CN112251360A - 一种耐高温海水小球藻及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制品技术领域，涉及一种耐高温海水小球藻的筛选、培养及应用。具体为从夏季高温期的海水育苗池中利用单细胞分离技术原位筛选单细胞藻类，经高温驯化获得具有较好耐高温性能的海水小球藻CG.sp4（保藏编号CGMCC No.19158）和Ch.sp2(保藏编号CGMCC No.19157)。通过测试其生长曲线，优化培养条件，进行该藻株的培养。本发明提供的两株耐高温海水小球藻，可在30‑45℃，光照条件13‑16μmol/(s×m2)条件下正常生长，可运用到水产育苗及养殖，亦可用于南北方夏季高温高光照条件下鲜活饵料或相关产品的开发中，具有较好的应用前景。

Description

一种耐高温海水小球藻及应用
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种耐高温海水小球藻及应用。
背景技术
饵料微藻是贝类、蛤类、单环刺螠、红刺参、鲍鱼等重要海水养殖经济品种育苗和养殖的主要饲料。同时，也是许多经济鱼类、虾类等养殖过程中养殖水体水色、水质调控的重要组成部分。以饵料微藻培养的轮虫、卤虫（丰年虫）等也是许多重要鱼类、虾类，如大菱鲆、牙鲆、南美白对虾等的主要饵料。因此，饵料微藻在水产育苗、保苗和养殖中占有重要地位。同时，许多饵料微藻中富含蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质等，亦可开发成食品、保健品或特殊医学配方食品等，满足人民对于健康的需求。
目前传统大面积贝类工厂化苗种中选择单胞藻作为饵料，单胞藻一般为角毛藻、金藻、扁藻等微藻品种。同时实际生产中应用的饵料微藻主要以的育苗或养殖企业内部生产为主，以相关企业提供的浓缩藻液、藻砖、藻泥等为辅。
小球藻营养丰富 , 蛋白质含量达50%-70%，国内外均研究证明小球藻可提高水产动物，特别是海珍品育苗成活率。例如可使河蟹育苗成活率提高15%-25%，对虾育苗成活率平均提高10%-20%，可为海水养殖企业带来更大经济效益。
目前生产中常用的海水小球藻的最适培养温度为25-30℃，平均粒径大小为3-5μm。但由于在育苗期间，需要经过高温的夏季。以 2018年为例，正常自然通风的条件下，夏季中午饵料大棚的水温会达到 30℃ 以上。在高温高光照条件下，目前所常用的小球藻极易衰败，无法满足水产幼苗和养殖对于活体饵料微藻的需求。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种耐高温海水小球藻及应用。
为实现上述目的，本发明所具有的技术方案为：
一种耐高温海水小球藻，小球藻为小球藻Ch.sp2或小球藻CG.sp4；其中，小球藻Ch.sp2已于2019年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，分类命名为小球藻 Chlorella sp.，保藏编号为CGMCC No. 19157；
小球藻CG.sp4已于2019年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，分类命名为小球藻 Chlorella sp.，保藏编号为CGMCC No.19158。
所述小球藻通过单细胞原位藻种分离、高温驯化获得耐30-45℃的耐高温海水小球藻。
所述高温驯化为将分离得到的小球藻单细胞分别加入改良的f/2培养基中，pH 7-9，光照强度13-16 μmol/(s×m2)，培养温度为30℃下进行初步筛选；将筛选得到的藻株分别置于改良f/2培养基中，pH 7-9，光照强度13-16 μmol/(s×m2)，每15-24h将培养温度提升0.5-1.5℃，直至最终温度达到40-45℃，即二次筛选获得具有较好耐高温性能的藻株。
所述改良的f/2培养基，其组成为NaNO3：60-90g/L；NaH2PO4：5-8g/L；EDTA：4-5g/L；FeCl3： 2-3g/L；CuSO4：10-50mg/L；ZnSO4：20-50mg/L；CoCl2：5-20mg/L；MnCl2：100-250mg/L；Na2MoO4：2-5mg/L；VB12：0.1-0.5mg/L；VB1:100-150mg/L；生物素0.5-1.5mg/L；pH值7-9。
所述小球藻的16s rDNA核心序列片段为：
CCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAAGGATGAAGGCCTATGGGTCGTAAACTTCTTTTCTCAGAGAAGAATTTTGACGGTATCTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACAGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGCGTCTGTAGGTGGCTTAAAAAGTCTCCTGTCAAAGATCAGGGCTTAACCCTGGGCCGGCAGGAGAAACTCTTAGGCTAGAGTTTGGTAGGGGCAGAGGGAATTCCCGGTGGAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACACCAAAGGCGAAAGCACTCTGCTGGGCCATAACTGACACTGAGAGACGAAAGCGAGGGGAGCAAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTCGCCGTAAACGATGGATACTAGATGTTGGATAGGTTAAATCATTCAGTATCGTAGCTAACGCGTGAAGTATCCCGCCTGGGGAGTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGACTTGACATGCCACTTTTTCCCTGAAAAGGGAAGTTACAGAGTGGACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCTTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTTTGAATTGCCATTCATGGGAAATTCAAAAGACTGCCGGTGACAAGCCGGAGGAAGGTGAGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCCTGGGCGACACACGTGCTACAATGGCCGGGACAAAGAGATGCAAACCCGCGAGGGCTAGCCAACCTCAAAAACCCGGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCCATACTGCGG
所述藻株采用单细胞分离技术进行小球藻的单细胞分离。通过耐高温测试获得，所得藻株具有较好耐高温性能的藻株。
所述单细胞分离技术，是指采用显微操作技术或流式细胞术进行小球藻单细胞的分离。
一种耐高温海水小球藻的培养方法，所述小球藻在30-45℃，光照强度为13-16 μmol/(s×cm2)，pH为7-9，培养基中N/P（质量比）为11-15:1的条件下培养。
所述改良的f/2培养基，其组成为NaNO3：60-90g/L；NaH2PO4：5-8g/L；EDTA：4-5g/L；FeCl3： 2-3g/L；CuSO4：10-50mg/L；ZnSO4：20-50mg/L；CoCl2：5-20mg/L；MnCl2：100-250mg/L；Na2MoO4：2-5mg/L；VB12：0.1-0.5mg/L；VB1:100-150mg/L；生物素0.5-1.5mg/L；pH值7-9。
一种耐高温海水小球藻的应用，所述耐高温海水小球藻在海水育苗和养殖期间作为饵料的应用。
所述小球藻在作为贝类、蛤类、螠虫类或鱼类幼苗和保苗期的鲜活饵料中的应用；
或，在作为培育和养殖卤虫或轮虫的次级饵料中的应用；
或，在鱼类、虾类、海参育苗和养殖期间的水质调节中的应用。
本发明所具有的优点
本发明利用单细胞分离技术对耐高温饵料微藻进行原位单细胞分离，再通过高温驯化筛选，优化培养条件进行耐高温饵料藻的培养。最终获得能够在40-45℃下正常生产的海水小球藻，同时其培养的最适条件为pH=7，N/P=14:1，平均粒径为4μm，可作为贝类、蛤类、螠虫类、鱼类育苗和保苗期的鲜活饵料应用，亦可可用于鱼类、虾类、海参育苗和养殖期间的水质调节，或用于卤虫、轮虫等次级饵料的培育和养殖，以及用以开发浓缩微藻、藻泥、藻砖、干粉等，以及以此为基础进行相关食品、保健品、特殊配方食品的生产。
附图说明
图1为本发明实施例提供的海水小球藻单细胞分离显微镜图。
图2为本发明实施例提供的获得的海水小球藻藻株耐高温（45℃）驯化效果图。
图3为本发明实施例提供的海水小球藻CG.sp4和Ch.sp2在40℃时的生长曲线图。
图4为本发明实施例获得海水小球藻CG.sp4，Ch.sp2细胞大小图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围中。
实施例1：耐高温海水小球藻的分离与鉴定
从夏季高温期海水育苗场的饵料培育池中的藻液中通过单细胞术分离获得耐高温藻株，具体为：
1）吸取样品到三凹片；
2）倒置显微镜下找到所需的藻细胞；
3）用毛细管对准藻细胞，慢慢吸入；
4）如果杂细胞太多，可以先用毛细管吸走它们，留下所需的藻细胞；
5）在第二凹孔慢慢吹出，再仔细吸入，确保是单细胞；
6）有必要在第三凹孔重复操作；
7）将单细胞吹入24孔细胞培养板；
8）24孔板长成后，转移到12孔板及50 mL细胞培养瓶中进行备份保种；
9）利用16s rDNA进行藻株鉴定。
从夏季高温期海水育苗场的饵料微藻养殖池中分离得到的6株海水小球藻（图1和图4），经培养发现各藻株生长状态良好，颜色纯正，镜检无原生动物污染，分别命名为Ch.sp.1-3，CG. sp4-6。
由图4可见用Digimizer软件测量其细胞大小经计算，Ch.sp2和CG.sp4藻株单细胞粒径为2-8μm，平均为4μm。
实施例2：海水小球藻的耐高温测试与驯化
备选耐高温海水小球藻：将上述获得各藻种按照10%接种量分别接种至250 mL改良的f/2培养基中进行单细胞培养。置于温度为33℃的恒温振荡培养箱中进行培养，以灯管作为光源，光暗比为12 h：12 h，有效光强为13-16 μmol/(s×m2)；每15h培养温度升高1℃直至温度为40℃，定时摇匀。观察各藻株生长情况（参见图2）。
改良的f/2培养基成分为：NaNO3：80g/L；NaH2PO4：8g/L；EDTA：4.5g/L；FeCl3： 2g/L；CuSO4：10mg/L；ZnSO4：50mg/L；CoCl2：20mg/L；MnCl2：150mg/L；Na2MoO4：5mg/L；VB12：0.5mg/L；VB1:150mg/L；生物素1mg/L。pH值7-9。
