CN108359606A - 一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水产养殖水质调控和水域环境治理技术领域，具体涉及一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液及其制备方法和用途，制备方法包括纯种卵囊藻的分离和培育、高活性且抗逆性强的卵囊藻的选育、扩大培养、产业化培养以及收集、浓缩和等步骤，并在温度23～28℃、光照1800～2000Lx的条件下连续充气培养。与现有技术相比，本发明的卵囊藻浓缩液浓度可达1300～1500万个/ml，常温下保存95～105天，成活率达95％以上，方便储存、运输和使用；卵囊藻具有高活性和强抗逆性，其藻相稳定，能够长期保持养殖池的水质处于良性的平衡状态，可用于制备海水或半咸水海产品养殖池塘的藻相稳定剂，其具有非常好的产业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖水质调控和治理技术领域，具体涉及一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液及其制备方法和用途。
背景技术
卵囊藻(Oocystis)属于绿藻门(Chlorophyta)，共球藻纲(Trebouxiophyceae)，小球藻目(Chlorellales)，卵囊藻科(Oocystaceae)。植物体为球形或者是椭圆形的球形群体，群体通常是由2、4或8个细胞组成，在群体外有一层果胶质构成的胶质包被。藻细胞为椭圆形或者卵圆形，细胞长10-19μm，宽9-13μm，一般情况下产生2、4、8或16个似亲孢子。卵囊藻主要分布于河口和水产养殖池塘等富含有机物的水体中，具有持续时间长和种群稳定等特点，能降低水体中的氨氮、亚硝酸盐等有害因子的浓度，提高水中的溶氧，从而使水环境处于良性的平衡状态，抑制弧菌的生长。
目前的水产养殖方式主要以工厂化养殖池、高位池、土池等海水或半咸水养殖池塘为主。对虾养殖业是我国海水养殖业的支柱产业，而我国在发展对虾养殖的过程中，始终受到各种对虾病害问题的威胁。通过生物技术调控养殖水域中微生物群落的结构与功能来预防疾病，是对虾养殖生态防病的重要内容。卵囊藻广泛存在于南方对虾养殖池，种群稳定，适应能力强，可调控和改善养殖环境并防止对虾疾病。
传统的卵囊藻培养方式是采用开放水泥池培养，其培养规模大，产量高，但缺点是：(1)易污染，占地面积大，受天气影响大，不易掌控，而且藻细胞生长缓慢、倍增时间长、一次性投资大而产量低，不适用于扩种阶段；(2)传统方式所培育的卵囊藻藻相不够稳定，易老化和倒藻，其用于对虾等养殖池塘特别是养殖中后期时，会出现池塘水质不稳定，藻相不利于对虾的生长，发生倒藻现象，死亡的藻类会产生大量藻毒素，进而导致对虾等海产品的死亡；(3)传统方式所培育的卵囊藻难以在常温下进行长时间的存储和运输，给使用造成不便。这些导致卵囊藻难以在实际生产中得到大规模的应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液及其制备方法和用途，该方法制备的卵囊藻浓缩液的浓度可达1300～1500万个/ml，具有较高活性和较强抗逆性，其藻相稳定，不易发生老化和倒藻的现象，因而可用于制备海水或半咸水海产品养殖池塘的藻相稳定剂。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
提供一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、纯种卵囊藻的分离
由高产对虾养殖池中采集出卵囊藻样品，然后显微镜下分离并选取卵囊藻细胞；
步骤二、纯种卵囊藻的培育
将步骤一选取的卵囊藻细胞，接种至卵囊藻专用培养基中，在温度为23～28℃、光照1800～2000Lx的条件下连续充气培养纯化，12～18天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液1号25ml；
步骤三、高活性且抗逆性强的卵囊藻的选育
(1)取步骤二制备的卵囊藻纯种液1号25ml，接种到装有5000ml卵囊藻专用培养基的三角烧瓶中，并在温度为23～28℃、光照1800～2000Lx的条件下连续充气培育，6～9天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液2号250ml，卵囊藻浓度达到1300～1500万个/ml；
(2)将步骤三(1)制备的卵囊藻纯种液2号250ml放于阴凉透气的环境中保藏，在静置中沉淀95～105天；
