CN102827776B

CN102827776B - 紫球藻培养基配方及塑料薄膜袋半连续培养方法

Info

Publication number: CN102827776B
Application number: CN201210349293.5A
Authority: CN
Inventors: 王培磊
Original assignee: Linyi University
Current assignee: Linyi University
Priority date: 2012-09-20
Filing date: 2012-09-20
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2032-09-20
Also published as: CN102827776A

Abstract

本发明公开了一种紫球藻培养基配方及塑料薄膜袋半连续培养方法，涉及海洋微藻养殖领域。紫球藻的培养传统上使用SBM培养液配方，生长速度慢，产量低。我的实验表明，用NH₄NO₃作氮源，添加适量的NaHCO₃并补充了九二0植物生长刺激素(即赤霉素)、A₈微量元素、f/2维生素，营养更均衡、全面，大大加快了紫球藻的生长速度，产量可以提高78％。紫球藻的培养方式，我用塑料薄膜袋半连续培养方法培养代替传统的开放水泥池一次性培养，使得微藻细胞在生长过程中始终保持合适的营养盐浓度，易于操作、不易污染、易于掌控、灵活多样、不易划破、安全可靠、透光性好、成本低、生长快、产量高。

Description

紫球藻培养基配方及塑料薄膜袋半连续培养方法

技术领域

本发明属于海洋微藻养殖领域，尤其涉及紫球藻培养基配方及塑料薄膜袋半连续培养方法。

背景技术

紫球藻Porphyridium cruentum属红藻门、原红藻纲、紫球藻目、紫球藻科、紫球藻属，是一种在不同生长阶段呈现紫红色或深红色海洋单细胞微藻，含有丰富的花生四烯酸AA和二十碳五烯酸EPA等多不饱和脂肪酸PUFAs。AA和EPA是人体重要的必需脂肪酸，AA具有调节心脏兴奋性、参与神经内分泌、促进细胞分裂和抑制血小板聚集的功能，而EPA是人体合成前列腺素及其衍生物前列环素、凝血烷、白三烯的前体，可改善血脂质量、降低胆固醇及血液黏度和血糖浓度，能有效治疗和预防冠心病等心脑血管疾病以及抗炎、抗过敏作用。因紫球藻具有生长迅速、代时短、可实现高密度培养的特点，为工业化大规模生产PUFAs提供有利条件，因此紫球藻正成为人们获取高产量PUFAs的重要来源。

一般来说，适合于培养单细胞藻类的培养基都可用于紫球藻的培养，这些培养基包括人工海水培养基ASW、KOCH培养基、Harder-Bederke培养基、Pringshein I培养基和PringsheinII培养基等。王长海对紫球藻在无通气的ASW、海水基础培养基SBM与海水培养基ASW中的生长情况进行了对比，结果发现SBM更适合紫球藻的生长。通过对培养基成分的分析，显示通过加富的海水可有效促进该藻的生长，而由人工配制的海水缺乏天然海水所特有的某些微量元素而在生长方面受到限制。在未通入CO₂的情况下，HCO₃ ^-是该藻可利用的唯一碳源，NaHCO₃浓度的高低决定其生长的快慢。作为单细胞的光合自养生物，CO₂无疑是影响紫球藻生长的主要营养因子。无机碳源的另外一个来源是碳酸氢盐，紫球藻在光合作用中具有利用质膜转化碳酸氢盐的能力，因此，NaHCO₃等可作为此种藻的主要碳源。在其它生长条件适合的情况下，这些无机碳源浓度的高低决定着该藻生长的快慢。对比实验揭示：高浓度的NaHCO₃可使藻体在对数期的生长速率有效提高。相对于NaHCO₃来说，黄俊辉研究证实在相同条件下以CO₂为碳源在生长速率、生物量产量和生物量产率方面，比NaHCO₃对照组分别高1.85、1.47和1.76倍。Akimoto研究了在30℃，12000lx光照、通入5％CO₂情况下紫球藻的生长情况，结果获得1.18g／L·d的生物量及0.66g／L·d的CO₂固定量。除了营自养生活外，有研究显示紫球藻也可利用葡萄糖等有机碳源。通入CO₂效果较好，但成本较高，设备复杂，故生产中使用NaHCO₃更经济合算且操作简便易行。

