CN107815417B - 寇氏隐甲藻的低温保存方法 - Google Patents

寇氏隐甲藻的低温保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种寇氏隐甲藻的低温保存方法，包括以下步骤将寇氏隐甲藻活化和培养后获得的藻细胞加入培养基中，获得藻细胞藻细胞培养液；将冻存保护液与藻细胞培养液混合生成保种液后分装于冻存管中，冻存管进行预冻降温处理，降至‑40±1℃后，放入低温冰箱或液氮罐中保存。本发明解决了寇氏隐甲藻低温液体保存过程中存活率低、藻种难以复苏及复苏后细胞活力低、发酵产量降低等技术难题。该方法操作简单、方便，成本低廉，适用于以寇氏隐甲藻为材料的科研和生产开发活动中藻种的保存。

Description

寇氏隐甲藻的低温保存方法
技术领域
本发明涉及微藻生物技术领域，更具体涉及到一种寇氏隐甲藻的低温保存方法。
背景技术
寇氏隐甲藻是一种海洋双鞭毛甲藻，可通过人工发酵培养，利用有机碳、氮源合成并积累二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)。DHA俗称脑黄金，是一种对人体非常重要的不饱和脂肪酸，属于ω-3不饱和脂肪酸家族中的重要成员。DHA是神经系统细胞生长及维持的一种主要成分，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20％，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50％，因此，对婴幼儿智力和视力发育至关重要，同时对成年人健康的维持也起着非常重要的作用，因而在水产养殖、动物饲料、食品、药品等行业中有广泛的用途。由于寇氏隐甲藻细胞油脂中富含DHA，而其他多不饱和脂肪酸含量较少，是生产人体所需DHA的良好来源。但与其他富含人体必需多不饱和脂肪酸的海洋真菌，如裂殖壶菌相比，目前利用隐甲藻发酵生产DHA的生产实践并不多见，其主要原因除了隐甲藻对培养条件要求较高，产量相对较低之外，藻种的保存及活力的维持也是制约隐甲藻产业化开发的瓶颈问题之一。国内外对寇氏隐甲藻积累DHA及其发酵条件和破壁方法有了较多研究，而对其有效的保存方法和操作则鲜有报道。
目前微藻的保藏方法有继代培养法、固定化保存法、浓缩低温保存法、冷冻干燥法等。隐甲藻细胞在合适的培养条件下可大量积累脂肪酸油脂，且营养细胞具有游动性，保种时保护剂的使用或保存条件不当时，极易引起细胞受损，导致破裂和油脂外溢，造成存活率低和复苏后细胞活力降低，丧失游动性，并最终导致生长缓慢、生物量低，使研究工作和生产活动无法正常进行。因此，目前隐甲藻保种一般多采用固定化传代保存法，即将藻细胞接种于固体平板或斜面培养基上，待有明显菌落生长后，置于室温或4℃冰箱中保存，1-3个月传代一次。该方法需要定期传代，操作繁琐、工作量大，且极易污染和导致藻种性状退化等。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种寇氏隐甲藻的低温保存方法。
本发明的技术方案如下：一种寇氏隐甲藻的低温保存方法，包括以下步骤
S1将寇氏隐甲藻活化和培养后获得的藻细胞加入到灭菌的锥形底塑料离心管中，置于25±1℃、无菌条件下静置沉降10-30min，用移液枪吸取去掉上清液，向收集到的藻细胞中加入培养基，轻摇使藻细胞悬浮并混合均匀，并调整培养基用量，获得藻细胞密度约为2×107个/ml的藻细胞培养液；
S2将灭菌的甘油与稀释液Dsolution按照体积比6:4的比例混合，配制成冻存保护液；
S3按照体积比为(0.8-1.2):1的比例将步骤S2中冻存保护液与步骤S1中藻细胞培养液混合生成保种液，充分摇匀后，按1.0-2.0ml/管分装于冻存管中，密封并做好标记；
S4将步骤S3标记好的冻存管进行预冻降温处理，降至-40±1℃后，放入低温冰箱或液氮罐中保存。
优选地，步骤S2中稀释液Dsolution的配方为：每100ml含NaCl 1.5-2.0g，MgSO40.1-0.5g，CaCl2·2H2O 0.01-0.05g，KCl0.05-0.1g，(NH4)2SO4 0.01-0.05g，乙酸钠0.1-0.5g，Tris0.0.5-0.1g。