(3)将步骤三(2)的经静置沉淀95～105天的卵囊藻纯种液2号接种到装有5000ml卵囊藻专用培养基的三角烧瓶中，并在温度为23～28℃、光照1800～2000Lx的条件下连续充气培育，12～18天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液3号250ml，卵囊藻浓度为1300～1500万个/ml；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)的步骤，至少重复三次以上进行反复选育后，获得高活性且抗逆性强的卵囊藻藻种1号；
步骤四、扩大培养
(1)一级扩大培养：
将步骤三(4)选育出的高活性且抗逆性强的卵囊藻种1号250ml，接种至装有一级扩大培养基的50000ml培藻罐中进行一级扩大培养，控制在温度为23～28℃、光照1800～2000Lx的条件下连续充气培养，5～9天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，停止充气，沉淀后排去上层清液，获得一级扩大卵囊藻种2500ml，藻种浓度1300-1500万个/ml；
(2)二级扩大培养：
将所述一级扩大卵囊藻种2500ml接种至装有二级扩大培养基的500000ml培藻罐中进行二级扩大培养，控制在温度为23～28℃、光照1800～2000Lx的条件下连续充气培养，5～9天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，获得二级扩大培养藻种500000ml，藻种浓度65-75万个/ml。
步骤五、产业化培养
(1)卵囊藻产业化车间和生产线的准备：
每个车间设有供氧系统、温控系统、供水系统和光控系统，每个车间设置有至少一条卵囊藻生产线，每条生产线设置多个有效容量为200×104ml的培藻罐，培藻罐预先用100ppm的强氯精溶液彻底消毒，并用无菌海水清洗干净备用；
(2)向每个培藻罐中加入无菌海水200×104ml、硝酸钾：100g、磷酸二氢钾：10g、三氯化铁：5g、维生素B1：3g、维生素B12：0.2g、氨基酸培藻素：6g、植物细胞分裂素：1000国际单位、九二0植物生长激素1200国际单位，连续充氧2h；
(3)向每个培藻罐内接入所述二级扩大卵囊藻种25000ml，进行产业化培养，控制在温度为23～28℃、光照1800～2000Lx的条件下连续充气培养，5～7天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，获得的卵囊藻液即可进行浓缩收集；
步骤六、收集和浓缩
将步骤五(3)获得的所述卵囊藻液抽到专用沉淀浓缩装置，经48小时沉淀，排掉上层清液，收取下层浓缩藻液，然后加入无菌海水、硝酸钾10ppm，磷酸二氢钾1ppm、维生素B10.1ppm，维生素B 120.01ppm；用分光光度计进行检测，密度控制在1300～1500万个细胞/ml，即得到高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液。
上述技术方案中，步骤三中的步骤(1)中，所述卵囊藻专用培养基由以下配比的组分制成：
所述卵囊藻专用培养基的比重为1.010～1.016，pH值为8.0～8.4。
上述技术方案中，所述卵囊藻专用培养基由以下配比的组分制成：
上述技术方案中，步骤四中的步骤(1)中，所述一级扩大培养基由以下配比的组分制成：
所述一级扩大培养基的比重为1.010～1.016，pH值为8.0～8.4；
上述技术方案中，步骤四中的步骤(2)中，所述二级扩大培养基由以下配比的组分制成：
所述二级扩大培养基的比重为1.010～1.016，pH值为8.0～8.4。
上述技术方案中，所述无菌海水的制备方法为：将海水经陶氏超微过滤装置过滤后，加入强氯精15～25ppm，充气2h使药物充分溶解，然后停止充气，沉淀24h后，加入硫代硫酸钠5～10ppm中和剩余的氯，并用淀粉碘化钾液测定无菌海水中的氯含量，控制无菌海水中不残留有效氯成份。
上述技术方案中，还包括步骤七、分装：将步骤六获得的高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液进行分装保存，分装为瓶装、管装或桶装。
本发明还提供一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液，所述卵囊藻浓缩液是上述制备方法制备而成的，所述高活性卵囊藻浓缩液中的卵囊藻浓度为1300～1500万个/ml。
本发明还提供上述高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液用于制备海水或半咸水海产品养殖池塘的藻相稳定剂的新用途。
上述技术方案中，所述海水或半咸水海产品包括鱼类、对虾类、蟹类和贝类。
本发明的有益效果是：
本发明的一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液的制备方法，是由高产对虾养殖池中分离出的纯种卵囊藻，采用专用培养基，依次经过高盐度、高酸碱度、各种理化因子等抗逆性培养、选育步骤而筛选出具有高活性和抗逆性强的卵囊藻藻种，再通过二级扩大培养和产业化培养后，经过浓缩而获得的卵囊藻浓缩液，其浓度达到1300～1500万个/ml。其与现有技术相比，该卵囊藻浓缩液具有以下优点：
