CN110628632A - 一种小球藻藻种常温保存的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种小球藻藻种常温保存的方法，属于藻类培养领域。所述方法为向生长状态良好的小球藻藻种液中添加以下成分至质量终浓度：氮源0.8‑1.0g/L、磷酸二氢钾0.4‑0.6g/L、碳酸氢钠0.25‑0.30g/L、乙二胺四乙酸二钠0.05g/L、硫酸镁0.07g/L，充分搅拌溶解后；再加入甘油的质量终浓度为0.05％‑0.10％和山梨酸钾或苯甲酸钠的质量终浓度为0.006％‑0.010％；调节pH终点为6.9‑7.1。本发明制备方法简单、易于操作，且制备的藻种液常温、弱光放置保存3个月后藻种的存活率可达90％以上。

Description

一种小球藻藻种常温保存的方法
技术领域
本发明属于藻类培养领域，具体的涉及一种小球藻藻种常温保存的方法。
背景技术
小球藻是绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，直径3-8微米，形状呈圆球形，分布极广，可以生息在淡海水中，其中以淡水水域种类最多，生物量大。适宜温度20-23℃、适宜盐度20-30‰、适宜光照5000-10000Lx、适宜水质pH＝6-8。小球藻以光合自养生长繁殖，可以借助阳光、水和二氧化碳，以每隔20小时分裂4个细胞的旺盛繁殖能力，不停地将太阳能量转化生成蕴涵多种营养成分的藻体，并在增值中释放出大量的氧气。其细胞内含有丰富的叶绿素，光合作用非常强，是其他植物的几十倍，繁殖能力比陆地上的高等植物强100倍以上。
目前小球藻在水产养殖的应用日益重要，小球藻能够降解水中氨氮、亚硝酸盐等有毒有害物质，对水质起到调节作用；能够通过在水体中繁殖，改变养殖水色与透明度；能够通过生物竞争机制有效的控制蓝藻和青苔的生长；并且其含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质、食物纤维、核酸及叶绿素等，已被利用作为鱼虾蟹良好的开口饵料。小球藻在水产养殖中的应用已经得到肯定，能够减少养殖成本，提高产量，增加养殖户的经济收入。
小球藻藻种的保存技术一直是制约生产和藻种商品化供应的重要因素。小球藻是一个活体的藻细胞，保存条件要求严苛。采用液体自然状态保存时，藻种密度高而容易造成藻种沉底，营养盐消耗也快，易出现发臭死藻现象，保存时间短，藻种浓度为100万/mL以上时，一般自然状态下仅能保存3-10天。长期保存需要低温保存，但是过低的温度又会出现结冰，藻种细胞壁会破壁，膨胀后就会坏死，并且低温保存耗时耗力，不利于商品运输。用固体培养基进行长期保存时会造成固体培养基表面干燥，需要1-2个月定期移种，并且传代操作工作繁杂，工作量大，易造成污染和杂菌生长。
根据上述分析，目前生产中常用液体保存藻种，但这种方法保存时间短，不利于小球藻商品化的流通。在低温下仅能保存3个月，藻种发白、易沉底、易污染、操作繁琐、工作量大等缺陷，容易造成保种失败。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种小球藻藻种常温保存的方法，本发明提供了一种适应商品化流通销售需要的中长期保存小球藻藻种的方法，该方法具有操作简单便捷、保存效果好、保存时间较长，并且能够在常温下保存，避免低温耗能与运输不便。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案可以通过以下具体步骤得到进一步实现：
一种小球藻藻种常温保存的方法，具体步骤具体如下：
(1)小球藻藻种通过镜检生长状态良好，藻种浓度为200万/mL-500万/mL，该小球藻种液中无车轮虫、草履虫等原生动物，其他藻类所占藻种比例小于1％；
(2)向(1)小球藻藻种液中添加以下终浓度的成分：氮源0.8-1.0g/L、磷酸二氢钾0.4-0.6g/L、碳酸氢钠0.25-0.30g/L、乙二胺四乙酸二钠0.05g/L、硫酸镁0.07g/L，每添加一种成分充分搅拌溶解后，再添加下一种成分；
(3)向(2)中加入质量终浓度为0.05％-0.10％的甘油和质量终浓度为0.006％-0.010％的山梨酸钾或苯甲酸钠；
(4)调节(3)中的pH终点为6.9-7.1。
进一步，步骤(2)中的氮源可选尿素、硝酸铵其中一种或两种同时复配；步骤(4)中用柠檬酸或乳酸的一种或两者复配调节pH。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明通过添加氮源、磷酸二氢钾、碳酸氢钠来满足小球藻碳、氮、磷的基本营养需求。组分中的乙二胺四乙酸二钠能够起到螯合稳定作用，添加的镁离子是构成叶绿素与某些辅酶的主要元素，甘油和山梨酸钾或苯甲酸钠能够起到保鲜和抑菌作用。pH是影响小球藻生长的重要因素和影响藻种液中碳酸氢根离子在总溶解状态的二氧化碳所占比例的主要因素。同时通过弱光抑制光合作用，降低藻种的代谢活动，防止其在保存期间进行旺盛的光合作用而快速消耗营养盐，从而来延长藻种保存时间。
本发明通过添加营养盐、保鲜剂和调节pH来提高保存的藻种存活率，常温、弱光保存3个月后藻种的存活率仍可达90％以上，小球藻商品化的保质时间比现有的液体保存方法时间延长了10倍以上。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1
步骤一：取小球藻藻种液1L，镜检合格，小球藻藻细胞数量为393万/mL该小球藻种液中无车轮虫、草履虫等原生动物，其他藻类所占藻种比例小于1％；
步骤二：向小球藻藻种中添加各营养盐成分：0.8g尿素、0.6g磷酸二氢钾、0.25g碳酸氢钠、0.05g乙二胺四乙酸二钠、0.07g硫酸镁，每添加一种成分充分搅拌溶解后，再添加下一种成分；
步骤三：向含有营养盐的藻种中添加0.06g山梨酸钾和0.5g甘油；
步骤四：用乳酸调节步骤三中的pH终点为7.0；
步骤五：常温、稍微避光条件下放置三个月后测定小球藻藻种藻细胞数量为362万/mL，与步骤一中的藻细胞数量对比，计算存活率为92％。
实施例2
步骤一：取小球藻藻种液1L,镜检合格，小球藻藻细胞数量为345万/mL，该小球藻种液中无车轮虫、草履虫等原生动物，其他藻类所占藻种比例小于1％；
步骤二：向小球藻藻种中添加各营养盐成分：0.9g尿素、0.4g磷酸二氢钾、0.25g碳酸氢钠、0.05g乙二胺四乙酸二钠、0.07g硫酸镁，每添加一种成分充分搅拌溶解后，再添加下一种成分；
步骤三：向含有营养盐的藻种中添加0.10g山梨酸钾和0.5g甘油；
步骤四：用柠檬酸调节步骤三中的pH终点为7.0；
步骤五：常温、稍微避光条件下放置三个月后测定小球藻藻种藻细胞数量为311万/mL，与步骤一中的藻细胞数量对比，计算存活率90％。
实施例3
步骤一：取小球藻藻种液1L,镜检合格，小球藻藻细胞数量为345万/mL，该小球藻种液中无车轮虫、草履虫等原生动物，其他藻类所占藻种比例小于1％；
步骤二：向小球藻藻种中添加各营养盐成分：1.0g硝酸铵、0.4g磷酸二氢钾、0.30g碳酸氢钠、0.05g乙二胺四乙酸二钠、0.07g硫酸镁，每添加一种成分充分搅拌溶解后，再添加下一种成分；
步骤三：向含有营养盐的藻种中添加0.08g苯甲酸钠和0.5g甘油；
步骤四：用柠檬酸调节步骤三中的pH终点为7.0；
步骤五：常温、稍微避光条件下放置三个月后测定小球藻藻种藻细胞数量为315万/mL，与步骤一中的藻细胞数量对比，计算存活率91％。
实施例4
步骤一：取小球藻藻种液1L,镜检合格，小球藻藻细胞数量为275万/mL，该小球藻种液中无车轮虫、草履虫等原生动物，其他藻类所占藻种比例小于1％；
步骤二：向小球藻藻种中添加各营养盐成分：0.9g尿素、0.6g磷酸二氢钾、0.25g碳酸氢钠、0.05g乙二胺四乙酸二钠、0.07g硫酸镁，每添加一种成分充分搅拌溶解后，再添加下一种成分；
步骤三：向含有营养盐的藻种中添加0.1g山梨酸钾和0.5g甘油；
步骤四：用柠檬酸调节步骤三中的pH终点为7.0；
步骤五：常温、稍微避光条件下放置三个月后测定小球藻藻种藻细胞数量为267万/mL，与步骤一中的藻细胞数量对比，计算存活率97％。
实施例5
取小球藻藻种液1L，镜检合格，小球藻藻细胞数量为288万/mL，该小球藻种液中无车轮虫、草履虫等原生动物，其他藻类所占藻种比例小于1％；没有添加任何东西，常温、稍微避光条件下放置三个月后测定小球藻藻种藻细胞数量为0，计算存活率为0。
实施例6
步骤一：取小球藻藻种液1L,镜检合格，小球藻藻细胞数量为275万/mL，该小球藻种液中无车轮虫、草履虫等原生动物，其他藻类所占藻种比例小于1％；
步骤二：向小球藻藻种中添加各营养盐成分：0.9g尿素、0.6g磷酸二氢钾、0.25g碳酸氢钠、0.05g乙二胺四乙酸二钠、0.07g硫酸镁，每添加一种成分充分搅拌溶解后，再添加下一种成分；
步骤三：没有添加甘油、山梨酸钾或苯甲酸钠和调节pH，常温、稍微避光条件下放置三个月后测定小球藻藻种藻细胞数量为122万/mL，与步骤一中的藻细胞数量对比，计算存活率44％。