优选地，步骤S4中预冻降温程序为：4℃冷冻15-30min，-20℃冷冻50-70min，-40℃冷冻50-70min。
优选地，步骤S1中寇氏隐甲藻的活化和培养包括以下步骤：
S1.1从斜面或平板培养物中用接种环挑取单藻落，接种于10ml已灭菌的培养基中，25±1℃,150rpm摇床中振荡培养48-96小时；
S1.2无菌条件下取样进行显微镜观察，选择细胞游动性好、大小均匀且胞内油滴积累明显的培养物，按照5-10％的接种量转接到50ml已灭菌的培养基中,25±1℃,150rpm摇床中振荡培养24-72小时，得二代培养物藻细胞；
S1.3重复步骤S1.2,获得三代培养物藻细胞。
优选地，步骤S3中保种液中甘油的终浓度为30％。
本发明的有益效果是：
1)本发明解决了寇氏隐甲藻低温液体保存过程中存活率低、藻种难以复苏及复苏后细胞活力低、发酵产量降低等技术难题。该方法操作简单、方便，成本低廉，适用于以寇氏隐甲藻为材料的科研和生产开发活动中藻种的保存。
2)本发明利用一定浓度甘油作保护剂，采用特定的降温流程的超低温保存方法，可以维持较高的存活率，复苏后细胞活力高，发酵生物量高，同时该方法便于长期保存、减少传代次数，因而降低杂菌污染和藻种退化几率。
3)可以保持较高的存活率和细胞活力，便于开展以寇氏隐甲藻为材料的实验研究工作和生产开发活动
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
附图说明
图1为寇氏隐甲藻保存种正交实验条件表；
图2为各因素与冻存复苏后细胞密度的关系图；
图3为本发明方法与常规方法对菌种AT30772的保存效果比较；
图4为各实验组冻存后细胞发酵能力测试结果示意图。
具体实施方式
为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进一步介绍和说明。
以下通过具体实施例1和2，以寇氏隐甲藻ATCC30772为例，对本发明的一种寇氏隐甲藻的低温保存方法进行说明。
实验设计：选择降温速率、保护剂浓度和保存盐缓冲液盐度为因子，各取3个水平进行L9(34)正交试验，见图1。降温速率(A)表示藻种分别在4℃、-20℃和-40℃预冻时间，其中3个水平分别为A1(10min，30min，2h)、A2(20min，1h，1h)、A3(30min，2h，30min)；保护剂甘油终浓度(B)3个水平分别为B1(7.5％)、B2(15％)、B3(30％)；保存盐缓冲液(C)通过采用不同盐缓冲液改变冻存保护液盐度和缓冲范围，3个水平分别为C1(100％Dsolution)、C2(生理盐水：Dsolution＝1:1)、C3(100％生理盐水)。
冻存保护液含保护剂甘油和保存盐缓冲液。
实施例1：寇氏隐甲藻ATCC30772的低温保存。
1)在无菌操作台中，从生长良好的寇氏隐甲藻ATCC30772平板培养物中用接种环挑取单藻落，接种于10ml新鲜灭菌的液体培养基中，轻摇使藻落松散开，置于25±1℃,转速为150rpm的摇床中振荡培养72小时；
2)观察上述步骤中的培养物，待其浊度变大，培养基颜色由棕黄色逐渐变浅后，在无菌条件下取样在显微镜下进行镜检，确定无杂菌污染后，选择细胞游动性好、大小均匀且胞内油滴积累明显的培养物，按照5％的接种量转接到250ml培养瓶中，内装50ml新鲜灭菌的液体培养基，继续按上述“置于25±1℃,转速为150rpm的摇床中振荡培养72小时”的条件培养48小时，此为二代培养物藻细胞；并重复此步骤获得三代培养物藻细胞；
3)培养结束后，将获得的三代培养物藻细胞转到已灭菌的50ml锥形底塑料离心管中，置于25±1℃、无菌条件下静置沉降约30min，待藻细胞沉降堆积至离心管锥底部，用移液枪小心吸取上清液，弃去，尽量吸完全。然后向收集到的藻细胞中加入新鲜培养基，轻摇使悬浮并混合均匀。取少量混合物在显微镜下计数，并根据计数结果用新鲜培养基调整密度，使藻细胞培养液中藻细胞密度达到约2×107个/ml；
4)按照实验设计方案，将制备好的藻细胞培养液与冻存保护液按照1:1(体积比)的比例混合形成保种液，使得保种液中甘油终浓度(B)达到3个水平，分别为B1(7.5％)、B2(15％)、B3(30％)；保存盐缓冲液盐度(C)3个水平分别为为C1(100％Dsolution)、C2(生理盐水：Dsolution＝1:1)、C3(100％生理盐水)，加上预冻方案A的3个水平，共9个实验，每个实验设置3个平行，一共27组。充分摇匀，按1.5ml/管分装保种液于冻存管中，密封并做好标记；
