CN106399103A - 海水微藻保种方法 - Google Patents

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孙朦朦
于宏
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张文慧
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Abstract

本发明创造提供一种海水微藻保种方法，采用下述组分：葡萄糖，占总体积分数的1％‑5％；甘油，占总体积分数的5％‑15％；浓缩藻液，占总体积分数的75％‑93％；维生素C，与浓缩藻液的质量比为1:(25±5)。本发明创造能够在低温下显著提高藻细胞的存活率。

Description

海水微藻保种方法
技术领域
本发明属于微藻培养技术领域，尤其是涉及一种海水微藻保种的技术方法。
背景技术
微藻营养丰富，是鱼、虾、贝等经济动物人工育苗的基础。特别是海洋微藻，由于富含EPA和DHA，在许多方面受到人们的青睐。在微藻的培养和应用中，保种技术十分重要，它是微藻培养和进一步应用的基础和关键环节。好的保种技术应能保持微藻的优良遗传性状、不易污染、简便易行，从而达到较长期保种的目的。目前仍然存在藻种极易受污染，分离培养方法比较复杂而且耗时较长等问题。因此海水微藻保种的问题制约着海水微藻可持续利用的发展，成为亟待解决的问题。
传统的保种方法为，将海水微藻放置无菌离心管于4℃保存，光照强度为1000---1500lx的条件下保存。该方法存在的缺点：藻液易出现分层，保种时间短，一般为1---2年，且营养盐消耗快，培养基易老化，需要频繁更换培养基，从而增加工作量和劳动成本，细胞存活率较低，仅为27％左右。保种加入的防冻液为：乙二醇，存在的缺点为：乙二醇具有毒性，加大了最终复活提纯分离的难度。
发明内容
有鉴于此，本发明创造提供了一种海水微藻保种方法，能够在低温下显著提高藻细胞的存活率。
本发明创造提供的海水微藻保种方法，采用下述组分：
葡萄糖，占总体积分数的1％-5％；甘油，占总体积分数的5％-15％；浓缩藻液，占总体积分数的75％-93％；维生素C，与浓缩藻液的质量比为1:(25±5)；上述各组分体积之和为100％。
葡萄糖的添加使营养盐更为全面，保证了微藻在低温保存期间的营养供应，以及藻种的活力；维生素C是一种良好的缓冲溶液，为微藻提供相对稳定的环境，维持藻液的稳态，从而避免藻液出现分层现象；同时采用甘油替代乙二醇作为防冻液，皮面低温环境对微藻细胞造成损伤。这三种成分的复配显著提高了藻细胞在更低温度下的存活率，并显著延长了藻细胞的保种时间。
其中，所述浓缩藻液是养殖藻液经离心浓缩至藻密度为|(90±5)％而成的藻液。
进一步，所述浓缩藻液是由f/2培养基在海水中将藻种培养至(5±3)*106个细胞/ml后，再经离心浓缩而成的藻液。
再进一步，所述f/2培养基为微藻培养中的常用培养基，优选的，以重量计，包括如下组分：硝酸钠75份、磷酸二氢钠5份、硅酸钠30份、硫酸锌0.023份、硫酸铜0.01份、氯化锰0.012份、氯化铁3.16份、钼酸钠0.07份、乙二铵四乙酸钠4.36份、氯化钴0.012份、维生素B120.5份、维生素H 0.5份、维生素B10.1份。
再进一步，所述海水为盐度为(30±5)‰的无菌海水。
再进一步，所述f/2培养基的用量为每升海水(119±20)mg。
其中，本案所述保种方法的保种温度为-80℃～4℃；进一步，当保种温度为0℃以下时，采用逐渐降温的方法。
其中，上述各组分的加入顺序为，依次向浓缩藻液中加入葡萄糖、维生素C、甘油；进一步，葡萄糖的加入要均匀分成四等份，分四次加入，并且在每次加入后需要充分混匀、震荡、溶解。葡萄糖分批加入比一次性加入能够使藻细胞的成活率增加，最高可使成活率增加6％。
相对于现有技术，本发明创造具有如下优势：(1)操作简便，不易污染，不具有毒性，容易分离；(2)最高保种时间可由传统的2年增加至8年，有效降低了成本；(3)使用葡萄糖、维生素C、甘油的复配，能够在相同的保种时间和温度下显著提高藻种的成活率，成活率的平均增长率能够达到20％-30％；(4)葡萄糖、维生素C、甘油的复配能够显著降低保种温度，使保种温度低至-80℃，且在低温下相对于常规保种方法显著提高存活率和保种时间；(5)本法适用于大量保种过程。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例1
将海链藻由f/2培养基在盐度30％的无菌海水中培养至5*106个细胞/ml，离心浓缩至藻密度为|90％的浓缩藻液。f/2培养基投入量为每升海水包括如下组分：硝酸钠75mg、磷酸二氢钠5mg、硅酸钠30mg、硫酸锌0.023mg、硫酸铜0.01mg、氯化锰0.012mg、氯化铁3.16mg、钼酸钠0.07mg、乙二铵四乙酸钠4.36mg、氯化钴0.012mg、维生素B12 0.5mg、维生素H0.5mg、维生素B10.1mg。