(1)本发明选育的卵囊藻具有高活性和抗逆性强的优点，藻相稳定，不易老化和倒藻，能够长期保持养殖池的水质处于良性的平衡状态，从而有利于对虾等海产品的生长，进而提高养殖产量，降低养殖成本；
(2)本发明的卵囊藻浓缩液的浓度高达1300～1500万个/ml，能够在常温下保存95～105天，成活率达95％以上，藻色依然保持翠绿，适合产业化的大规模生产，而且该卵囊藻浓缩液易于分装存储和运输，使用非常方便；
(3)本发明的卵囊藻浓缩液可用于制备海水或半咸水养殖池塘的藻相稳定剂，适用于工厂化养殖池、高位池、土池等海水或半咸水养殖池的水质调节使用，特别适用于藻相不宜对虾生长、水色不稳定、出现倒藻现象、虾苗下塘前池塘培藻肥水困难的情况，故其具有广阔的产业化应用前景；
(4)本发明的卵囊藻能够以养殖池的残饵、粪便以及有害的代谢产物(氨氮、硫化氢、亚硝酸盐、重金属等)作为养分，起到净化水质的作用，从而无需经常更换养殖池用水，降低污水排，具有高效、环保、安全的优点，可广泛应用于水产养殖水质环境的调控和水域污染的治理；
(5)本发明的卵囊藻还能够抑制对虾病菌，有效防控病害，特别对于蓝藻和发光菌这类有害藻菌起到特效的抑制作用，从而减少抗生素等药物的使用，更加安全可靠。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液的制备方法，包括以下步骤：
骤一、纯种卵囊藻的分离
由高产对虾养殖池中采集出卵囊藻样品，然后显微镜下分离并选取卵囊藻细胞。
步骤二、纯种卵囊藻的培育
(1)按以下配比，制备卵囊藻专用培养基：
所制备的卵囊藻专用培养基的比重为1.011，pH值为8.1。
(2)制备卵囊藻纯种液
将步骤一选取的卵囊藻细胞，接种至上述卵囊藻专用培养基中，并在温度为25℃、光照2000Lx的条件下连续充气培养纯化，12～18后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时，停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液1号25ml。
步骤三、高活性且抗逆性强的卵囊藻的选育
(1)取步骤二制备的卵囊藻纯种液1号25ml接种至装有5000ml卵囊藻专用培养基的三角烧瓶中，并在温度为25℃、光照2000Lx的条件下连续充气培育，6～9天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液2号250ml，卵囊藻浓度达到1500万个/ml；
(2)将步骤三(1)制备的卵囊藻纯种液2号250ml放于阴凉透气的环境中保藏，在静置中沉淀95～105天，然后排去上层清液，获得卵囊藻沉淀浓缩液；
(3)将步骤三(2)的经静置沉淀95～105天的卵囊藻纯种液2号接种到装有5000ml卵囊藻专用培养基的三角烧瓶中，并在温度为25℃、光照2000Lx的条件下连续充气培育，12～18天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液3号250ml，卵囊藻浓度为1500万个/ml；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)的步骤，重复三次进行反复选育后，获得高活性且抗逆性强的卵囊藻1号。
步骤四、扩大培养
(1)一级扩大培养：
将步骤三(4)选育出的高活性且抗逆性强的卵囊藻种1号250ml，接种至装有一级扩大培养基的50000ml培藻罐中进行一级扩大培养，控制在温度为25℃、光照2000Lx的条件下连续充气培养，5～9天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，停止充气，沉淀后排去上层清液，获得一级扩大卵囊藻种2500ml。其中，一级扩大培养基由以下配比的组分制成：
一级扩大培养基的比重为1.015，pH值为8.4；
(2)二级扩大培养：
将所述一级扩大卵囊藻种2500ml接种至装有二级扩大培养基的500000ml培藻罐中进行二级扩大培养，控制在温度为25℃、光照2000Lx的条件下连续充气培养，5～9天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，获得二级扩大培养藻种500000ml，藻种浓度65-75万个/ml。其中，二级扩大培养基由以下配比的组分制成：
二级扩大培养基的比重为1.012，pH值为8.3。
步骤五、产业化培养
(1)卵囊藻产业化车间和生产线的准备：
每个车间面积1000平方米，设有供氧系统、温控系统、供水系统和光控系统，每个车间由两条生产线构成，每条生产线有150个PE塑料培藻罐，培藻罐有效容量为200×104ml；车间和生产线的培藻罐预先用100ppm的强氯精溶液彻底消毒，并用无菌海水清洗干净备用；
