CN112725186A - 一种水产养殖用耐高温小球藻选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水产养殖领域，公开了一种水产养殖用耐高温小球藻选育方法。本发明通过不断对藻种的高温适应性筛选，筛选出可适用于高温环境的耐高温藻种，同时在筛选过程使用自行研制的细胞保护液以及优化的选育培养基，对微藻细胞进行高温保护和促进增殖，能有效保护微藻细胞壁的在高温下的完整性，保护叶绿体的稳定性，提高选育的成功率，经过筛选后的小球藻，可最高适应45℃的高温，为处于中国南方的小球藻生产提供一定技术支持。

Description

一种水产养殖用耐高温小球藻选育方法

技术领域

本发明涉及水产养殖领域，具体的说是涉及一种水产养殖用耐高温小球藻选育方法。

背景技术

小球藻是一类广泛分布于海洋、陆地，古老且健康的单细胞植物，富含蛋白质、氨基酸、脂肪酸、维生素等活性物质，使其在医药工业、食品工业、生物饵料等领域均具有广阔的开发前景。在医药工业方面，可以通过添加微藻制成降血脂药品、降血压药品、抗肿瘤药品等内服药，还可制成治疗烧伤烫伤、运动损伤等外用药。在生物饵料方面，微藻本身为纯天然绿色生物性饵料，鱼虾易吸收消化。用微藻生物饵料取代传统饵料，并通过科学养殖，养殖过程中病虫害会有效减少，鱼虾的存活率升高，用药成本降低，养殖户的经济效益可以得到显著提升。在水产养殖行业，小球藻养殖多是小规模的尝试，生产效率远远不能满足育苗需求，且多采用藻池或天然水体进行粗放培养，对天气环境依赖强，常导致供应不及时，与育苗进度脱节，在生产技术和应用方法上也没有既定标准，造成微藻浓度低、饵料效价低等，研发难度大，生产工艺门槛高。

在微藻养殖过程中，小球藻的最适生长温度范围在15-25℃。但在于南方如海南、广东、福建等地，夏天温度持续处于高温，水温最高可达到45℃。这不利于小球藻的高密度，工厂化养殖。如采取空调降温的方式又大大浪费能源，提高生产成本。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水产养殖用耐高温小球藻选育方法，使得所述方法能够显著提高选育出耐高温小球藻的藻体密度，为选育耐高温小球藻提供基础条件，提高选育成功率；

本发明的另外一个目的在于提供一种基于上述水产养殖用耐高温小球藻选育方法的选育培养基。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种水产养殖用耐高温小球藻选育方法，包括：

步骤1、微藻水样通过平板培养基划线，分离出小球藻单藻落；步骤2、将小球藻单藻落在显微镜下进行镜检，确定纯度达到80％以上(计数法计算)，如未达到，则重复步骤1；

步骤3、将小球藻单藻落接种至加入了细胞保护液的基础培养基中，在25-30℃的光照培养箱中进行培养；待藻密度达到100-600万个/ml，放入50-60℃恒温水浴锅中加热10-15分钟，之后将藻液均匀涂布在平板培养基上进行培养，培养温度30-35℃；

步骤4、步骤3中平板培养基上形成单藻落后，挑选长势最快的单藻落，接种至加入了细胞保护液的基础培养基中，在32-35℃的光照培养箱中进行培养；藻密度达到100-600万个/ml，放入60-70℃恒温水浴锅中加热10-15分钟，之后将藻液均匀涂布在平板培养基上进行培养，培养温度35-45℃；

步骤5、步骤4中平板培养基上形成单藻落后，挑选长势最快的单藻落，接种至加入了细胞保护液的基础培养基中，在40-50℃的光照培养箱中进行培养；将生长最快的单藻落，放置在40-50℃光培摇床中进行扩培；

步骤6、将扩培好的藻种在40-50℃光照培养箱中进行高温生长验证，获得能够耐高温的小球藻藻种；

其中，基础培养基和平板培养基成分相同，包括琼脂、氯化钠、含微生素母液的营养母液，以及微量元素母液；所述维生素母液包括维生素B1、生物素和维生素B12，所述营养母液包括硝酸钠、磷酸二氢钾或其水合物、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、氯化铵、酵母抽提物和植物蛋白胨，所述微量元素母液包括乙二胺四乙酸二钠、氯化铁或其水合物、硫酸铜或其水合物、硫酸锌或其水合物、氯化钴或其水合物、氯化锰或其水合物，以及钼酸钠或其水合物；

所述细胞保护液包括特丁基对苯二酚、亚硝酸钠、生物素和吐温。

针对南方沿海等地小球藻不适于在夏季高温环境下进行快速增长的问题，本发明针对性的选育出用于南方等地高温天气生产的耐高温水产养殖用小球藻，为当地水产养殖环境提供有效的微生态治理服务。

