细胞内含有30％～50％DW的脂类，有的甚至高达80％DW，其中绿藻门和硅藻门种类较多；一些门类的微藻可以积累一定量的高附加值生物活性物质，如雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是天然虾青素的理想来源(最高可达干重的8％)；盐生杜氏藻(Dunaliella salina)在逆境条件下可大量积累具有抗氧化活性的β-胡萝卜素；紫球藻含有抗肿瘤活性的紫球藻多糖；波氏藻富含人体的必需脂肪酸二十碳五烯酸(脑黄金)等。因此，不论是基于生态环境(物种多样性)保护，还是藻类生物质的生产，藻株的选育工作具有重要意义，藻种的保藏十分关键。微藻藻种的保藏方法应该要具备：(1)操作简单、快速，工作量适宜；(2)培养条件稳定、清洁，不易污染(可抵抗环境中细菌、杂藻、真菌)和变异；(3)细胞易于复苏；(4)保藏工作节能环保，成本低廉；(5)方便运输，运输条件常规不苛刻。
目前微藻藻种保藏方法存在的问题主要包括：1)微藻繁殖生长快速，生物量大，用常规的液体培养基或是固体琼脂平板涂布保藏，为了保证藻种的特性，需要1-2个月进行一次传代工作。传代操作的前期准备工作繁杂，工作量大，耗时耗力；2)利用液体培养基保藏微藻藻种极易污染细菌和真菌，影响微藻的生长，也明显影响微藻生理机制的研究实验数据，同时，长期液体培养的藻种不进行定期活化，容易发生性状变异；3)目前，采用固体培养基保藏藻种的方法借鉴于菌类保藏的方法，例如添加一些保护剂与藻种混合，然后经过超低温真空排水，安瓿管低温环境保存。这种保藏方法，由于微藻与菌类有很大的区别，其生命活动类似于高等植物，所以低温会造成细胞的冻伤，易出现结构损伤或功能丧失等现象，藻种复苏极其困难，甚至不能复苏；4)采用低温保藏的方法耗能大，保存条件苛刻；5)藻种运输不够便捷，在运输过程中，藻种样品易损坏，且运输条件有特殊要求。
目前已公开的与微藻藻种保藏相关的专利主要包括：
1)一种有利于长期储存雨生红球藻藻种的固态培养基及其制备方法(专利申请号：CN201610369738.4)，该发明公开了一种有利于长期储存雨生红球藻藻种的固态培养基，按照申请人提供的新配方以及制备方法，解决现有配方抑制雨生红球藻繁殖，生长因子不够或过量，易污染细菌等弊端，达到延长雨生红球藻藻种保存时间的效果。
2)微藻藻种的保藏方法(专利申请号：CN201610333908.3)，本发明涉及一种微藻藻种的保藏方法。该方法将微藻培养到稳定生长阶段后，微藻的藻液与保存液按照1:1等体积比例混合，将混合液保存在温度20℃、光照强度20μE/mol/s、光照时间4小时/天的条件下，方法提供的保护液包括了氮盐、磷盐、铁盐、EDTA-Na2、NaHCO3、Gly、甘油、VB10、VB12、抗生素、和植物生长调节剂。
3)一种保藏微藻藻种的方法(专利申请号：CN201010222005.0)，本发明公开了一种保藏微藻藻种的方法，其方法为将所要保藏藻种收集获得藻泥，然后将藻泥与保护剂混合制成藻种细胞悬液，上述藻种细胞悬液经过程序预冻过程，最终完全冻结。冻结后的藻种细胞悬液在减压的条件下使水分升华，形成固形海绵体状物质保藏即可。保护剂为脱脂乳和维生素的复合保护剂，以重量计脱脂乳的含量为5％～20％，维生素0.5％～2％。
通过对现有的微藻藻种保藏方法进行分析发现，现有的微藻藻种保藏方法，多数为藻类常规保藏方法(各方法没有明显差异及有意义的关键技术)或是借鉴菌类保藏的方法，这些方法并没有在保持微藻细胞活性的条件下减少传代的工作量，特别是对于拥有种类数量庞大的藻种种质资源库，难以进行推广应用；同时这些方法，耗能大，易污染，易冻伤微藻细胞，难以复苏及维持驯化后的生长和遗传特性；运输不便捷，易损坏，且有的还需要特殊的环境条件；这些方法中有一些还仅提供为专一藻种所用，应用范围较窄。
