CN105886403A - 微藻藻种的保藏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微藻藻种的保藏方法。所述保藏方法包括如下步骤：步骤一、将微藻培养到稳定生长阶段；步骤二、将培养至稳定生长阶段的微藻的藻液与保存液按照1:1等体积比例混合；步骤三、将混合液保存在温度16‑20℃、光照强度10‑20μE/mol/s、光照时间2‑4小时/天的条件下；其中，所述保存液包括以下质量浓度的组分：氮盐150‑250mg/L；磷盐20‑100mg/l；铁盐5‑7mg/L；EDTA‑Na2 10‑20mg/L；NaHCO3 100‑200mg/L；Gly 1‑2mg/L；甘油10‑50mg/l；VB10.004‑0.008mg/L；VB12 0.03‑0.06mg/L；抗生素30‑100mg/l和植物生长调节剂0.1‑1mg/l。本发明方法不仅操作简单，能够避免杂菌污染，而且能在常温下保种，降低了保种的设施投入，降低了人工成本。

Description

微藻藻种的保藏方法
技术领域
本发明涉及微藻生物技术领域，特别是涉及一种可以中期保藏微藻藻种的方法。
背景技术
藻类是最低等的自养放氧植物，它是低等植物中种类繁多、分布极其广泛的一个类群。无论是海洋、淡水湖泊等水域，或是潮湿的土壤、树干等处，几乎在有光和潮湿的任何地方都能生存。微藻则是指一些微观的单细胞、群体或丝状的藻类，大多数是浮游藻类，生物量大、分布广。藻类通过热解可获得生物质燃油，是重要的可再生生物能源；通过农业化学技术可从一些富含脂肪的微藻中提取油脂，用于制备食用油或生物柴油；藻类中还含有多种维生素、胡萝卜素、蛋白质、脂肪酸等成分，是药用活性物质的重要来源；藻类还可用于污水处理等。据估算，地球上的生物每年通过光合作用可固定8×1010吨碳，生产1.46×1011吨生物质，其中40％应归功于藻类的光合作用。因此，藻类生物与人类的生存和发展有极其密切的关系，是重要的可再生生物资源。
微藻藻种的保藏技术一直是制约生产培养单位藻种正常供应和保存的重要因素。目前微藻保存技术主要包括：继代保存法、干燥保存法、固定化保存法、超低温保存法等。继代保存法是目前普遍采用的方法，该法简单易行，通常在常温或常低温下保存。但是，其缺点是营养盐消耗快，需频繁继代，工作量大，容易发生污染，只能用于藻类的短期保存。干燥保存法目前只能用于某些蓝藻和少数绿藻，且大多存活率低。固定化保种操作较为繁琐，且保存时要求较低的保藏温度(5-8℃)，若要延长保存时间，需进一步降低温度，但是过低的温度又会造成藻种的死亡，而且用固体培养基长期保藏会造成固体培养基表面干燥，所以也需要定期移种，造成污染和杂菌生长。超低温保存可能是微藻长期保存的最好方法，但是需要较为复杂的操作技术和贵重的保存设备，且只能保存微量的藻种，使其广泛应用受到一定的限制。
根据上述分析，目前科研与生产中，微藻藻种保藏方法存在保存时间短、易染杂菌、操作繁琐、复活过程繁琐、所需设备贵重等缺陷。为适应科研生产所需，需要开发出更理想的保藏藻种的方法，弥补或部分弥补现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种微藻藻种的保藏方法。本发明方法不仅操作简单，能够避免杂菌污染，而且能在常温下保种，降低了保种的设施投入，降低了人工成本。
为了达成上述目的，本发明采用如下技术方案：
微藻藻种的保藏方法，包括如下步骤：
步骤一、将微藻培养到稳定生长阶段；
步骤二、将培养至稳定生长阶段的微藻的藻液与保存液按照1:1等体积比例混合；
步骤三、将混合液保存在温度16-20℃、光照强度10-20μE/mol/s、光照时间2-4小时/天的条件下；
其中，所述保存液包括以下质量浓度的组分：氮盐150-250mg/L；磷盐20-100mg/l；铁盐5-7mg/L；EDTA-Na2 10-20mg/L；NaHCO3 100-200mg/L；Gly1-2mg/L；甘油10-50mg/l；VB1 0.004-0.008mg/L；VB12 0.03-0.06mg/L；抗生素30-100mg/l和植物生长调节剂0.1-1mg/l。
所述氮盐最好采用KNO3、NaNO3或CO(NH2)2；所述磷盐最好采用KH2PO4、NaH2PO4；所述铁盐最好采用FeSO4、FeC6H5O7或柠檬酸铁铵；所述甘油可以采用质量浓度为5％的甘油。