5)将标记好的冻存管按照预冻方案A设计的三种降温速率进行预冻处理，分别是A1(4℃10min，-20℃30min，-40℃2h)、A2(4℃20min，-20℃1h，-40℃1h)、A3(4℃30min，-20℃2h，-40℃30min)，降至-40±1℃后，将冻存管放入低温冰箱或液氮罐中保存。
6)冻存管低温保存90天后，取出保种液快速置于37℃水浴中融化，在无菌环境下迅速取1ml保种液接种至装有10ml新鲜灭菌液体培养基的50ml三角瓶中，25±1℃，150r/min摇床培养。
7)培养4天后进行细胞镜检和细胞计数，细胞密度最高可达7.21×106个/L，分析冻存复苏后藻细胞密度与各因素之间的相关性表明，最适合保存方案为A2B3C1，即4℃、-20℃和-40℃分别预冻20min，1h，1h，甘油浓度为30％，冻存盐缓冲液采用100％的Dsolution。
实施例2：寇氏隐甲藻ATCC30556的低温保存。
一种寇氏隐甲藻低温保存方法，包括以下步骤：
1)在无菌操作台中，从生长良好的寇氏隐甲藻ATCC30556平板培养物中用接种环挑取单藻落，接种于10ml新鲜灭菌的液体培养基中，轻摇使藻落松散开，置于25±1℃,转速为150rpm的摇床中振荡培养72小时；
2)观察上述步骤中的培养物，待其浊度变大，培养基颜色由棕黄色逐渐变浅后，在无菌条件下取样在显微镜下进行镜检，确定无杂菌污染后，选择细胞游动性好、大小均匀且胞内油滴积累明显的培养物，按照5％的接种量转接到250ml培养瓶中，内装50ml新鲜灭菌的液体培养基，继续“按25±1℃,转速为150rpm的摇床中振荡培养72小时”的条件培养40小时，此为二代培养物藻细胞；并重复此步骤获得三代培养物藻细胞；
3)培养结束后，将获得的三代培养物藻细胞转到已灭菌的50ml锥形底塑料离心管中，置于25±1℃、无菌条件下静置沉降约30min，待藻细胞沉降堆积至离心管锥底部，用移液枪小心吸取上清液，弃去，尽量吸完全。然后向收集到的细胞中加入新鲜培养基，轻摇使悬浮并混合均匀。取少量混合物在显微镜下计数，并根据计数结果用新鲜培养基调整密度，使藻细胞培养液中藻细胞密度达到约2×107个/ml；
4)按照实验设计方案，将制备好的藻细胞培养液与冻存保护液按照1:1(体积比)的比例混合生成保种液，使得保种液中甘油终浓度(B)达到3个水平，分别为B1(7.5％)、B2(15％)、B3(30％)；保存盐缓冲液盐度(C)3个水平分别为为C1(100％Dsolution)、C2(生理盐水：Dsolution＝1:1)、C3(100％生理盐水)，加上预冻方案A的3个水平，共9个实验，每个实验设置3个平行，一共27组。充分摇匀，1.5ml/管分装保种液于冻存管中，密封并做好标记；
5)将标记好的冻存管按照预冻方案A设计的三种降温速率进行预冻处理，分别是A1(4℃10min，-20℃30min，-40℃2h)、A2(4℃20min，-20℃1h，-40℃1h)、A3(4℃30min，-20℃2h，-40℃30min)，降至-40±1℃后，放入低温冰箱或液氮罐中保存。
6)低温保存90天后，取出保种液快速置于37℃水浴中融化，在无菌环境下迅速取1ml保种物接种至装有10ml新鲜灭菌液体培养基的50ml三角瓶中，25±1℃，150r/min摇床培养，培养4天后取样进行细胞观察和计数，细胞密度最高为6.15×106个/ml；分析冻存复苏后藻细胞密度与各因素之间的相关性表明最适合保存方案为A2B3C1，即4℃、-20℃和-40℃分别预冻20min，1h，1h，甘油浓度为30％，冻存盐缓冲液采用100％的Dsolution。
实施例3本发明方法与常规方法对ATCC30772的保种效果比较
为验证本发明方法的实施效果，采用常规的固体平板保种法和低温甘油管冻存法，以复苏率为评价指标，与本发明方法进行了对比。具体包括以下内容：