发明内容：
本发明的目的是提供一种适用范围广，简单便捷，能在常温下有效长期保持微藻细胞活性的微藻藻种长期保藏方法。
本发明的微藻藻种长期保藏方法，其特征在于，将微藻接种于固体培养基上培养，无菌条件下将携带有微藻细胞的固体培养基风干，弱光条件下保藏。
具体步骤如下：将微藻接种于固体培养基上，15～30℃，持续光照，光照强度为20～100μmol photons m-2s-1，培养7～14d，无菌条件下将携带有微藻细胞的固体培养基风干，15～30℃，持续光照，光照强度20～100μmol photons m-2s-1条件下保藏。
所述的微藻优选为淡水微藻或海洋微藻。
所述的淡水微藻优选为绿球藻。
所述的海洋微藻优选为海洋小球藻。
当所述的微藻为淡水微藻时，所述的固体培养基为BG-11固体培养基，当所述的微藻为海洋微藻时，所述的固体培养基为F/2固体培养基。
所述的固体培养基的厚度优选为2～3mm。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明的微藻藻种长期保藏方法，适用于绝大部分的微藻种类，培养基具有广谱性。同时，该方法可以让微藻细胞在常温光照条件下，生长较慢，保藏时间延长。
2)本发明的微藻藻种长期保藏方法，减少了培养基中水分的含量，且培养过程中利用透气膜封存样品，既能有效隔离污染，大大减小了滋生细菌和真菌的条件，又使细胞能正常呼吸。
3)本发明的微藻藻种长期保藏方法，操作过程耗能小，不需要超低温抽真空脱水，藻细胞不会受到损伤，结构与功能不会被破坏，色素体完整，保藏过程中持续低水平的光合作用，细胞复苏方法简单。
4)本发明的微藻藻种长期保藏方法，在运输过程中，较液体或者琼脂保藏的藻种样品不易损坏，也不用低温保藏的特殊条件，且样品体积小，重量轻，十分便捷。
5)本发明的微藻藻种长期保藏方法，操作简单，不需要频繁传代，工作量大大减少，并且可以有效的保持细胞的活性及生物学特性，不易变异。
本发明的微藻藻种长期保藏方法，具有操作简单，工作量小，保存时间长，不易污染，能很好的维持藻细胞活性及特性，易复苏，耗能低，运输便捷等优点，为实验及生产保藏微藻藻种具有非常重要的意义。
附图说明：
图1是保藏1年的绿球藻藻种；
图2是保藏1年的绿球藻在新鲜固体培养基复培的状态；
图3是保藏1年的绿球藻在新鲜液体培养基复培的状态；
图4是保藏1年的海洋小球藻藻种；
图5是保藏1年的海洋小球藻在新鲜固体培养基复培的状态；
图6是保藏1年的海洋小球藻在新鲜液体培养基复培的状态。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
实施例1：淡水微藻藻种保藏及复培(以淡水绿球藻为例)
1.微藻藻种：
绿球藻是一类种类较多，生境较广，极为常见的淡水微藻。实验中的这株淡水绿球藻分离自广东省广州市内大型人工湖泊，在实验室纯化保藏。
2.培养条件：
适宜生长温度为15～30℃，光照强度为10～1000μmol photons m-2s-1，淡水微藻培养基(BG-11培养基)培养。