本发明方法中，所保藏的微藻藻种可以选自小球藻、微绿球藻、扁藻、三角褐指藻、筒柱藻、角毛藻、球等鞭金藻、绿色巴夫藻、紫球藻中的任何一种。
步骤一中，最好将微藻培养到稳定生长阶段，用显微镜检确定无杂菌后再进行微藻藻种的保存。
其中，所述的抗生素为氨苄霉素、卡拉霉素、链霉素中的一种或两种以上任意比例的混合物。
优选的，所述的抗生素为氨苄霉素、卡拉霉素或链霉素，且所述氨苄霉素的添加浓度为50-100mg/L，所述卡拉霉素或链霉素的添加浓度为30-50mg/L。
其中，所述的植物生长调节剂为调环酸钙、多效唑、调节膦、氯化胆碱或吡啶醇中的一种。
本发明技术方案可以通过以下具体步骤得到进一步实现：
(1)将培养到稳定生长期的藻液镜检，确定无杂菌后待用；
(2)将步骤(1)的藻液加入配制好并无菌化处理的保存液中混匀，藻液、保存液体积为1:1；
(3)将步骤(2)的藻种细胞分装到无菌容器后，对容器进行密封，密封部件都经过无菌化处理，且步骤(2)、步骤(3)在无菌环境中进行；
(4)将分装好的藻种细胞进行保存，保存条件为：温度16-20℃，光照强度10-20μE/mol/s，光照时间2-4小时/天；
(5)定期将保存的藻种取样，用PI-FDA染色法对藻种进行存活率检测；
(6)定期将保存的藻种取样，按照取样液、新f/2培养基1:9的体积比例加入新鲜的f/2(硅藻中加入NaSiO3)，用叶绿色荧光仪测藻新接和生长2天后的活力指标。
本发明与现有技术相比，不仅操作简单、能够避免杂菌污染，而且能够在常温下保存藻种，降低了保种的设施投入，降低了人工成本，从而弥补或部分弥补了现有技术的不足。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
步骤一、配置保存液：KNO3 200mg/L，KH2PO4 20mg/L，柠檬酸铁铵5mg/L，EDTA-Na2 10mg/L，NaHCO3 100mg/L，Gly 1mg/L，0.5％甘油10mg/l，VB1 0.006mg/L，VB12 0.05mg/L，另外添加了50mg/L氨苄霉素和0.1mg/L调环酸钙；
步骤二、取培养在f/2培养基中且生长到稳定期无菌的蛋白核小球藻藻液；将藻液、保存液等体积混合；
步骤三、将混合后的藻液放置在温度16-20℃、光照强度10-20μE/mol/s、光照时间2-4小时/天的条件下保存。
在保存后的0天、1月、3月、6月、12月后分别取样进行纯度分析，并用PI-FDA染色法进行存活率测定。另取藻样，按照藻样、新鲜f/2培养基1:9的比例接藻，在温度20-25℃、光照强度40-50μE/mol/s、光照时间12小时/天的条件下培养，培养中通入0.2vvm的混合气体(含1％CO2)，用叶绿色荧光仪测藻刚接种以及生长2天后的活力指标。
结果如下：
表1.不同保存时间蛋白核小球藻检测结果
蛋白核小球藻在保藏过程中，其细胞存活率虽随着保藏时间的延长逐渐降低，但是保存12个月后，其成活率仍然高达87％；保存藻液在加入新鲜培养基后，很快就进入了生长阶段。
实施例2
步骤一、配置保存液：NaNO3 250mg/L，KH2PO4 50mg/L，柠檬酸铁铵5mg/L，EDTA-Na2 20mg/L，NaHCO3 100mg/L，Gly 1mg/L，0.5％甘油10mg/l，VB1 0.006mg/L，VB12 0.05mg/L，另外添加了50mg/L氨苄霉素和0.1mg/L调环酸钙；
步骤二、取培养在f/2培养基中生长到稳定期无菌的筒柱藻藻液，将藻液、保存液等体积比混合；
步骤三、将混合后的藻液放置在温度16-20℃，光照强度10-20μE/mol/s，光照时间2-4小时/天的条件下保存。
在保存后的0天、1月、3月、6月、12月后分别取样进行纯度分析，并用PI-FDA染色法进行存活率测定。另取藻样，按照藻样、新鲜f/2培养基(加NaSiO3)1:9的比例接藻，用叶绿色荧光仪测藻刚接种、生长2天后的活力指标。
结果如下：
表2.不同保存时间筒柱藻检测结果
筒柱藻在保存12个月后，其成活率仍然不低于40％；保存藻液在加入新鲜培养基后，同样很快就进入了生长阶段。
实施例3
步骤一、配置保存液：KNO3 200mg/L，NaH2PO4 20mg/L，FeC6H5O7 5mg/L，EDTA-Na2 10mg/L，NaHCO3 200mg/L，Gly 2mg/L，甘油20mg/l，VB1 0.004mg/L，VB12 0.03mg/L，另外添加了30mg/L卡拉霉素和0.5mg/L氯化胆碱；