温度、光照、盐度、营养盐等对紫球藻生长都有重要影响。氮在细胞代谢中是形成氨基酸、嘌呤、嘧啶、卟啉、氨基糖和胺化合物等的基本元素，因而氮是紫球藻生长最重要的营养元素。有研究认为硝酸态氮是紫球藻生长的最佳氮源。我的实验显示NH₄NO₃用作氮源无论对细胞密度的增加、不饱和脂肪酸PUFAs的积累等方面的效果均优于NaNO₃和NH₄Cl，这可能是其中的两种离子NO₃ ^-和NH₄ ⁺均可被利用，作用互补，且可保持溶液中离子及pH平衡的结果。在有机氮是否也能促进紫球藻生长的问题上，存在着争论，肖华山等研究了4种无机氮源NaNO₃，KNO₃，NH₄NO₃，(NH₄)₂SO₄与一种有机氮源尿素对紫球藻生长的影响，结果表明：硝酸盐中的NO₃ ^-作为硝酸还原酶的诱导底物，可增强酶的活性，有利于合成蛋白质从而促进该藻的生长；铵盐中的NH₄ ⁺在一个较低的浓度范围内可以被紫球藻所吸收利用，但当超过这一浓度时，就会对藻体产生抑制和破坏作用，总体表现上铵盐不利于其生长；而作为有机氮源的尿素，对紫球藻的毒害较小。陈比链等通过单因素实验和均匀设计的数学方法对紫球藻生长所需的主要营养进行了优化。结果表明：添加碳源、氮源、磷源和VB₁₂在实验浓度范围内对紫球藻的生长有显著影响，而VB₁和Fe-EDTA对紫球藻的生长没有明显的促进作用。在此基础上了获得了以海水为基础、稳定高产的培养基配方：NaHCO₃2.755g／L，NaNO₃3.224g／L，KH₂PO₄0.035g／L，VB₁₂2.772μg／L，VB₁0.9mg／L，Fe-EDTA0.11mg／L。但我用自己发明的新营养盐配方培养紫球藻，产量更高，可以提高产量78％。

微藻产业发展的前提条件是获得充足的生物质原料。微藻培养模式的选择是提高微藻生物质产量的关键环节，因此培养模式一直是国内外研究的热点之一。目前广泛使用的微藻培养模式主要有批次培养(即一次性培养)、流加培养、半连续培养和连续培养。微藻批次培养是实验室内普遍采用的一种培养方式，具有操作简单，成本低的优点。缺点是在进行批次培养时，微藻消耗营养盐尤其是氮、磷的速度较快，容易造成培养液中氮、磷营养盐的缺乏，藻细胞的生长和增殖受到限制。这个问题在培养的中后期尤其严重。流加培养也称为分批补料培养，是指在培养过程中向培养液中添加一种或多种营养物质的培养方法。连续培养是指以一定的流速连续向培养系统内添加新鲜培养液，同时以相同的速度流出培养液，使反应器内的细胞生长环境处于恒定状态。流加培养和连续培养模式可有效调节藻细胞生长过程中的营养盐浓度，使培养液中营养盐浓度维持在合适水平，既能减轻较高初始营养盐浓度引起的抑制和毒害作用，使藻体生长的延迟期大大缩短，又能有效解决批次培养中营养盐限制问题，保证营养盐的持续供给使微藻长时间处于对数生长期，提高了增殖效率，但实际应用中操作麻烦，设备较复杂，成本高。

我的实验证实，半连续培养模式是紫球藻规模生产的最佳培养方式。半连续培养可及时补充培养基中的营养盐，特别是在培养的后期，保证紫球藻对营养盐中必需养分的充分摄取，而且操作简单、方便、易行。在氮限制的培养基中，因营养盐更新率的升高而增加了氮源的浓度，使得紫球藻细胞生长过程中始终保持合适的氮源浓度，可以大大延长藻细胞的生长时间，使产量提高78％。