BG-11液体培养基的配方为：每升培养基含有NaNO3 1.5g、K2HPO4 0.04g、MgSO4 .7H2O0.075g、CaCl2 .7H2O 0.036g、Na2CO3 0.02g、Citric acid(柠檬酸)0.006g、Ammonium ferric citrategreen(柠檬酸铁铵)0.006g、EDTA 0.001g、和微量元素溶液A51mL(每升微量元素溶液含有H3BO3 2.86g、MnCl2 .4H2O 1.81g、ZnSO4 .7H2O 0.222g、Na2MoO40.39g、CuSO4 .5H2O0.079g和Co(NO3)2.6H2O 0.049g，余量为水)，余量为水，灭菌备用。BG-11固体培养基的配方为：每升BG-11液体培养基中加入25g琼脂，灭菌后倒平板备用。
3.保藏操作：
首先配置好新鲜的BG-11固体培养基，将绿球藻细胞接种于BG-11固体培养基上，放入光照培养箱，25℃，持续光照，光照强度60μmol photons m-2s-1，培养约10天后，可看见该绿球藻的藻落星星点点分布于培养基上，经过普通光学显微镜(Olympus)确定为纯种。然后再制作新鲜的BG-11固体培养基，此时制作的这个固体培养基，在倒琼脂时控制体积，使固体培养基厚度仅为3mm，将纯化的绿球藻细胞涂布于该薄固体培养基上，生物封口膜封好，放置于光照培养箱，25℃，持续光照，光照强度为60μmol photons m-2s-1，培养7d(可见大量绿球藻细胞)，把带有绿球藻细胞的平板转移至超净工作台内，光照鼓风放置3～5天，固体培养基风干，取出放于光照培养箱，25℃，持续光照，光照强度60μmol photons m-2s-1条件下长期保藏。经该方法保藏3～5年后，该藻细胞仍具有活力且无污染，不需要重新传代。
4.复培实验：
将保藏1年的附着绿球藻细胞的固体培养基薄片(图1)取出，在超净台内无菌操作，裁剪一小块带有绿球藻细胞的薄片，剩下的置于原容器封存好放回培养箱保藏。将裁剪下来的薄片放入装有新鲜无菌BG-11液体培养基的50mL透明离心管中，生物膜封口后于光照培养箱中，25℃，持续光照，光照强度为60μmol photons m-2s-1条件下培养3天后，用接种环从软化的附着绿球藻细胞的固体培养基薄片上刮取呈绿色的藻细胞，接种到新鲜的BG-11固体培养基上，放于光照培养箱内，25℃，持续光照，光照强度为60μmol photons m-2s-1条件下培养13天，即可见琼脂上大量绿色健康的绿球藻藻落(图2)，用光学显微镜观察确定为保藏的绿球藻。用接种环刮取绿球藻细胞接种到新鲜的BG-11液体培养基中，25℃，持续光照，光照强度为60μmol photons m-2s-1条件下培养15天，即可见细胞密度较高的绿色微藻液体培养物(图3)，用光学显微镜观察到健康完整的该藻细胞。
实施例2：海洋微藻藻种保藏及复培(以海洋小球藻为例)
1.微藻藻种：
海洋小球藻是极为常见的海水微藻，其产品应用广泛。实验中的这株海洋小球藻分离自中国海南省内海域，在实验室纯化保藏。
2.培养条件：
适宜生长温度为15～30℃，光照强度为10～1000μmol photons m-2s-1，海水微藻培养基(F/2培养基)培养。
F/2液体培养基的配方为：每升培养基含有NaNO3 75mg、NaH2PO4 .H2O 5mg、Na2SiO3 .9H2O 20mg、Na2EDTA 4.36mg、FeCl3 .6H2O 3.16mg、CuSO4 .5H2O 0.01mg、ZnSO4 .7H2O0.023mg、CoCl2.6H2O 0.012mg、MnCl.4H2O 0.18mg、Na2MoO4 .2H2O 0.07mg、维生素B1 0.1mg、维生素B12 0.5mg和生物素0.5mg，余量为经0.45μm孔径滤膜过滤的海水，灭菌备用。F/2固体培养基配方为：每升F/2液体培养基中加入25g琼脂，灭菌后倒平板备用。