作为优选，每升营养母液包括75g硝酸钠、5g二水合磷酸二氢钾或相同摩尔数的磷酸二氢钾、4g磷酸氢二钾、1g碳酸氢钠、1g氯化铵、2g酵母抽提物和1g植物蛋白胨。

作为优选，每100mL维生素母液包括10mg维生素B1、0.05mg生物素和0.05mg维生素B12。

作为优选，每升微量元素母液包括4.36g乙二胺四乙酸二钠、3.15g六水合氯化铁或相同摩尔数的氯化铁、9.8g五水合硫酸铜或相同摩尔数的硫酸铜、22g七水合硫酸锌或相同摩尔数的硫酸锌、10g六水合氯化钴或相同摩尔数的氯化钴、18g氯化锰或相同摩尔数的氯化锰，以及6.3g钼酸钠或相同摩尔数的钼酸钠。在本发明具体实施方式中，每1L营养母液含1mL维生素母液。

作为优选，每1L基础培养基或平板培养基包括17g琼脂、25g氯化钠、1mL含微生素母液的营养母液和1mL微量元素母液。

作为优选，每1L细胞保护液包括5g特丁基对苯二酚、2g亚硝酸钠、1g生物素和1g吐温。在本发明具体实施方式中，每1L基础培养基中添加5mL细胞保护液。

作为优选，所述光照培养箱中的光照强度为3000-8000lux，高温验证过程中的光照强度为8000-20000lux，光培摇床中的摇床转速为80-150rpm。

本发明所选用的培养基与常规微藻培养基相比，其优势在于：添加酵母抽提物及植物蛋白胨来提供活性因子，促进微藻细胞生长与分裂，同时酵母抽提物与植物蛋白胨还能为微藻提供适量有机碳源及氮源，促进增殖。加入碳酸氢钠及氯化铵等无机氮源来补充氮吸收，加入磷酸二氢钾、磷酸氢二钾来提供磷酸盐pH缓存体系。两者对比实验显示，本发明所用的培养基，对于微藻的增长更有效果，更能促进微藻细胞的增长分离，其细胞密度相对常规培养基有显著提高。

同时本发明所添加的细胞保护液，能有效保护细胞壁的完整性，增加细胞壁的通透性，提高细胞壁转运酶活力，减少温度对于细胞的破坏，提升细胞的适应能力，经添加混合细胞保护液后，其最终的藻种密度可达1400万/毫升以上。

因此，本发明基于上述选育方法还提供了一种水产养殖用耐高温小球藻选育培养基，包括选育培养基和细胞保护液，所述选育培养基包括琼脂、氯化钠、含微生素母液的营养母液，以及微量元素母液；其中，所述维生素母液包括维生素B1、生物素和维生素B12，所述营养母液包括硝酸钠、磷酸二氢钾或其水合物、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、氯化铵、酵母抽提物和植物蛋白胨，所述微量元素母液包括乙二胺四乙酸二钠、氯化铁或其水合物、硫酸铜或其水合物、硫酸锌或其水合物、氯化钴或其水合物、氯化锰或其水合物，以及钼酸钠或其水合物；

所述细胞保护液包括特丁基对苯二酚、亚硝酸钠、生物素和吐温。

此外，本发明还提供了选育培养基在选育水产养殖用耐高温小球藻中的应用。

由以上技术方案可知，本发明通过不断对藻种的高温适应性筛选，筛选出可适用于高温环境的耐高温藻种，同时在筛选过程使用自行研制的细胞保护液以及优化的选育培养基，对微藻细胞进行高温保护和促进增殖，能有效保护微藻细胞壁的在高温下的完整性，保护叶绿体的稳定性，提高选育的成功率，经过筛选后的小球藻，可最高适应45℃的高温，为处于中国南方的小球藻生产提供一定技术支持。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种水产养殖用耐高温小球藻选育方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述选育方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的选育方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下就本发明所提供的一种水产养殖用耐高温小球藻选育方法做进一步说明。

实施例1：选育耐高温小球藻

1、从户外养殖水体中，采集微藻藻液，通过平板划线及涂布法，分离出较纯的小球藻单藻落(纯度80％以上，计数法计算)。

平板培养基配置如下：

(1)营养液母液配方(1L)

表1

物料名称	分子式	级别	称量量(g)
				硝酸钠	NaNO<sub>3</sub>	AR	75
二水合磷酸二氢钾	NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	AR	5
				无水磷酸氢二钾	K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	AR	4
碳酸氢钠	NaHCO<sub>3</sub>	AR	1
				氯化铵	NH<sub>4</sub>Cl	AR	1
酵母抽提物		BR	2
				植物蛋白胨		BR	1