发明内容

为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种紫球藻培养基配方，其特征在于该紫球藻培养基配方如下：NH₄NO₃30.2毫克，KH₂PO₄8毫克，NaHCO₃504毫克，九二0植物生长刺激素(即赤霉素)6国际单位，A₈微量元素溶液3毫升，f／2维生素溶液1毫升，人尿1.5-2毫升，消毒海水1000毫升；其中A₈微量元素溶液配方：Fe0.4克，MnCl₂0.05克，ZnSO₄0.005克，CuSO₄0.002克，H₃BO₃0.05克，MoO₃0.001克，V0.001克，Co(NO₃)₂0.001克，0.05mol/L的H₂SO₄300毫升；f／2维生素溶液配方：维生素B₁₂0.5毫克，维生素B₁100毫克，维生素H0.5毫克，纯水1000毫升。

紫球藻的塑料薄膜袋半连续培养方法，包括如下步骤：

采用长度450厘米、周长200厘米的农用聚乙烯透明塑料薄膜袋培养，两头分别用纱布扎口；一端扎入1根充气管，末端连2个散气石，作散气用；塑料袋另一端扎入一根长约20厘米，直径6厘米的聚乙烯硬管，作出气管，此袋即为培养藻的容器；将此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池长×宽×深=600厘米×400厘米×85厘米，塑料袋两端扎好后，用绳吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入0.8～1.4立方米的培养液并接入藻种，即可进行培养；每池吊袋6-8个；培养用的海水盐度20-30‰，用次氯酸钠消毒法消毒，方法是1立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量达到10-20mg/L，充气8-12小时后，用硫代硫酸钠中和余氯。硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止；所述的培养基配方加入营养盐，选纯种的对数生长期藻种接种，即生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象的藻种，镜检无其它杂藻、原生动物等；接种密度30×10⁴cell／mL，室外培养，自然光照射，温度22-30℃，光强4000-8000lx为最佳，气泵充入空气，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可，充气管末端连两个气石；夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时，重复进行；培养4-6天，密度达100×10⁴-200×10⁴cell／mL，采收藻液的1／3，补加相同体积的新鲜培养基，继续培养，48小时后再采收藻液的1／3，补加相同体积的新鲜培养基，继续培养，如此循环进行，5-7个循环周期后即可全部采收。

一种紫球藻培养基配方，该紫球藻培养基配方如下：NH₄NO₃30.2毫克，KH₂PO₄8毫克，NaHCO₃504毫克，九二0植物生长刺激素(即赤霉素)6国际单位，A₈微量元素溶液3毫升，f／2维生素溶液1毫升，人尿1.5-2毫升，消毒海水1000毫升；其中A₈微量元素溶液配方：KNO₃0.2g／L，Cacl₂2HO₂1.2g／L，Fe0.4g，MnCl₂0.05g，NaNO₃0.05g，ZnSO₄0.005g，CuSO₄0.002g，H₃BO₃0.05g，MoO₃0.001g，复合维生素B注射液0.001g，Co(NO₃)₂0.001g，0.05mol／L的H₂SO₄300毫升；f／2维生素溶液配方：维生素B₁₂0.5毫克，维生素B₁100毫克，维生素H0.5毫克，葡萄糖0.01g，木糖0.01g，乳糖0.01g，纯水1000毫升。，