无菌条件下，向得到的浓缩藻液中依次加入葡萄糖、维生素C、甘油，其中葡萄糖分四等份，分四次加入，并且在每次加入后充分混匀、震荡、溶解。其中，葡萄糖的体积含量为4﹪，甘油的体积含量为10％，浓缩藻液和维生素C的体积含量为86％，浓缩藻液重量为40g，添加维生素C的质量为16g。
降温至4℃进行保存；保存时锡箔纸遮光处理；保存时间4个月。
相比实验室原有方法，无分层现象；成活率达到75％至90％，藻细胞成活率相对于实验室原始方法平均增长了20％至30％。
实施例2
将球等鞭金藻由f/2培养基在盐度30％的无菌海水中培养至5*106个细胞/ml，离心浓缩至藻密度为|90％的浓缩藻液。f/2培养基投入量为每升海水包括如下组分：硝酸钠75mg、磷酸二氢钠5mg、硅酸钠30mg、硫酸锌0.023mg、硫酸铜0.01mg、氯化锰0.012mg、氯化铁3.16mg、钼酸钠0.07mg、乙二铵四乙酸钠4.36mg、氯化钴0.012mg、维生素B12 0.5mg、维生素H0.5mg、维生素B10.1mg。
无菌条件下，向得到的浓缩藻液中依次加入葡萄糖、维生素C、甘油，其中葡萄糖分四等份，分四次加入，并且在每次加入后充分混匀、震荡、溶解。其中，葡萄糖的体积含量为4﹪，甘油的体积含量为10％，浓缩藻液和维生素C的体积含量为86％，浓缩藻液重量为40g，添加维生素C的质量为16g。
降温至0℃进行保存；保存时锡箔纸遮光处理；保存时间4个月。
相比实验室原有方法，无分层现象；成活率达到38％至52％。
实施例3
将球等鞭金藻由f/2培养基在盐度30％的无菌海水中培养至5*106个细胞/ml，离心浓缩至藻密度为|90％的浓缩藻液。f/2培养基投入量为每升海水包括如下组分：硝酸钠75mg、磷酸二氢钠5mg、硅酸钠30mg、硫酸锌0.023mg、硫酸铜0.01mg、氯化锰0.012mg、氯化铁3.16mg、钼酸钠0.07mg、乙二铵四乙酸钠4.36mg、氯化钴0.012mg、维生素B12 0.5mg、维生素H0.5mg、维生素B10.1mg。
无菌条件下，向得到的浓缩藻液中依次加入葡萄糖、维生素C、甘油，其中葡萄糖分四等份，分四次加入，并且在每次加入后充分混匀、震荡、溶解。其中，葡萄糖的体积含量为8﹪，甘油的体积含量为15％，浓缩藻液和维生素C的体积含量为77％，浓缩藻液重量为36g，添加维生素C的质量为14.4g。
逐渐降温至-80℃进行保存；保存时锡箔纸遮光处理；保存时间4个月。
成活率达到5％至15.4％。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种海水微藻保种方法，采用下述组分：
葡萄糖，占总体积分数的1％-5％；甘油，占总体积分数的5％-15％；浓缩藻液，占总体积分数的75％-93％；维生素C，与浓缩藻液的质量比为1:(25±5)；上述各组分体积之和为100％。
2.根据权利要求1所述的海水微藻保种方法，其特征在于，所述浓缩藻液是养殖藻液经离心浓缩至藻密度为|(90±5)％而成的藻液。
3.根据权利要求1所述的海水微藻保种方法，其特征在于，所述浓缩藻液是由f/2培养基在海水中将藻种培养至(5±3)*106个细胞/ml后，再经离心浓缩而成的藻液。
4.根据权利要求3所述的海水微藻保种方法，其特征在于，所述f/2培养基以重量计，包括如下组分：硝酸钠75份、磷酸二氢钠5份、硅酸钠30份、硫酸锌0.023份、硫酸铜0.01份、氯化锰0.012份、氯化铁3.16份、钼酸钠0.07份、乙二铵四乙酸钠4.36份、氯化钴0.012份、维生素B12 0.5份、维生素H 0.5份、维生素B10.1份。
5.根据权利要求3所述的海水微藻保种方法，其特征在于，所述海水为盐度为(30±5)‰的无菌海水。
6.根据权利要求3所述的海水微藻保种方法，其特征在于，所述f/2培养基的用量为每升海水(119±20)mg。
7.根据权利要求1所述的海水微藻保种方法，其特征在于，本案所述保种方法的保种温度为-80℃～4℃。
8.根据权利要求7所述的海水微藻保种方法，其特征在于，当保种温度为0℃以下时，采用逐渐降温的方法。
9.根据权利要求1所述的海水微藻保种方法，其特征在于，各组分的加入顺序为，依次向浓缩藻液中加入葡萄糖、维生素C、甘油。
10.根据权利要求9所述的海水微藻保种方法，其特征在于，葡萄糖的加入要均匀分成四等份，分四次加入，并且在每次加入后需要充分混匀、震荡、溶解。
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