(2)向每个培藻罐中加入无菌海水200×104ml、硝酸钾：100g、磷酸二氢钾：10g、三氯化铁：5g、维生素B1：3g、维生素B12：0.2g、氨基酸培藻素：6g、植物细胞分裂素：1000国际单位、九二0植物生长激素1200国际单位，连续充氧2h；
(3)向每个培藻罐内接入所述二级扩大卵囊藻种25000ml，进行产业化培养，控制在温度为25℃、光照2000Lx的条件下连续充气培养，5～7天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，获得的卵囊藻液即可进行浓缩收集；
步骤六、收集和浓缩
将步骤五(3)获得的所述卵囊藻液抽到专用沉淀浓缩装置，经48小时沉淀，排掉上层清液，收取下层浓缩藻液，然后加入无菌海水、硝酸钾10ppm，磷酸二氢钾1ppm、维生素B10.1ppm，维生素B120.01ppm；用分光光度计进行检测，密度控制在1300～1500万个细胞/ml，即得到高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液。
步骤七、分装：
将步骤六获得的高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液采用PPC塑料瓶分装，每瓶5000ml。还可以采用管装或桶装等其他形式进行分装。
本实施例中，无菌海水的制备方法为：将海水经陶氏超微过滤装置过滤后，加入强氯精20ppm，充气2h使药物充分溶解，然后停止充气，沉淀24h后，加入硫代硫酸钠7ppm中和剩余的氯，并用淀粉碘化钾液测定无菌海水中的氯含量，控制无菌海水中不残留有效氯成份。
实施例2：
一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、纯种卵囊藻的分离
由高产对虾养殖池中采集出卵囊藻样品，然后显微镜下分离并选取卵囊藻细胞；
步骤二、纯种卵囊藻的培育
(1)按以下配比，制备卵囊藻专用培养基：
所制备的卵囊藻专用培养基的比重为1.014，pH值为8.0。
(2)制备卵囊藻纯种液
将步骤一选取的卵囊藻细胞，接种至上述卵囊藻专用培养基中，并在温度为23℃、光照1800Lx的条件下连续充气培养纯化，12～18天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时，停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液1号25ml。
步骤三、高活性且抗逆性强的卵囊藻的选育
(1)取步骤二制备的卵囊藻纯种液1号25ml接种至装有5000ml卵囊藻专用培养基的三角烧瓶中，并在温度为23℃、光照1800Lx的条件下连续充气培育，6～9天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液2号250ml，卵囊藻浓度达到1400万个/ml；
(2)将步骤三(1)制备的卵囊藻纯种液2号250ml放于阴凉透气的环境中保藏，在静置中沉淀95～105天，然后排去上层清液，获得卵囊藻沉淀浓缩液；
(3)将步骤三(2)的经静置沉淀95～105天的卵囊藻纯种液2号接种到装有5000ml卵囊藻专用培养基的三角烧瓶中，并在温度为23℃、光照1800Lx的条件下连续充气培育，12～18天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液3号250ml，卵囊藻浓度为1400万个/ml；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)的步骤，并重复五次进行反复选育后，获得高活性且抗逆性强的卵囊藻1号。
步骤四、扩大培养
(1)一级扩大培养：
将步骤三(4)选育出的高活性且抗逆性强的卵囊藻种1号250ml，接种至装有一级扩大培养基的50000ml培藻罐中进行一级扩大培养，控制在温度为23℃、光照1800Lx的条件下连续充气培养，5～9天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，停止充气，沉淀后排去上层清液，获得一级扩大卵囊藻种2500ml：其中，一级扩大培养基由以下配比的组分制成：
一级扩大培养基的比重为1.010，pH值为8.0；
(2)二级扩大培养：
将一级扩大卵囊藻种2500ml接种至装有二级扩大培养基的500000ml培藻罐中进行二级扩大培养，控制在温度为23℃、光照1800Lx的条件下连续充气培养，5～9天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，获得二级扩大培养藻种500000ml，藻种浓度65-75万个/ml。其中，二级扩大培养基由以下配比的组分制成：