紫球藻的塑料薄膜袋半连续培养方法，包括如下步骤：

采用长度450厘米、周长200厘米的农用聚乙烯透明塑料薄膜袋培养，两头分别用纱布扎口；一端扎入1根充气管，末端连2个散气石，作散气用；塑料袋另一端扎入一根长约20厘米，直径6厘米的聚乙烯硬管，作出气管，此袋即为培养藻的容器；将此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池长×宽×深=600厘米×400厘米×85厘米，塑料袋两端扎好后，用绳吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入0.8～1.4立方米的培养液并接入藻种，即可进行培养；每池吊袋6-8个；培养用的海水盐度20-30‰，用次氯酸钠消毒法消毒，方法是1立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量达到10-20mg／L，充气8-12小时后，用硫代硫酸钠中和余氯。硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止；所述的培养基配方加入营养盐，选纯种的对数生长期藻种接种，即生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象的藻种，镜检无其它杂藻、原生动物等；接种密度30×10⁴cell／mL，室外培养，自然光照射，温度21-26℃，光强4000-8000lx为最佳，气泵充入空气，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可，充气管末端连两个气石；夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时，重复进行；培养4-6天，密度达100×10⁴-200×10⁴cell／mL，采收藻液的1／3，补加相同体积的新鲜培养基，继续培养，48小时后再采收藻液的1／3，补加相同体积的新鲜培养基，继续培养，如此循环进行，5-7个循环周期后即可全部采收。

一种紫球藻培养基配方，该紫球藻培养基配方如下：NH₄NO₃30.2毫克，KH₂PO₄8毫克，NaHCO₃504毫克，九二0植物生长刺激素(即赤霉素)6国际单位，A₈微量元素溶液3毫升，f／2维生素溶液1毫升，人尿1.5毫升，消毒海水1000毫升；其中A₈微量元素溶液配方：FeC₆H₅O₇0.0025g／L，KNO₃0.2g／L，Cacl₂2HO₂1.2g／L，Fe0.4g，MnCl₂0.05g，NaNO₃0.05g，ZnSO₄0.005g，CuSO₄0.002g，H₃BO₃0.05g，MoO₃0.001g，复合维生素B注射液0.001g，Co(NO₃)₂0.001g，0.05mol／L的H₂SO₄300毫升；f／2维生素溶液配方：维生素B₁₂0.5毫克，维生素B₁100毫克，维生素H0.5毫克，葡萄糖0.01g，木糖0.01g，乳糖0.01g，纯水1000毫升。

紫球藻的塑料薄膜袋半连续培养方法，包括如下步骤：

采用长度450厘米、周长200厘米的农用聚乙烯透明塑料薄膜袋培养，两头分别用纱布扎口；一端扎入1根充气管，末端连2个散气石，作散气用；塑料袋另一端扎入一根长约20厘米，直径6厘米的聚乙烯硬管，作出气管，此袋即为培养藻的容器；将此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池长×宽×深=600厘米×400厘米×85厘米，塑料袋两端扎好后，用绳吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入0.8～1.4立方米的培养液并接入藻种，即可进行培养；每池吊袋6-8个；培养用的海水盐度20-30‰，用次氯酸钠消毒法消毒，方法是1立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量达到10-20mg/L，充气8-12小时后，用硫代硫酸钠中和余氯。硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止；所述的培养基配方加入营养盐，选纯种的对数生长期藻种接种，即生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象的藻种，镜检无其它杂藻、原生动物等；接种密度30×10⁴cell／mL，室外培养，自然光照射，温度21-26℃，光强4000-8000lx为最佳，气泵充入空气，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可，充气管末端连两个气石；夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时，重复进行；培养4-6天，密度达100×10⁴-200×10⁴cell／mL，采收藻液的1／3，补加相同体积的新鲜培养基，继续培养，48小时后再采收藻液的1／3，补加相同体积的新鲜培养基，继续培养，如此循环进行，5-7个循环周期后即可全部采收。

一种紫球藻培养基配方，该紫球藻培养基配方如下：NH₄NO₃30.2毫克，KH₂PO₄8毫克，NaHCO₃504毫克，九二0植物生长刺激素(即赤霉素)6国际单位，A₈微量元素溶液3毫升，f／2维生素溶液1毫升，人尿1.5毫升，消毒海水1000毫升；其中A₈微量元素溶液配方：FeC₆H₅O₇0.0025g／L，土壤浸出液10ml，KNO₃0.2g/L，Cacl₂2HO₂1.2g／L，Fe0.4g，MnCl₂0.05g，NaNO₃0.05g，ZnSO₄0.005g，CuSO₄0.002g，H₃BO₃0.05g，MoO₃0.001g，V0.001g，Co(NO₃)₂0.001g，0.05mol／L的H₂SO₄300毫升；f／2维生素溶液配方：维生素B₁₂0.5毫克，维生素B₁100毫克，维生素H0.5毫克，葡萄糖0.01g，木糖0.01g，乳糖0.01g，纯水1000毫升。