维生素母液配方(100mL)：

表2

物料名称	分子式	级别	称量量(mg)
				维生素B12	Vitamin B12	AR	0.05
生物素	Biotin	AR	0.05
				维生素B1	Vitamin B1	AR	10

营养液母液121℃高温灭菌20min，温度冷却后，加入1mL维生素母液(母液预先0.22膜过滤除菌)。

(2)微量元素溶液母液配方(1L)

表3

将17g琼脂溶入1L纯化水中，加入25gNaCl，加热溶解后放入灭菌锅中121℃，灭菌30min。灭菌完成后趁热在超净工作台上用移液器吸取1mL营养液母液(含维生素母液)，1mL微量元素溶液，加入琼脂液中，摇匀，封口，待冷却。(营养液母液及微量元素溶液均需要提前灭菌，121℃，30min)；

(3)细胞保护液母液配方(1L)

表4

物料名称	分子式	级别	称量量(g)
				特丁基对苯二酚	C<sub>10</sub>H<sub>14</sub>O<sub>2</sub>	AR	5
亚硝酸钠	NaNO<sub>2</sub>	AR	2
				生物素	C<sub>10</sub>H<sub>16</sub>N<sub>2</sub>O<sub>3</sub>S	AR	1
吐温80	C<sub>24</sub>H<sub>44</sub>O<sub>6</sub>(C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O)<sub>n</sub>	AR	1

细胞保护液配置：将以上物料，用1L超纯水溶解后，在超净台内用0.22um过滤器过滤除菌，装至已灭菌蓝盖瓶中，冷藏保存。

2、将平板中的单藻落，挑选至试管培养基中进行培养，每个单藻落挑选入一个试管中，试管培养所需基础培养基与平板培养所需培养基一致，同时在每升试管培养基中加入5毫升细胞保护液母液。将挑选好的试管放置在光照培养箱中进行培养。试管培养温度；25-30℃，光照强度3000-8000lux，培养5-10天；

3、待藻密度达到100万个/ml，将试管放入恒温水浴锅中加热10分钟，水温50-60℃。之后将试管中的藻液均匀涂布在已灭菌平板上进行培养，培养温度30-35℃，光照强度3000-8000lux；

4、待平板中形成单藻落后，挑选长势最快的15组单藻落，筛选入已灭菌试管培养基(每升试管培养基中加入5毫升细胞保护液母液)中进行培养，培养温度32-35℃，光照强度3000-8000lux；

5、待试管中藻密度达到100万个/ml，放入恒温水浴锅中加热10分钟，水温60-70℃.之后将试管中的藻液均匀涂布在已灭菌平板上进行培养，培养温度35-45℃，光照强度3000-8000lux；

6、待平板中形成单藻落后，挑选长势最快的15组单藻落，筛选入已灭菌试管培养基中(每升试管培养基中加入5毫升细胞保护液母液)进行培养，培养温度40-50℃，光照强度3000-8000lux；

7、试管培养过程，持续监测藻密度，将生长最快的5组试管转入三角瓶中，放置在光培摇床中进行扩培，并进行后续保种使用。光培摇床参数设定：转速80-150rpm,培养温度40-50℃，光照强度3000-8000lux；

8、将扩培好的藻种转接如光生物反应器中进行高温生长验证。光照强度8000-20000lux，培养温度40-50℃。

9、经过5天培养，藻种密度由初始80万个/ml，增长至5000万个/ml，藻体密度提升62.5倍，确定经筛选的藻种已适应高温生长环境。

实施例2：选育方法的对比

本发明培养基：实施例1中培养基；

常规微藻培养基：BG11(硝酸钠1.5g，磷酸氢二钾0.04g，七水硫酸镁0.075g，七水氯化钙0.036g，碳酸钠0.02g，柠檬酸0.006g，柠檬酸铁铵0.006g，EDTA0.001g，无菌水1L。)

在实施例1方法基础上采用不同培养基以及是否添加细胞保护液进行对比；

本发明选育方法：实施例1方法；

对比选育方法：在实施例1方法基础上用常规微藻培养基替换本发明培养基以及不添加细胞保护液在光照强度10000lux，培养温度45℃条件下培养进行选育；

每种方法采用相同水体中的微藻样本，最终统计藻体密度(万/毫升)，具体结果见表5。

表5

由以上结果可以看出，本发明所用的培养基，对于微藻的增长更有效果，更能促进微藻细胞在高温条件下的增长分离，其细胞密度相对常规培养基提高极为明显，这能够为小球藻的后续选育提供基础。

此外，添加细胞保护液，能有效保护细胞壁的完整性，增加细胞壁的通透性，提高细胞壁转运酶活力，减少温度对于细胞的破坏，提升细胞的适应能力，经添加细胞保护液后的培养基，最终的藻种密度可达1400万/毫升以上，而其他对照方法的最终藻密度显著低于本发明，特别是不添加细胞保护液的常规培养基选育方法，其藻体密度极低，这在实际的选育过程中会极其影响选育的成功率。