二级扩大培养基的比重为1.012，pH值为8.3。
步骤五、产业化培养
(1)卵囊藻产业化车间和生产线的准备：
每个车间面积1000平方米，设有供氧系统、温控系统、供水系统和光控系统，每个车间由两条生产线构成，每条生产线有150个PE塑料培藻罐，培藻罐有效容量为200×104ml；车间和生产线的培藻罐预先用100ppm的强氯精溶液彻底消毒，并用无菌海水清洗干净备用；
(2)向每个培藻罐中加入无菌海水200×104ml、硝酸钾：100g、磷酸二氢钾：10g、三氯化铁：5g、维生素B1：3g、维生素B12：0.2g、氨基酸培藻素：6g、植物细胞分裂素：1000国际单位、九二0植物生长激素1200国际单位，连续充氧2h；
(3)向每个培藻罐内接入所述二级扩大卵囊藻种25000ml，进行产业化培养，控制在温度为23℃、光照1800Lx的条件下连续充气培养，5～7天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，获得的卵囊藻液即可进行浓缩收集；
步骤六、收集和浓缩
将步骤五(3)获得的所述卵囊藻液抽到专用沉淀浓缩装置，经48小时沉淀，排掉上层清液，收取下层浓缩藻液，然后加入无菌海水、硝酸钾10ppm，磷酸二氢钾1ppm、维生素B10.1ppm，维生素B120.01ppm；用分光光度计进行检测，密度控制在1400万个细胞/ml，即得到高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液。
步骤七、分装：
将步骤六获得的高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液采用PPC塑料瓶分装，每瓶5000ml。还可以采用管装或桶装等其他形式进行分装。
本实施例中，无菌海水的制备方法为：将海水经陶氏超微过滤装置过滤后，加入强氯精15ppm，充气2h使药物充分溶解，然后停止充气，沉淀24h后，加入硫代硫酸钠5ppm中和剩余的氯，并用淀粉碘化钾液测定无菌海水中的氯含量，控制无菌海水中不残留有效氯成份。
实施例3：
一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、纯种卵囊藻的分离
由高产对虾养殖池中采集出卵囊藻样品，然后显微镜下分离并选取卵囊藻细胞；
步骤二、纯种卵囊藻的培育
(1)按以下配比，制备卵囊藻专用培养基：
所制备的卵囊藻专用培养基的比重为1.013，pH值为8.2。
(2)制备卵囊藻纯种液
将步骤一选取的卵囊藻细胞，接种至上述卵囊藻专用培养基中，并在温度为28℃、光照1900Lx的条件下连续充气培养纯化，12～18天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时，停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液1号25ml。
步骤三、高活性且抗逆性强的卵囊藻的选育
(1)取步骤二制备的卵囊藻纯种液1号25ml接种至装有5000ml卵囊藻专用培养基的三角烧瓶中，并在温度为28℃、光照1900Lx的条件下连续充气培育，6～9天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液2号250ml，卵囊藻浓度达到1300万个/ml；
(2)将步骤三(1)制备的卵囊藻纯种液2号250ml放于阴凉透气的环境中保藏，在静置中沉淀95～105天，然后排去上层清液，获得卵囊藻沉淀浓缩液；
(3)将步骤三(2)的经静置沉淀95～105天的卵囊藻纯种液2号接种到装有5000ml卵囊藻专用培养基的三角烧瓶中，并在温度为28℃、光照1900Lx的条件下连续充气培育，12～18天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液3号250ml，卵囊藻浓度为1300万个/ml；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)的步骤，并重复五次进行反复选育后，获得高活性且抗逆性强的卵囊藻1号。
步骤四、扩大培养
(1)一级扩大培养：
将步骤三(4)选育出的高活性且抗逆性强的卵囊藻种1号250ml，接种至装有一级扩大培养基的50000ml培藻罐中进行一级扩大培养，控制在温度为28℃、光照1900Lx的条件下连续充气培养，5～9天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，停止充气，沉淀后排去上层清液，获得一级扩大卵囊藻种2500ml：其中，一级扩大培养基由以下配比的组分制成：
一级扩大培养基的比重为1.014，pH值为8.2；
(2)二级扩大培养：
