CN104480015A - 一种盐生杜氏藻快速培养方法 - Google Patents

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王培磊
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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Abstract

本发明公开了一种盐生杜氏藻快速培养方法，属水产养殖领域。传统上，盐生杜氏藻采用开放式跑道水泥池并使用f/2培养液配方培养，生长慢，易污染，产量低，β-胡萝卜素含量低，品质差，效益低。为了克服传统培养方法缺点，本发明采用光照培养箱培养并在培养液中添加了硝酸铵，尿素，磷酸二氢钾，碳酸氢钠，柠檬酸铁，维生素B1，维生素B12，920植物生长刺激素等营养成分，在培养的后期补充营养盐并提高光照强度和温度，促进藻细胞持续生长并胁迫β-胡萝卜素积累，生长快，产量高，不易污染，品质好，操作简便，投资少，效益高。

Description

一种盐生杜氏藻快速培养方法
技术领域
本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种盐生杜氏藻快速培养方法。
背景技术
盐生杜氏藻Dunaliella salina是一种生长在内陆盐湖的双鞭毛单细胞绿藻，经驯化后可在普通海水中生活。隶属绿藻门、绿藻纲、团藻目、盐藻科、盐藻属。细胞卵圆形、椭圆形或梨形，长18-28μm，宽9.5-14μm，在不同盐度、光照、温度下形态变化较大。细胞前端呈凹陷状，在凹陷处生出两条等长鞭毛，鞭毛比细胞长约1/3；鞭毛基部有一红色眼点。体内有一杯状色素体，主要是叶绿素和类胡萝卜素(以β-胡萝卜素为主)。无性繁殖，藻体在运动中纵裂为二，各形成一个新体。细胞含丰富油脂、β-胡萝卜素、蛋白质、多糖、较高的Ca、P、Zn等，还含包括人类必需氨基酸在内的18种氨基酸，累积的甘油为干重的40-50％。在适当的条件下，细胞内合成的β-胡萝卜素可达细胞干重的14％上。在食品、医药保健以及化工和养殖业中具有独特经济价值，在澳大利亚、美国和以色列已实现了工业化生产，主要是用作β-胡萝卜素类保健品、化妆品、营养补充剂和藻粉等。
传统上，盐生杜氏藻采用开放式跑道水泥池并使用f/2培养液配方培养，生长慢，易污染，产量低，β-胡萝卜素含量低、品质差，效益低。为了克服盐生杜氏藻传统培养方法缺点，本发明采用光照培养箱培养并在培养液中添加了硝酸铵，尿素，磷酸二氢钾，碳酸氢钠，柠檬酸铁，维生素B1，维生素B12，920植物生长刺激素等营养成分，在培养的后期补充营养盐并提高光照强度和温度，促进藻细胞持续生长并胁迫β-胡萝卜素积累，培养液营养全面、持久，生长快，产量高，不易污染，品质好，操作简便，技术性要求不高，投资少，效益高。
发明内容
为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种盐生杜氏藻快速培养方法，具体方法如下：
步骤1培养液的配制；取一3000毫升的三角烧瓶，装入煮沸冷却后的海水2000毫升，加入硝酸铵5克，尿素3克，磷酸二氢钾1.5克，碳酸氢钠18克，柠檬酸铁0.2克，维生素B1 0.02毫克，维生素B12 0.1毫克，920植物生长刺激素0.01毫克，EDTA钠盐0.01克，保鲜膜封口，放在摇床上摇匀15分钟，保存备用。
步骤2接种；取一1000毫升的三角烧瓶，加入步骤1所配好的培养液500毫升，用处于对数生长期藻、生长旺盛、无污染的盐生杜氏藻藻种接种，接种后的密度达到2.5×104cell/每毫升，高压灭菌锅消毒后的报纸和橡皮筋封口。
步骤3光照培养箱培养；将步骤2接种后的三角烧瓶置入光照培养箱培养，培养的前5天，光照强度设为2500lx，设置温度为25±1℃，其中光/暗周期12L/12D，即提供间歇光，12小时光照，12小时黑暗；第6、7、8天光照强度设为6000lx，第9天后提供较高的光照和温度，以胁迫β-胡萝卜素的积累，光照强度15000lx，温度30℃。每天用手摇动6次，每次120秒钟。
步骤4补充营养液；从第6天开始，每天添加步骤1所述营养液50毫升，以补充营养盐的消耗。然后轻轻摇瓶90秒钟，放回光照培养箱，继续培养。
步骤5藻细胞采收；培养至第11天，细胞密度达到125×104cell/每毫升藻液，停止培养，将培养瓶从光照培养箱中取出，关闭培养箱电源。将藻液用离心机离心采收藻细胞，离心机转速5000转/每分钟，离心5分钟，弃上清液，可得牙膏状的藻泥，采收完毕。
有益结果
传统上，盐生杜氏藻采用开放式跑道水泥池并使用f/2培养液配方培养，生长慢，易污染，产量低，β-胡萝卜素含量低、品质差，效益低。为了克服盐生杜氏藻传统培养方法缺点，现在我采用光照培养箱培养并在培养液中添加了硝酸铵，尿素，磷酸二氢钾，碳酸氢钠，柠檬酸铁，维生素B1，维生素B12，920植物生长刺激素等营养成分，在培养的后期补充营养盐并提高光照强度和温度，促进藻细胞持续生长并胁迫β-胡萝卜素积累，培养液营养全面、持久，生长快，产量高，不易污染，品质好，操作简便，技术性要求不高，投资少，效益高。
附图说明
图1为盐生杜氏藻形态结构图；
其中附图标识为1红色眼点，2蛋白核，3色素体，4鞭毛；
图2为盐生杜氏藻生长情况图；
图2，其中横坐标为培养时间(天)，纵坐标为细胞密度，单位是×104cell/每毫升藻液。
具体实施方式
步骤1培养液的配制取一3000毫升的三角烧瓶，装入煮沸冷却后的海水2000毫升，加入硝酸铵5克，尿素3克，磷酸二氢钾1.5克，碳酸氢钠18克，柠檬酸铁0.2克，维生素B1 0.02毫克，维生素B12 0.1毫克，920植物生长刺激素0.01毫克，EDTA钠盐0.01克，保鲜膜封口，放在摇床上摇匀15分钟，保存备用；
步骤2接种取一1000毫升的三角烧瓶，加入步骤1所配好的培养液500毫升，用处于对数生长期、生长旺盛、无污染的盐生杜氏藻藻种接种，接种后的密度达到2.5×104cell/每毫升，高压灭菌锅消毒后的报纸和橡皮筋封口；
步骤3光照培养箱培养将步骤2接种后的三角烧瓶置入光照培养箱培养，培养的前5天，光照强度设为2500lx，设置温度为25±1℃，其中光/暗周期12L/12D，即提供间歇光，12小时光照，12小时黑暗；第6、7、8天光照强度设为6000lx，第9天后提供较高的光照和温度，以胁迫β-胡萝卜素的积累，光照强度15000lx，温度30℃。每天用手摇动6次，每次120秒钟；
步骤4补充营养液从第6天开始，每天添加步骤1所述营养液50毫升，以补充营养盐的消耗。然后轻轻摇瓶90秒钟，放回光照培养箱，继续培养；
步骤5藻细胞采收培养至第11天，细胞密度达到125×104cell/每毫升藻液，停止培养，将培养瓶从光照培养箱中取出，关闭培养箱电源。将藻液用离心机离心采收藻细胞，离心机转速5000转/每分钟，离心5分钟，弃上清液，可得牙膏状的藻泥，采收完毕；
步骤1中因柠檬酸铁(FeC6H5O7·5H2O)较难溶解，可加少量自来水在火炉上微热至80-90℃，并不断搅拌至全部融化；
步骤1中920植物生长刺激素为白色结晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(一般每克用50毫升酒精或60度白酒溶解1小时以上)，再按所需浓度兑水稀释；
步骤2中接种用的盐生杜氏藻预先进行提纯(本领域常规方法，只要可实现提纯即可，例如凯氏提取法)，以确保接种时藻种处于生长旺盛的对数生长期；
步骤1中各种营养盐要按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；
步骤1中各种无机物营养盐和维生素可预先配成母液且置于4℃冰箱冷藏保存备用，放置时间不要超过45天；
步骤1和2中所用三角烧瓶等玻璃仪器均需洗刷干净放在70℃烘箱中烘干后使用。
步骤1中所用化学药品纯度均需化学纯级别。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (1)