紫球藻的塑料薄膜袋半连续培养方法，包括如下步骤：

土壤浸出液的提取步骤为：

(1)从野外取回有代表性的土壤样品，在105～115℃下烘干。

(2)称取5g干燥的土壤样品，放入50mL干燥的锥形瓶中，加入25mL0.5mol/L的碳酸氢钠浸提液.用玻璃棒把土壤搅散.再加入半药匙活性炭，剧烈振荡1～2分钟后静置5～10分钟，过滤后得到的滤液是土壤浸出液。

有益效果：紫球藻的培养传统上使用SBM培养液配方，生长速度慢，产量低。我的实验表明，用NH₄NO₃作氮源，添加适量的NaHCO₃并补充了九二0植物生长刺激素(即赤霉素)、A₈微量元素、f／2维生素，营养更均衡、全面，大大加快了紫球藻的生长速度，产量可以提高78％。紫球藻的培养方式，我用塑料薄膜袋半连续培养方法培养代替传统的开放水泥池，使得微藻细胞在生长过程中始终保持合适的营养盐浓度，易于操作、不易污染、易于掌控、灵活多样、不易划破、安全可靠，透光性好，成本低，生长快，产量可提高78％。

附图说明

图1为塑料薄膜悬浮吊袋半连续方法培养紫球藻示意图

其中附图标记为：1塑料薄膜袋2水泥池3藻液4进气管5出气管6散气石7普通海水

具体实施方式

培养基配制方法

1)九二0植物生长刺激素(即赤霉素)为白色结晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(一般每克用50毫升酒精或60度白酒溶解1小时以上)，再按所需浓度兑水稀释；

2)加营养盐的过程中需不断搅水，而且各种营养盐按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；

3)各种营养盐特别是A₈微量元素溶液和f／2维生素溶液均需预先配成母液备用；但放置时间不要超过7天，且最好4℃冰箱冷藏保存；

4)全部营养盐加完后再充气搅拌15分钟，即可接种；

5)所有药品纯度均需化学纯级别；

6)此培养基配方对紫球藻扩种阶段和大规模培养等各阶段都适用。

紫球藻塑料薄膜袋半连续培养方法，参见附图：

采用长度450厘米、周长200厘米的农用聚乙烯透明塑料薄膜袋培养，两头分别用纱布扎口。一端扎入1根充气管，末端连2个散气石，作散气用；塑料袋另一端扎入一根长约20厘米，直径6厘米的聚乙烯硬管，作出气管，此袋即为培养藻的容器。将此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池长×宽×深=600厘米×400厘米×85厘米，塑料袋两端扎好后，用绳吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入0.8～1.4立方米的培养液并接入藻种，即可进行培养。每池吊袋6-8个。培养用的海水盐度20-30‰，用次氯酸钠消毒法消毒，方法是1立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量达到10-20mg/L，充气8-12小时后，用硫代硫酸钠中和余氯。硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止。按上述培养基配方加入营养盐，选纯种的对数生长期藻种接种，即生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象的藻种，镜检无其它杂藻、原生动物等。接种密度30×10⁴cell／mL，室外培养，自然光照射，温度22-30℃，光强4000-8000lx为最佳，气泵充入空气，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可，充气管末端连两个气石。夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时，重复进行。培养4-6天，密度达100×10⁴-200×10⁴cell／mL，采收藻液的1／3，补加相同体积的新鲜培养基，继续培养，48小时后再采收藻液的1／3，补加相同体积的新鲜培养基，继续培养，如此循环进行，5-7个循环周期后即可全部采收。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.紫球藻的塑料薄膜袋半连续培养方法，其特征在于包括如下步骤：