将所述一级扩大卵囊藻种2500ml接种至装有二级扩大培养基的500000ml培藻罐中进行二级扩大培养，控制在温度为28℃、光照1900Lx的条件下连续充气培养，5～9天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，获得二级扩大培养藻种500000ml，藻种浓度65-75万个/ml。其中，二级扩大培养基由以下配比的组分制成：
二级扩大培养基的比重为1.016，pH值为8.1。
步骤五、产业化培养
(1)卵囊藻产业化车间和生产线的准备：
每个车间面积1000平方米，设有供氧系统、温控系统、供水系统和光控系统，每个车间由两条生产线构成，每条生产线有150个PE塑料培藻罐，培藻罐有效容量为200×104ml；车间和生产线的培藻罐预先用100ppm的强氯精溶液彻底消毒，并用无菌海水清洗干净备用；
(2)向每个培藻罐中加入无菌海水200×104ml、硝酸钾：100g、磷酸二氢钾：10g、三氯化铁：5g、维生素B1：3g、维生素B12：0.2g、氨基酸培藻素：6g、植物细胞分裂素：1000国际单位、九二0植物生长激素1200国际单位，连续充氧2h；
(3)向每个培藻罐内接入所述二级扩大卵囊藻种25000ml，进行产业化培养，控制在温度为28℃、光照1900Lx的条件下连续充气培养，5～7天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，获得的卵囊藻液即可进行浓缩收集；
步骤六、收集和浓缩
将步骤五(3)获得的所述卵囊藻液抽到专用沉淀浓缩装置，经48小时沉淀，排掉上层清液，收取下层浓缩藻液，然后加入无菌海水、硝酸钾10ppm，磷酸二氢钾1ppm、维生素B10.1ppm，维生素B120.01ppm；用分光光度计进行检测，密度控制在1300万个细胞/ml，即得到高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液。
步骤七、分装：
将步骤六获得的高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液采用PPC塑料瓶分装，每瓶5000ml。还可以采用管装或桶装等其他形式进行分装。
本实施例中，无菌海水的制备方法为：将海水经陶氏超微过滤装置过滤后，加入强氯精25ppm，充气2h使药物充分溶解，然后停止充气，沉淀24h后，加入硫代硫酸钠10ppm中和剩余的氯，并用淀粉碘化钾液测定无菌海水中的氯含量，控制无菌海水中不残留有效氯成份。
实施例4：
一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、纯种卵囊藻的分离
由高产对虾养殖池中采集出卵囊藻样品，然后显微镜下分离并选取卵囊藻细胞。
步骤二、纯种卵囊藻的培育
(1)按以下配比，制备卵囊藻专用培养基：
所制备的卵囊藻专用培养基的比重为1.010，pH值为8.4。
(2)制备卵囊藻纯种液
将步骤一选取的卵囊藻细胞，接种至上述卵囊藻专用培养基中，并在温度为26℃、光照2000Lx的条件下连续充气培养纯化，12～18天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时，停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液1号25ml。
步骤三、高活性且抗逆性强的卵囊藻的选育
(1)取步骤二制备的卵囊藻纯种液1号25ml接种至装有5000ml卵囊藻专用培养基的三角烧瓶中，并在温度为26℃、光照2000Lx的条件下连续充气培育，6～9天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液2号250ml，卵囊藻浓度达到1500万个/ml；
(2)将步骤三(1)制备的卵囊藻纯种液2号250ml放于阴凉透气的环境中保藏，在静置中沉淀95～105天，然后排去上层清液，获得卵囊藻沉淀浓缩液；
(3)将步骤三(2)的经静置沉淀95～105天的卵囊藻纯种液2号接种到装有5000ml卵囊藻专用培养基的三角烧瓶中，并在温度为26℃、光照2000Lx的条件下连续充气培育，12～18天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液3号250ml，卵囊藻浓度为1500万个/ml；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)的步骤，并重复五次进行反复选育后，获得高活性且抗逆性强的卵囊藻1号。
步骤四、扩大培养
(1)一级扩大培养：
将步骤三(4)选育出的高活性且抗逆性强的卵囊藻种1号250ml，接种至装有一级扩大培养基的50000ml培藻罐中进行一级扩大培养，控制在温度为26℃、光照2000Lx的条件下连续充气培养，5～9天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，停止充气，沉淀后排去上层清液，获得一级扩大卵囊藻种2500ml。其中，一级扩大培养基由以下配比的组分制成：