1.一种盐生杜氏藻快速培养方法，其特征在于具体步骤如下：
步骤1培养液的配制；取一3000毫升的三角烧瓶，装入煮沸冷却后的海水2000毫升，加入硝酸铵5克，尿素3克，磷酸二氢钾1.5克，碳酸氢钠18克，柠檬酸铁0.2克，维生素B10.02毫克，维生素B120.1毫克，920植物生长刺激素0.01毫克，EDTA钠盐0.01克，保鲜膜封口，放在摇床上摇匀15分钟，保存备用；
步骤2接种；取一个1000毫升的三角烧瓶，加入步骤1所配好的培养液500毫升，用处于对数生长期、生长旺盛、无污染的盐生杜氏藻藻种接种，接种后的密度达到2.5×104cell/每毫升，高压灭菌锅消毒后的报纸和橡皮筋封口；
步骤3光照培养箱培养；将步骤2接种后的三角烧瓶置入光照培养箱培养，培养的前5天，光照强度设为2500lx，设置温度为25±1℃，其中光/暗周期12L/12D，即提供间歇光，12小时光照，12小时黑暗；第6、7、8天光照强度设为6000lx，第9天后提供较高的光照和温度，以胁迫β-胡萝卜素的积累，光照强度15000lx，温度30℃。每天用手摇动6次，每次120秒钟；
步骤4补充营养液；从第6天开始，每天添加步骤1所述营养液50毫升，以补充营养盐的消耗。然后轻轻摇瓶90秒钟，放回光照培养箱，继续培养；
步骤5藻细胞采收；培养至第11天，细胞密度达到125×104cell/每毫升藻液，停止培养，将培养瓶从光照培养箱中取出，关闭培养箱电源。将藻液用离心机离心采收藻细胞，离心机转速5000转/每分钟，离心5分钟，弃上清液，可得牙膏状的藻泥，采收完毕。
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