3.保藏操作：
首先配置好新鲜的F/2固体培养基，将海洋小球藻细胞接种于F/2固体培养基上，放入光照培养箱，25℃，持续光照，光照强度为60μmol photons m-2s-1条件下培养约10天后，可看见该海洋小球藻的藻落星星点点分布于培养基上，经过普通光学显微镜(Olympus)确定为纯种。然后再制作新鲜的F/2固体培养基，此时制作的这个固体培养基，在倒琼脂时控制体积，使固体培养基厚度仅为2-3mm，将纯化的海洋小球细胞涂布于该薄固体培养基上，生物封口膜封好，放置于光照培养箱，15℃，持续光照，光照强度为20μmol photons m- 2s-1条件下培养14d(可见大量海洋小球藻细胞)，把带有海洋小球藻细胞的平板转移至超净工作台内，光照鼓风放置3～5天，固体培养基风干，与BG-11固体培养基不同，海水由于含有大量的盐，在风干后，表面会析出大量白色粉末状的盐，用接种环刮除掉表面的白色粉末状的盐，避免藻细胞高盐分脱水，封好、取出放于光照培养箱，15℃，持续光照，光照强度20μmol photons m-2s-1条件下长期保藏。经该方法保藏3～5年后，该藻细胞仍具有活力且无污染，不需要重新传代。
4.复培实验：
将保藏1年的附着海洋小球藻细胞的固体培养基薄片(图4)取出，在超净台内无菌操作，裁剪一小块带有海洋小球藻细胞的薄片，剩下的置于原容器封存好放回培养箱保藏。将裁剪下来的薄片放入装有新鲜无菌F/2液体培养基的50mL透明离心管中，生物膜封口后于光照培养箱中25℃，持续光照，光照强度为60μmol photons m-2s-1条件下培养3天后，用接种环从软化的附着海洋小球藻细胞的固体培养基薄片上刮取呈绿色的藻细胞，接种到新鲜的F/2固体培养基上，放于光照培养箱内，25℃，持续光照，光照强度为60μmol photonsm-2s-1条件下培养15天，即可见琼脂上大量绿色健康的海洋小球藻藻落(图5)，用光学显微镜观察确定为保藏的海洋小球藻。用接种环从软化的附着海洋小球藻细胞的固体培养基薄片上刮取呈绿色的藻细胞接种到新鲜的F/2液体培养基上，25℃，持续光照，光照强度为60μmol photons m-2s-1条件下培养20天，即可见细胞密度较高的绿色微藻液体培养物(图6)，用光学显微镜观察到健康完整的该藻细胞。
实施例3：海洋微藻藻种保藏及复培(以海洋小球藻为例)
1.微藻藻种：
海洋小球藻是极为常见的海水微藻，其产品应用广泛。实验中的这株海洋小球藻分离自中国海南省内海域，在实验室纯化保藏。
2.培养条件：
适宜生长温度为15～30℃，光照强度为10～1000μmol photons m-2s-1，海水微藻培养基(F/2培养基)培养。
F/2液体培养基的配方为：每升培养基含有NaNO3 75mg、NaH2PO4 .H2O 5mg、Na2SiO3 .9H2O 20mg、Na2EDTA 4.36mg、FeCl3 .6H2O 3.16mg、CuSO4 .5H2O 0.01mg、ZnSO4 .7H2O0.023mg、CoCl2.6H2O 0.012mg、MnCl.4H2O 0.18mg、Na2MoO4 .2H2O 0.07mg、维生素B1 0.1mg、维生素B12 0.5mg和生物素0.5mg，余量为经0.45μm孔径滤膜过滤的海水，灭菌备用。F/2固体培养基配方为：每升F/2液体培养基中加入25g琼脂，灭菌后倒平板备用。
3.保藏操作：