一级扩大培养基的比重为1.016，pH值为8.4；
(2)二级扩大培养：
将一级扩大卵囊藻种2500ml接种至装有二级扩大培养基的500000ml培藻罐中进行二级扩大培养，控制在温度为26℃、光照2000Lx的条件下连续充气培养，5～9天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，获得二级扩大培养藻种500000ml，藻种浓度65-75万个/ml。其中，二级扩大培养基由以下配比的组分制成：
二级扩大培养基的比重为1.012，pH值为8.0。
步骤五、产业化培养
(1)卵囊藻产业化车间和生产线的准备：
每个车间面积1000平方米，设有供氧系统、温控系统、供水系统和光控系统，每个车间由两条生产线构成，每条生产线有150个PE塑料培藻罐，培藻罐有效容量为200×104ml；车间和生产线的培藻罐预先用100ppm的强氯精溶液彻底消毒，并用无菌海水清洗干净备用；
(2)向每个培藻罐中加入无菌海水200×104ml、硝酸钾：100g、磷酸二氢钾：10g、三氯化铁：5g、维生素B1：3g、维生素B12：0.2g、氨基酸培藻素：6g、植物细胞分裂素：1000国际单位、九二0植物生长激素1200国际单位，连续充氧2h；
(3)向每个培藻罐内接入所述二级扩大卵囊藻种25000ml，进行产业化培养，控制在温度为26℃、光照2000Lx的条件下连续充气培养，5～7天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，获得的卵囊藻液即可进行浓缩收集；
步骤六、收集和浓缩
将步骤五(3)获得的所述卵囊藻液抽到专用沉淀浓缩装置，经48小时沉淀，排掉上层清液，收取下层浓缩藻液，然后加入无菌海水、硝酸钾10ppm，磷酸二氢钾1ppm、维生素B10.1ppm，维生素B120.01ppm；用分光光度计进行检测，密度控制在1500万个细胞/ml，即得到高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液。
步骤七、分装：
将步骤六获得的高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液采用PPC塑料瓶分装，每瓶5000ml。还可以采用管装或桶装等其他形式进行分装。
本实施例中，无菌海水的制备方法为：将海水经陶氏超微过滤装置过滤后，加入强氯精22ppm，充气2h使药物充分溶解，然后停止充气，沉淀24h后，加入硫代硫酸钠9ppm中和剩余的氯，并用淀粉碘化钾液测定无菌海水中的氯含量，控制无菌海水中不残留有效氯成份。
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、纯种卵囊藻的分离
由高产对虾养殖池中采集出卵囊藻样品，然后显微镜下分离并选取卵囊藻细胞；
步骤二、纯种卵囊藻的培育
将步骤一选取的卵囊藻细胞，接种至卵囊藻专用培养基中，在温度为23～28℃、光照1800～2000Lx的条件下连续充气培养纯化，12～18天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液1号25ml；
步骤三、高活性且抗逆性强的卵囊藻的选育
(1)取步骤二制备的卵囊藻纯种液1号25ml，接种到装有5000ml卵囊藻专用培养基的三角烧瓶中，并在温度为23～28℃、光照1800～2000Lx的条件下连续充气培育，6～9天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液2号250ml，卵囊藻浓度达到1300～1500万个/ml；
(2)将步骤三(1)制备的卵囊藻纯种液2号250ml放于阴凉透气的环境中保藏，在静置中沉淀95～105天；
(3)将步骤三(2)的经静置沉淀95～105天的卵囊藻纯种液2号接种到装有5000ml卵囊藻专用培养基的三角烧瓶中，并在温度为23～28℃、光照1800～2000Lx的条件下连续充气培育，12～18天后卵囊藻浓度达到65-75万个/ml时停止充气，沉淀后排去上层清液，获得卵囊藻纯种液3号250ml，卵囊藻浓度为1300～1500万个/ml；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)的步骤，至少重复三次以上进行反复选育后，获得高活性且抗逆性强的卵囊藻藻种1号；
步骤四、扩大培养
(1)一级扩大培养：
将步骤三(4)选育出的高活性且抗逆性强的卵囊藻种1号250ml，接种至装有一级扩大培养基的50000ml培藻罐中进行一级扩大培养，控制在温度为23～28℃、光照1800～2000Lx的条件下连续充气培养，5～9天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，停止充气，沉淀后排去上层清液，获得一级扩大卵囊藻种2500ml，藻种浓度1300-1500万个/ml；