当温度升高至45℃后，与普通小球藻相比，Ch.sp.2和CG.sp.4仍具有较好的生长性能，颜色正常，没有发生明显衰败。（图2）
进一步将所得藻株利用总DNA提取试剂盒提取Ch.sp.2和CG.sp4的总DNA，利用16srDNA核心片段引物（F：CCGCAATGGGCGAAAG；R：CCGCAGTATGGCTGACCT）扩增后测序，测序结果与Genbank中现有数据对比，显示Ch.sp2和CG.sp4均为小球藻。
16s rDNA核心片段序列为：
CCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAAGGATGAAGGCCTATGGGTCGTAAACTTCTTTTCTCAGAGAAGAATTTTGACGGTATCTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACAGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGCGTCTGTAGGTGGCTTAAAAAGTCTCCTGTCAAAGATCAGGGCTTAACCCTGGGCCGGCAGGAGAAACTCTTAGGCTAGAGTTTGGTAGGGGCAGAGGGAATTCCCGGTGGAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACACCAAAGGCGAAAGCACTCTGCTGGGCCATAACTGACACTGAGAGACGAAAGCGAGGGGAGCAAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTCGCCGTAAACGATGGATACTAGATGTTGGATAGGTTAAATCATTCAGTATCGTAGCTAACGCGTGAAGTATCCCGCCTGGGGAGTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGACTTGACATGCCACTTTTTCCCTGAAAAGGGAAGTTACAGAGTGGACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCTTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTTTGAATTGCCATTCATGGGAAATTCAAAAGACTGCCGGTGACAAGCCGGAGGAAGGTGAGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCCTGGGCGACACACGTGCTACAATGGCCGGGACAAAGAGATGCAAACCCGCGAGGGCTAGCCAACCTCAAAAACCCGGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCCATACTGCGG
实施例3：CG.sp.4和Ch.sp.2的生长条件与生长曲线的测定
对CG.sp.4的培养基进行优化培养，将CG.sp.4按10wt%接种量接种至改良的f/2培养基中，将体系中pH值和氮磷比（NaNO3:Na2HPO4）设置不同优化培养指标， pH设置三个梯度：pH=7，pH=8，pH=9，N/P比设置三个梯度：12:1，13:1，14:1，对pH值和N/P进行交叉实验，共9个梯度。将藻置于33℃的恒温振荡培养箱中进行培养，以灯管作为光源，光暗比为24 h：0 h。每天定时取样检测藻液吸光度值的变化，结果显示CG.sp.4在培养基N/P=14:1，pH=7时生长速度最快。
利用上述的优化条件，将CG.sp.4按照1×105cfu/mL接种量接种至f/2培养基中，置于温度为40℃的恒温振荡培养箱中进行培养，150rpm/min，光暗比为12 h：12 h，有效光强为13-16 μmol/(s×m2)；每24h取样测培养液686 nm吸光度值，绘制CG.sp.4在40℃下不同时间的生长曲线（参见图3）。
同时，按上述过程进行Ch.sp.2的生长培养，同时绘制40℃下不同时间的生长曲线（参见图3）。
由图3可知，1 d -12 d为CG.sp.4的对数生长期；12 d -18 d为的平稳期；18 d -20 d为衰退期。从接种开始到第10 d细胞密度可达到3.0×106 cfu/mL，细胞浓度可达起始浓度的29倍。
1 d -12d为Ch.sp.2的对数生长期；12 d -15 d为的平稳期；15d -20 d为衰退期。从接种开始到第10 d细胞密度可达到2.5×106 cfu/mL，细胞浓度可达起始浓度的25倍。
综上可见，通过单细胞分离技术结合高温筛选与驯化，获得能够在40℃下正常生产的海水小球藻CG.sp.4和Ch.sp.2，其培养的最适条件为pH=7，N/P=14:1，平均粒径为4μm；对数生长及稳定器期较长，固定时间内的生物量显著提高，培养10d细胞密度可达2.5-3.0×106 cfu/mL；同时，该藻株在45℃下仍能保持存活，不易发生衰败。进而其可作为贝类、蛤类、螠虫类、鱼类育苗和保苗期的鲜活饵料应用，亦可可用于鱼类、虾类、海参育苗和养殖期间的水质调节，或用于卤虫、轮虫等次级饵料的培育和养殖，以及用以开发浓缩微藻、藻泥、藻砖、干粉等，以及以此为基础进行相关食品、保健品、特殊配方食品的生产。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院烟台海岸带研究所
莱州市顺昌水产有限公司