配置紫球藻培养基配方，该紫球藻培养基配方如下：NH₄NO₃30.2毫克，KH₂PO₄8毫克，NaHCO₃504毫克，九二0植物生长刺激素6国际单位，A₈微量元素溶液3毫升，f/2维生素溶液1毫升，人尿1.5-2毫升，消毒海水1000毫升；其中A₈微量元素溶液配方：KNO₃0.2g/L，CaCl₂2HO₂1.2g/L，Fe0.4g，MnCl₂0.05g，NaNO₃0.05g，ZnSO₄0.005g，CuSO₄0.002g，H₃BO₃0.05g，MoO₃0.001g，复合维生素B注射液0.001g，Co(NO₃)₂0.001g，0.05mol／L的H₂SO₄300毫升；f/2维生素溶液配方：维生素B₁₂0.5毫克，维生素B₁100毫克，维生素H0.5毫克，葡萄糖0.01g，木糖0.01g，乳糖0.01g，纯水1000毫升；

所述紫球藻的塑料薄膜袋半连续培养方法，包括如下步骤：

采用长度450厘米、周长200厘米的农用聚乙烯透明塑料薄膜袋培养，两头分别用纱布扎口；一端扎入1根充气管，末端连2个散气石，作散气用；塑料袋另一端扎入一根长20厘米，直径6厘米的聚乙烯硬管，作出气管，此袋即为培养藻的容器；将此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池长×宽×深=600厘米×400厘米×85厘米，塑料袋两端扎好后，用绳吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入0.8～1.4立方米的培养液并接入藻种，即可进行培养；每池吊袋6-8个；培养用的海水盐度20-30‰，用次氯酸钠消毒法消毒，方法是1立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量达到10-20mg/L，充气8-12小时后，用硫代硫酸钠中和余氯；硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止；按所述的培养基配方加入营养盐，选纯种的对数生长期藻种接种，即生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象的藻种，镜检无其它杂藻、原生动物；接种密度30×10⁴cell／mL，室外培养，自然光照射，温度21-26℃，光强4000-8000lx为最佳，气泵充入空气，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可，充气管末端连两个气石；夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时，重复进行；培养4-6天，密度达100×10⁴-200×10⁴cell／mL，采收藻液的1／3，补加相同体积的新鲜培养基，继续培养，48小时后再采收藻液的1／3，补加相同体积的新鲜培养基，继续培养，如此循环进行，5-7个循环周期后即可全部采收。

2.紫球藻的塑料薄膜袋半连续培养方法，其特征在于包括如下步骤：

配置紫球藻培养基配方，该紫球藻培养基配方如下：NH₄NO₃0.2毫克，KH₂PO₄8毫克，NaHCO₃504毫克，九二0植物生长刺激素6国际单位，A₈微量元素溶液3毫升，f/2维生素溶液1毫升，人尿1.5毫升，消毒海水1000毫升；其中A₈微量元素溶液配方：FeC₆H₅O₇0.0025g／L，KNO₃0.2g／L，CaCl₂2HO₂1.2g／L，Fe0.4g，MnCl₂0.05g，NaNO₃0.05g，ZnSO₄0.005g， CuSO₄0.002g，H₃BO₃0.05g，MoO₃0.001g，复合维生素B注射液0.001g，Co(NO₃)₂0.001g，0.05mol／L的H₂SO₄300毫升；f/2维生素溶液配方：维生素B₁₂0.5毫克，维生素B₁100毫克，维生素H0.5毫克，葡萄糖0.01g，木糖0.01g，乳糖0.01g，纯水1000毫升；