1)以寇氏隐甲藻ATCC30772为研究对象，以三代培养物作为保种起始物，分别采用以下三种方法保存：①固体平板保种法：用接种环蘸取少许培养物，以“Z”型划线接种至新鲜制备的隐甲藻固体培养基上，倒置于25±1℃的生化培养箱中，培养约5天左右，直至培养基表面形成饱满菌苔，将培养皿用铝箔包裹并标记后，置于4℃冰箱保存；②常规低温冻存法：基本操作方法同本发明，不同之处在于所用甘油浓度为常规的7.5％和15％，稀释液采用新鲜培养基或生理盐水，菌种与保护剂混匀后放入梯度降温盒中，然后置于-80℃冰箱保存。③本发明方法。每种保存方法设置5个平行；
2)分别于保存三个月和六个月后，取各实验组的保存的菌种接种于装有10ml新鲜液体培养基的50ml三角瓶中，25±1℃，150r/m摇床复苏培养5天。无菌条件下取样进行显微镜检查，以培养物中出现游动细胞，且培养物浊度明显变大(OD600nm>0.5)为评价标准。复苏时每个保种物设置3组平行；
3)结果显示固体平板保种法保存3个月，复苏率可以达到80％以上，保存6个月复苏率降至20％；常规低温保存法3个月和6个月菌种复苏率均低于30％；本发明方法3个月和6个月菌种复苏率均为100％。复苏率计算方法为：复苏率＝可复苏样本数÷检验样本总数×100。
实施例4冻存复苏后寇氏隐甲藻细胞发酵能力测试
1)以寇氏隐甲藻ATCC30772为研究对象，按照实施例1和2的方法进行冻存保种，于-80℃保存90天后，取各实验组的保种液分别于37℃水浴中快速融化后迅速取1.0ml保种液接种至装有10ml新鲜液体培养基的50ml三角瓶中，25℃，150r/m摇床复苏培养5天；
2)取复苏的藻细胞培养液5.0ml接种至装有50ml新鲜液体培养基的250ml三角瓶中，25℃，150r/m摇床培养2天，得二代培养物藻细胞；
3)取二代培养物藻细胞5.0ml接种至装有50ml新鲜液体培养基的250ml三角瓶中进行发酵培养，摇床培养60h后，取10ml发酵液1000rpm，离心5min，弃去上清，用去离子水洗涤2次，置于事先称重的滤纸上，烘干至恒重，测定生物量，6号实验组保存方案为A2B3C1，即4℃、-20℃和-40℃分别预冻20min，1h，1h，甘油浓度为30％，冻存盐缓冲液采用100％的Dsolution，发酵生物量最高，达到7.05g干重/L。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (1)

1.一种寇氏隐甲藻的低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤
S1将寇氏隐甲藻活化和培养后获得的藻细胞加入到灭菌的锥形底塑料离心管中，置于25±1℃、无菌条件下静置沉降30min，用移液枪吸取去掉上清液，向收集到的藻细胞中加入培养基，轻摇使藻细胞悬浮并混合均匀，并调整培养基用量，获得藻细胞密度为2×107个/ml的藻细胞培养液；
S2将灭菌的甘油与稀释液100%的D solution按照体积比为6:4的比例混合，配制成冻存保护液；
S3按照体积比为（0.8-1.2）:1的比例将步骤S2中冻存保护液与步骤S1中藻细胞培养液混合制成保种液，充分摇匀后，按1.0-2.0ml/管分装于冻存管中，密封并做好标记；保种液中甘油的终浓度为30%；
S4将步骤S3标记好的冻存管进行预冻降温处理，降温速率为4℃ 20min，-20℃ 1h，-40℃ 1h，降至-40±1℃后，放入低温冰箱或液氮罐中保存；
步骤S2中稀释液D solution的配方为：每100ml含NaCl 1.5-2.0g，MgSO4 0.1-0.5g，CaCl2·2H2O 0.01-0.05g，KCl 0.05-0.1g，(NH4)2SO4 0.01-0.05g，乙酸钠0.1-0.5g，Tris0.0.5-0.1g；
步骤S1中寇氏隐甲藻的活化和培养包括以下步骤：
S1.1从斜面或平板培养物中用接种环挑取单藻落，接种于10ml已灭菌的培养基中，25±1℃,150rpm摇床中振荡培养48-72小时；
S1.2无菌条件下取样进行显微镜观察，选择细胞游动性好、大小均匀且胞内油滴积累明显的培养物，按照5-10%的接种量转接到50ml已灭菌的培养基中,25±1℃,150rpm摇床中振荡培养40-48小时，得二代培养物藻细胞；
S1.3重复步骤S1.2,获得三代培养物藻细胞。
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