Claims (4)

1.一种小球藻藻种常温保存的方法，其特征在于所述方法的具体步骤具体如下：
(1)小球藻藻种通过镜检生长状态良好，藻种浓度为200万/mL-500万/mL，该小球藻种液中无车轮虫、草履虫等原生动物，其他藻类所占藻种比例小于1％；
(2)向步骤(1)小球藻藻种液中添加以下终浓度的成分：氮源0.8-1.0g/L、磷酸二氢钾0.4-0.6g/L、碳酸氢钠0.25-0.30g/L、乙二胺四乙酸二钠0.05g/L、硫酸镁0.07g/L，每添加一种成分充分搅拌溶解后，再添加下一种成分；
(3)向步骤(2)中加入质量终浓度为0.05％-0.10％的甘油和质量终浓度为0.006％-0.010％的山梨酸钾或苯甲酸钠；
(4)调节步骤(3)中的pH终点为6.9-7.1。
2.根据权利要求1所述的一种小球藻藻种常温保存的方法，所述氮源为尿素、硝酸铵其中一种或两种同时复配。
3.根据权利要求1所述的一种小球藻藻种常温保存的方法，所述步骤(4)中所用pH调节剂为弱酸。
4.根据权利要求1所述的一种小球藻藻种常温保存的方法，所述步骤(4)中所用pH调节剂为柠檬酸、乳酸中的一种或两者复配。
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