所述紫球藻的塑料薄膜袋半连续培养方法，包括如下步骤：采用长度450厘米、周长200厘米的农用聚乙烯透明塑料薄膜袋培养，两头分别用纱布扎口；一端扎入1根充气管，末端连2个散气石，作散气用；塑料袋另一端扎入一根长20厘米，直径6厘米的聚乙烯硬管，作出气管，此袋即为培养藻的容器；将此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池长×宽×深=600厘米×400厘米×85厘米，塑料袋两端扎好后，用绳吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入0.8～1.4立方米的培养液并接入藻种，即可进行培养；每池吊袋6-8个；培养用的海水盐度20-30‰，用次氯酸钠消毒法消毒，方法是1立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量达到10-20mg/L，充气8-12小时后，用硫代硫酸钠中和余氯；硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止；按所述的培养基配方加入营养盐，选纯种的对数生长期藻种接种，即生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象的藻种，镜检无其它杂藻、原生动物；接种密度30×10⁴cell／mL，室外培养，自然光照射，温度21-26℃，光强4000-8000lx为最佳，气泵充入空气，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可，充气管末端连两个气石；夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时，重复进行；培养4-6天，密度达100×10⁴-200×10⁴cell／mL，采收藻液的1／3，补加相同体积的新鲜培养基，继续培养，48小时后再采收藻液的1／3，补加相同体积的新鲜培养基，继续培养，如此循环进行，5-7个循环周期后即可全部采收。

3.紫球藻的塑料薄膜袋半连续培养方法，其特征在于包括如下步骤：

配置紫球藻培养基配方，该紫球藻培养基配方如下：NH₄NO₃30.2毫克，KH₂PO₄8毫克，NaHCO₃504毫克，九二0植物生长刺激素6国际单位，A₈微量元素溶液3毫升，f/2维生素溶液1毫升，人尿1.5毫升，消毒海水1000毫升；其中A₈微量元素溶液配方：FeC₆H₅O₇0.0025g/L，土壤浸出液10ml，KNO₃0.2g/L，CaCl₂2HO₂1.2g/L，Fe0.4g，MnCl₂0.05g，NaNO₃0.05g，ZnSO₄0.005g，CuSO₄0.002g，H₃BO₃0.05g，MoO₃0.001g，V0.001g，Co(NO₃)₂0.001g，0.05mol／L的H₂SO₄300毫升；f/2维生素溶液配方：维生素B₁₂0.5毫克，维生素B₁100毫克，维生素H0.5毫克，葡萄糖0.01g，木糖0.01g，乳糖0.01g，纯水1000毫升；

所述紫球藻的塑料薄膜袋半连续培养方法，包括如下步骤：

采用长度450厘米、周长200厘米的农用聚乙烯透明塑料薄膜袋培养，两头分别用纱布扎口；一端扎入1根充气管，末端连2个散气石，作散气用；塑料袋另一端扎入一根长20厘米，直径6厘米的聚乙烯硬管，作出气管，此袋即为培养藻的容器；将此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池长×宽×深=600厘米×400厘米×85厘米，塑料袋两端扎好后，用绳吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入0.8～1.4立方米的培养液并接入藻种，即可进行培养；每池吊袋6-8个；培养用的海水盐度20-30‰，用次氯酸钠消毒法消毒，方法是1立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量达到10-20mg／L，充气8-12小时后，用硫代硫酸钠中和余氯；硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止；按所述的培养基配方加入营养盐，选纯种的对数生长期藻种接种，即生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象的藻种，镜检无其它杂藻、原生动物；接种密度30×10⁴cell／mL，室外培养，自然光照射，温度21-26℃，光强4000-8000lx为最佳，气泵充入空气，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可，充气管末端连两个气石；夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时，重复进行；培养4-6天，密度达100×10⁴-200×10⁴cell／mL，采收藻液的1／3，补加相同体积的新鲜培养基，继续培养，48小时后再采收藻液的1／3，补加相同体积的新鲜培养基，继续培养，如此循环进行，5-7个循环周期后即可全部采收；

所述土壤浸出液的提取步骤为：

(1)从野外取回有代表性的土壤样品，在105～115℃下烘干；

(2)称取5g干燥的土壤样品，放入50mL干燥的锥形瓶中，加入25mL0.5mol／L的碳酸氢钠浸提液，用玻璃棒把土壤搅散再加入半药匙活性炭，剧烈振荡1～2分钟后静置5～10分钟，过滤后得到的滤液是土壤浸出液。