(2)二级扩大培养：
将所述一级扩大卵囊藻种2500ml接种至装有二级扩大培养基的500000ml培藻罐中进行二级扩大培养，控制在温度为23～28℃、光照1800～2000Lx的条件下连续充气培养，5～9天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，获得二级扩大培养藻种500000ml，藻种浓度65-75万个/ml。
步骤五、产业化培养
(1)卵囊藻产业化车间和生产线的准备：
每个车间设有供氧系统、温控系统、供水系统和光控系统，每个车间设置有至少一条卵囊藻生产线，每条生产线设置多个有效容量为200×104ml的培藻罐，培藻罐预先用100ppm的强氯精溶液彻底消毒，并用无菌海水清洗干净备用；
(2)向每个培藻罐中加入无菌海水200×104ml、硝酸钾：100g、磷酸二氢钾：10g、三氯化铁：5g、维生素B1：3g、维生素B12：0.2g、氨基酸培藻素：6g、植物细胞分裂素：1000国际单位、九二0植物生长激素1200国际单位，连续充氧2h；
(3)向每个培藻罐内接入所述二级扩大卵囊藻种25000ml，进行产业化培养，控制在温度为23～28℃、光照1800～2000Lx的条件下连续充气培养，5～7天后卵囊藻浓度达65-75万个/ml，获得的卵囊藻液即可进行浓缩收集；
步骤六、收集和浓缩
将步骤五(3)获得的所述卵囊藻液抽到专用沉淀浓缩装置，经48小时沉淀，排掉上层清液，收取下层浓缩藻液，然后加入无菌海水、硝酸钾10ppm，磷酸二氢钾1ppm、维生素B10.1ppm，维生素B120.01ppm；用分光光度计进行检测，密度控制在1300～1500万个细胞/ml，即得到高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液。
2.根据权利要求1所述的一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液的制备方法，其特征在于：步骤三中的步骤(1)中，所述卵囊藻专用培养基由以下配比的组分制成：
所述卵囊藻专用培养基的比重为1.010～1.016，pH值为8.0～8.4。
3.根据权利要求2所述的一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液的制备方法，其特征在于：所述卵囊藻专用培养基由以下配比的组分制成：
4.根据权利要求1所述的一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液的制备方法，其特征在于：步骤四中的步骤(1)中，所述一级扩大培养基由以下配比的组分制成：
所述一级扩大培养基的比重为1.010～1.016，pH值为8.0～8.4。
5.根据权利要求1所述的一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液的制备方法，其特征在于：步骤四中的步骤(2)中，所述二级扩大培养基由以下配比的组分制成：
所述二级扩大培养基的比重为1.010～1.016，pH值为8.0～8.4。
6.根据权利要求1至5任意一项所述的一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液的制备方法，其特征在于：所述无菌海水的制备方法为：将海水经陶氏超微过滤装置过滤后，加入强氯精15～25ppm，充气2h使药物充分溶解，然后停止充气，沉淀24h后，加入硫代硫酸钠5～10ppm中和剩余的氯，并用淀粉碘化钾液测定无菌海水中的氯含量，控制无菌海水中不残留有效氯成份。
7.根据权利要求1所述的一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液的制备方法，其特征在于：还包括步骤七、分装：将步骤六获得的高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液进行分装保存，分装为瓶装、管装或桶装。
8.一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液，其特征在于：所述卵囊藻浓缩液是采用权利要求1至7任意一项所述的制备方法制备而成的，所述高活性卵囊藻浓缩液中的卵囊藻浓度为1300～1500万个/ml。
9.权利要求8所述的一种高活性且抗逆性强的卵囊藻浓缩液用于制备海水或半咸水海产品养殖池塘的藻相稳定剂的新用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述海水或半咸水海产品包括鱼类、对虾类、蟹类和贝类。
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