<120> 一种耐高温海水小球藻及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgcaatggg cgaaagcctg acggagcaat accgcgtgaa ggatgaaggc ctatgggtcg 60
taaacttctt ttctcagaga agaattttga cggtatctga ggaataagca tcggctaact 120
ctgtgccagc agccgcggta agacagagga tgcaagcgtt atccggaatg attgggcgta 180
aagcgtctgt aggtggctta aaaagtctcc tgtcaaagat cagggcttaa ccctgggccg 240
gcaggagaaa ctcttaggct agagtttggt aggggcagag ggaattcccg gtggagcggt 300
gaaatgcgta gagatcagga ggaacaccaa aggcgaaagc actctgctgg gccataactg 360
acactgagag acgaaagcga ggggagcaaa agggattaga tacccctgta gtcctcgccg 420
taaacgatgg atactagatg ttggataggt taaatcattc agtatcgtag ctaacgcgtg 480
aagtatcccg cctggggagt atgctcgcaa gagtgaaact caaaggaatt gacgggggcc 540
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct taccaggact 600
tgacatgcca ctttttccct gaaaagggaa gttacagagt ggacacaggt ggtgcatggc 660
tgtcgtcagc tcgtgtcttg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtt 720
ttgaattgcc attcatggga aattcaaaag actgccggtg acaagccgga ggaaggtgag 780
gatgacgtca agtcagcatg ccccttacgt cctgggcgac acacgtgcta caatggccgg 840
gacaaagaga tgcaaacccg cgagggctag ccaacctcaa aaacccggtc tcagttcgga 900
ttgcaggctg caactcgcct gcatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcag gtcagccata 960
ctgcgg 966

Claims (7)

1.一种耐高温海水小球藻，其特征在于：小球藻为小球藻Ch.sp2或小球藻CG.sp4；其中，小球藻Ch.sp2已于2019年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，分类命名为小球藻 Chlorella sp.，保藏编号为CGMCC No.19157；
小球藻CG.sp4已于2019年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，分类命名为小球藻 Chlorella sp.，保藏编号为CGMCC No.19158。
2.按权利要求1所述的耐高温海水小球藻，其特征在于：所述小球藻通过单细胞原位藻种分离、高温驯化获得耐30-45℃的耐高温海水小球藻。
3.按权利要求2所述的耐高温海水小球藻，其特征在于：所述高温驯化为将分离得到的小球藻单细胞分别加入改良的f/2培养基中，pH 7-9，光照强度13-16 μmol/(s×m2)，培养温度为30℃下进行初步筛选；将得到的藻株分别置于改良f/2培养基中，pH 7-9，光照强度13-16 μmol/(s×m2)，每15-24h将培养温度提升0.5-1.5℃，直至最终温度达到40-45℃，即筛选获得具有较好耐高温性能的藻株。
4.按权利要求2所述的耐高温海水小球藻，其特征在于：所述改良的f/2培养基，其组成为NaNO3：60-90g/L；NaH2PO4：5-8g/L；EDTA：4-5g/L；FeCl3： 2-3g/L；CuSO4：10-50mg/L；ZnSO4：20-50mg/L；CoCl2：5-20mg/L；MnCl2：100-250mg/L；Na2MoO4：2-5mg/L；VB12：0.1-0.5mg/L；VB1:100-150mg/L；生物素0.5-1.5mg/L；pH值7-9。
5.一种权利要求1所述的耐高温海水小球藻的培养方法，其特征在于：所述小球藻在30-45℃，光照强度为13-16 μmol/(s×cm2)，pH为7-9，培养基中N/P（质量比）为11-15:1的条件下培养。
6.一种权利要求1所述的耐高温海水小球藻的应用，其特征在于：所述耐高温海水小球藻在海水育苗和养殖期间作为饵料的应用。
7.按权利要求6所述的耐高温海水小球藻的应用，其特征在于：所述小球藻在作为贝类、蛤类、螠虫类或鱼类幼苗和保苗期的鲜活饵料中的应用；
或，在作为培育和养殖卤虫或轮虫的次级饵料中的应用；
或，在鱼类、虾类、海参育苗和养殖期间的水质调节中的应用。
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