首先配置好新鲜的F/2固体培养基，将海洋小球藻细胞接种于F/2固体培养基上，放入光照培养箱，25℃，持续光照，光照强度为60μmol photons m-2s-1条件下培养约10天后，可看见该海洋小球藻的藻落星星点点分布于培养基上，经过普通光学显微镜(Olympus)确定为纯种。然后再制作新鲜的F/2固体培养基，此时制作的这个固体培养基，在倒琼脂时控制体积，使固体培养基厚度仅为2-3mm，将纯化的海洋小球细胞涂布于该薄固体培养基上，生物封口膜封好，放置于光照培养箱，30℃，持续光照，光照强度为100μmol photons m- 2s-1条件下培养14d(可见大量海洋小球藻细胞)，把带有海洋小球藻细胞的平板转移至超净工作台内，光照鼓风放置3～5天，固体培养基风干，与BG-11固体培养基不同，海水由于含有大量的盐，在风干后，表面会析出大量白色粉末状的盐，用接种环刮除掉表面的白色粉末状的盐，避免藻细胞高盐分脱水，封好、取出放于光照培养箱，30℃，持续光照，光照强度100μmol photons m-2s-1条件下长期保藏。经该方法保藏3～5年后，该藻细胞仍具有活力且无污染，不需要重新传代。
4.复培实验：
将保藏1年的附着海洋小球藻细胞的固体培养基薄片取出，在超净台内无菌操作，裁剪一小块带有海洋小球藻细胞的薄片，剩下的置于原容器封存好放回培养箱保藏。将裁剪下来的薄片放入装有新鲜无菌F/2液体培养基的50mL透明离心管中，生物膜封口后于光照培养箱中25℃，持续光照，光照强度为60μmol photons m-2s-1条件下培养3天后，用接种环从软化的附着海洋小球藻细胞的固体培养基薄片上刮取呈绿色的藻细胞，接种到新鲜的F/2固体培养基上，放于光照培养箱内，25℃，持续光照，光照强度为60μmol photons m-2s-1条件下培养15天，即可见琼脂上大量绿色健康的海洋小球藻藻落，用光学显微镜观察确定为保藏的海洋小球藻。用接种环从软化的附着海洋小球藻细胞的固体培养基薄片上刮取呈绿色的藻细胞接种到新鲜的F/2液体培养基上，25℃，持续光照，光照强度为60μmolphotons m-2s-1条件下培养20天，即可见细胞密度较高的绿色微藻液体培养物，用光学显微镜观察到健康完整的该藻细胞。

Claims (7)

1.一种微藻藻种长期保藏方法，其特征在于，将微藻接种于固体培养基上培养，无菌条件下将携带有微藻细胞的固体培养基风干，弱光条件下保藏。
2.根据权利要求1所述的微藻藻种长期保藏方法，其特征在于，具体步骤如下：将微藻接种于固体培养基上，15～30℃，持续光照，光照强度为20～100μmol photons m-2s-1，培养7～14d，无菌条件下将携带有微藻细胞的固体培养基风干，15～30℃，持续光照，光照强度20～100μmol photons m-2s-1条件下保藏。
3.根据权利要求1或2所述的微藻藻种长期保藏方法，其特征在于，所述的微藻为淡水微藻或海洋微藻。
4.根据权利要求3所述的微藻藻种长期保藏方法，其特征在于，所述的淡水微藻为绿球藻。
5.根据权利要求3所述的微藻藻种长期保藏方法，其特征在于，所述的海洋微藻为海洋小球藻。
6.根据权利要求3所述的微藻藻种长期保藏方法，其特征在于，当所述的微藻为淡水微藻时，所述的固体培养基为BG-11固体培养基，当所述的微藻为海洋微藻时，所述的固体培养基为F/2固体培养基。
7.根据权利要求1或2所述的微藻藻种长期保藏方法，其特征在于，所述的固体培养基的厚度为2～3mm。
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