以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。

Claims (10)

1.一种水产养殖用耐高温小球藻选育方法，其特征在于，包括：

步骤1、微藻水样通过平板培养基划线，分离出小球藻单藻落；

步骤2、将小球藻单藻落在显微镜下进行镜检，确定纯度达到80％以上，如未达到，则重复步骤1；

步骤3、将小球藻单藻落接种至加入了细胞保护液的基础培养基中，在25-30℃的光照培养箱中进行培养；待藻密度达到100-600万个/ml，放入50-60℃恒温水浴锅中加热10-15分钟，之后将藻液均匀涂布在平板培养基上进行培养，培养温度30-35℃；

步骤4、步骤3中平板培养基上形成单藻落后，挑选长势最快的单藻落，接种至加入了细胞保护液的基础培养基中，在32-35℃的光照培养箱中进行培养；藻密度达到100-600万个/ml，放入60-70℃恒温水浴锅中加热10-15分钟，之后将藻液均匀涂布在平板培养基上进行培养，培养温度35-45℃；

步骤5、步骤4中平板培养基上形成单藻落后，挑选长势最快的单藻落，接种至加入了细胞保护液的基础培养基中，在40-50℃的光照培养箱中进行培养；将生长最快的单藻落，放置在40-50℃光培摇床中进行扩培；

步骤6、将扩培好的藻种在40-50℃光照培养箱中进行高温生长验证，获得能够耐高温的小球藻藻种；

其中，基础培养基和平板培养基成分相同，包括琼脂、氯化钠、含微生素母液的营养母液，以及微量元素母液；所述维生素母液包括维生素B1、生物素和维生素B12，所述营养母液包括硝酸钠、磷酸二氢钾或其水合物、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、氯化铵、酵母抽提物和植物蛋白胨，所述微量元素母液包括乙二胺四乙酸二钠、氯化铁或其水合物、硫酸铜或其水合物、硫酸锌或其水合物、氯化钴或其水合物、氯化锰或其水合物，以及钼酸钠或其水合物；

所述细胞保护液包括特丁基对苯二酚、亚硝酸钠、生物素和吐温。

2.根据权利要求1所述选育方法，其特征在于，每升营养母液包括75g硝酸钠、5g二水合磷酸二氢钾或相同摩尔数的磷酸二氢钾、4g磷酸氢二钾、1g碳酸氢钠、1g氯化铵、2g酵母抽提物和1g植物蛋白胨。

3.根据权利要求1所述选育方法，其特征在于，每100mL维生素母液包括10mg维生素B1、0.05mg生物素和0.05mg维生素B12。

4.根据权利要求1所述选育方法，其特征在于，每升微量元素母液包括4.36g乙二胺四乙酸二钠、3.15g六水合氯化铁或相同摩尔数的氯化铁、9.8g五水合硫酸铜或相同摩尔数的硫酸铜、22g七水合硫酸锌或相同摩尔数的硫酸锌、10g六水合氯化钴或相同摩尔数的氯化钴、18g氯化锰或相同摩尔数的氯化锰，以及6.3g钼酸钠或相同摩尔数的钼酸钠。

5.根据权利要求1所述选育方法，其特征在于，每1L基础培养基或平板培养基包括17g琼脂、25g氯化钠、1mL含微生素母液的营养母液和1mL微量元素母液。

6.根据权利要求1或5所述选育方法，其特征在于，每1L营养母液含1mL维生素母液。

7.根据权利要求1所述选育方法，其特征在于，每1L细胞保护液包括5g特丁基对苯二酚、2g亚硝酸钠、1g生物素和1g吐温。

8.根据权利要求1所述选育方法，其特征在于，每1L基础培养基中添加5mL细胞保护液。

9.一种水产养殖用耐高温小球藻选育培养基，其特征在于，包括选育培养基和细胞保护液，所述选育培养基包括琼脂、氯化钠、含微生素母液的营养母液，以及微量元素母液；其中，所述维生素母液包括维生素B1、生物素和维生素B12，所述营养母液包括硝酸钠、磷酸二氢钾或其水合物、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、氯化铵、酵母抽提物和植物蛋白胨，所述微量元素母液包括乙二胺四乙酸二钠、氯化铁或其水合物、硫酸铜或其水合物、硫酸锌或其水合物、氯化钴或其水合物、氯化锰或其水合物，以及钼酸钠或其水合物；

所述细胞保护液包括特丁基对苯二酚、亚硝酸钠、生物素和吐温。

10.权利要求9所述选育培养基在选育水产养殖用耐高温小球藻中的应用。