步骤二、取培养在f/2培养基中且生长到稳定期无菌的蛋白核小球藻藻液；将藻液、保存液按照1：1等体积比混合；
步骤三、将混合后的藻液放置在温度16-20℃、光照强度10-20μE/mol/s、光照时间2-4小时/天的条件下保存。
在保存后的0天、1月、3月、6月、12月后分别取样进行纯度分析，并用PI-FDA染色法进行存活率测定。另取藻样，按照藻样、新鲜f/2培养基1:9的比例接藻，在温度20-25℃、光照强度40-50μE/mol/s、光照时间12小时/天的条件下培养，培养中通入0.2vvm的混合气体(含1％CO2)，用叶绿色荧光仪测藻刚接种以及生长2天后的活力指标。
结果如下：
表3.不同保存时间蛋白核小球藻检测结果
蛋白核小球藻在保藏过程中，其细胞存活率虽随着保藏时间的延长逐渐降低，但是保存12个月后，其成活率仍然高达86％；保存藻液在加入新鲜培养基后，很快就进入了生长阶段。
实施例4
步骤一、配置保存液：CO(NH2)2 150mg/L，KH2PO4 50mg/L，FeSO4 7mg/L，EDTA-Na2 15mg/L，NaHCO3 100mg/L，Gly 0.5mg/L，甘油15mg/l，VB1 0.005mg/L，VB12 0.06mg/L，另外添加了80mg/L氨苄霉素和0.3mg/L多效唑；
步骤二、取培养在f/2培养基中生长到稳定期无菌的筒柱藻藻液，将藻液、保存液按照1：1等体积比混合；
步骤三、将混合后的藻液放置在温度16-20℃，光照强度10-20μE/mol/s，光照时间2-4小时/天的条件下保存。
在保存后的0天、1月、3月、6月、12月后分别取样进行纯度分析，并用PI-FDA染色法进行存活率测定。另取藻样，按照藻样、新鲜f/2培养基(加NaSiO3)1:9的比例接藻，用叶绿色荧光仪测藻刚接种、生长2天后的活力指标。
结果如下：
表4.不同保存时间筒柱藻检测结果
筒柱藻在保存12个月后，其成活率仍然不低于40％；保存藻液在加入新鲜培养基后，同样很快就进入了生长阶段。
上述实施例是相对于蛋白核小球藻、筒柱藻而言，微绿球藻、扁藻、三角褐指藻、角毛藻、球等鞭金藻、绿色巴夫藻、紫球藻可以得出类似的结果。
以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作出的等同变化与修改，均应属于本发明保护的范围。

Claims (6)

1.微藻藻种的保藏方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将微藻培养到稳定生长阶段；
步骤二、将培养至稳定生长阶段的微藻的藻液与保存液按照1:1等体积比例混合；
步骤三、将混合液保存在温度16-20℃、光照强度10-20μE/mol/s、光照时间2-4小时/天的条件下；
其中，所述保存液包括以下质量浓度的组分：氮盐150-250mg/L；磷盐20-100mg/l；铁盐5-7mg/L；EDTA-Na2 10-20mg/L；NaHCO3 100-200mg/L；Gly1-2mg/L；甘油10-50mg/l；VB1 0.004-0.008mg/L；VB12 0.03-0.06mg/L；抗生素30-100mg/l和植物生长调节剂0.1-1mg/l。
2.根据权利要求1所述的微藻藻种的保藏方法，其特征在于：所保藏的藻种选自小球藻、微绿球藻、扁藻、三角褐指藻、筒柱藻、角毛藻、球等鞭金藻、绿色巴夫藻、紫球藻中的任何一种。
3.根据权利要求1所述的微藻藻种的保藏方法，其特征在于：步骤一中，将微藻培养到稳定生长阶段，显微镜检确定无杂菌后进行微藻藻种保存。
4.根据权利要求1所述的微藻藻种的保藏方法，其特征在于：所述的抗生素为氨苄霉素、卡拉霉素、链霉素中的一种或两种以上任意比例的混合物。
5.根据权利要求4所述的微藻藻种的保藏方法，其特征在于：所述的抗生素为氨苄霉素、卡拉霉素或链霉素，所述氨苄霉素的添加浓度为50-100mg/L，所述卡拉霉素或链霉素的添加浓度为30-50mg/L。
6.根据权利要求1所述的微藻藻种的保藏方法，其特征在于：所述的植物生长调节剂为调环酸钙、多效唑、调节膦、氯化胆碱或吡啶醇中的一种。
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