CN104726338A - 提高紫球藻花生四烯酸含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高紫球藻花生四烯酸含量的方法，属水产养殖领域。传统上紫球藻采用开放型跑道式大池且使用Allen培养基培养，生长慢，产量低，易污染，成本高，基础投资大，花生四烯酸含量低，产品质量差，本发明采用光照培养箱培养，在培养的后期，加大光照强度和温度，胁迫紫球藻积累花生四烯酸，补充了硝酸钠，氯化铵，碳酸氢铵，尼克酸，α-萘乙酸，硫酸镁，Na2EDTA等且在培养后期分批补充营养盐，既满足了紫球藻的营养需求，又克服了一次性添加营养盐造成的早期营养盐浓度太高对藻细胞造成的毒害，大大提高了紫球藻的生长速度和产量，紫球藻中花生四烯酸含量提高120％。

Description

提高紫球藻花生四烯酸含量的方法
技术领域
本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种提高紫球藻花生四烯酸含量的方法。
背景技术
紫球藻Porphyridium cruentum隶属红藻门，红藻纲，紫球藻目，紫球藻科，紫球藻属。单细胞，常不规则地聚集在一起，外被一层薄胶膜，细胞多球形，血红色或暗紫红色，具1轴生星状或不规则形状色素体及1无鞘蛋白核，以细胞分裂营无性生殖。细胞直径10-24μm，分布世界各地。盐度适应范围较广，适宜温度为13-31℃，最适21-26℃，pH 5.3-8.3可正常生长，7.5最适。紫球藻能产生许多生物活性物质，如藻胆蛋白、多不饱和脂肪酸及胞外多糖。蛋白质约占生物量50％，其中84％为藻胆蛋白，特别是B-藻胆蛋白性质稳定。细胞可积累20-50％生物量的多糖，由木糖，葡萄糖，半乳糖等构成，具胶体性能，粘度大。脂肪酸约占生物量9.5％，50％以上为不饱和脂肪酸，其中花生四烯酸(ARA)约占总脂36％。花生四烯酸又名花生油烯酸，是人体中含量最高、分布最广的多不饱和脂肪酸，在维持机体细胞膜结构与功能方面有重要作用，作为一种重要的结构脂类广泛存在于哺乳动物组织、器官中，还是人体前列腺素合成的前体物质，参与神经内分泌，调节平滑肌收缩，促进细胞分裂，抑制血小板聚集，对人体心血管系统及免疫系统正常运行也十分重要。
传统上紫球藻的大量培养采用开放型跑道式大池且使用Allen培养基培养，光照强度和温度完全依赖大自然，变化无常且不符合紫球藻各阶段生长和脂肪酸积累的要求，无法人为控制，生长慢，产量低，易污染，成本高，基础投资大，脂肪酸特别是花生四烯酸含量低，产品质量差。为了克服目前技术的不足，本发明采用光照培养箱进行培养，根据紫球藻不同生长阶段的特定需要调整光照强度和温度，特别是在培养的后期，加大光照强度和温度，胁迫紫球藻积累花生四烯酸，并对传统培养基进行了调整，补充了硝酸钠，尿素，氯化铵，磷酸二氢钠，碳酸氢铵，硫酸亚铁，维生素B1，维生素B12，生物素，尼克酸，α-萘乙酸，硫酸镁，Na2EDTA，且改变了传统一次性培养的做法，在培养的后期持续分批补充营养盐，既满足了紫球藻的营养需求，又克服了一次性添加营养盐造成的早期营养盐浓度太高对藻细胞造成的毒害、压抑及浪费，大大提高了紫球藻的生长速度和产量，花生四烯酸含量提高120％。
发明内容
为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种提高紫球藻花生四烯酸含量的方法，具体方法如下：
步骤1培养液的配制培养液成分：煮沸冷却后的海水1000份，硝酸钠3份，尿素1份，氯化铵1.5份，磷酸二氢钾1.5份，碳酸氢铵2份，硫酸亚铁0.01份，维生素B10.02份，维生素B120.001份，生物素0.004份，尼克酸0.003份，α-萘乙酸0.001份，硫酸镁0.2份，Na2EDTA 0.002份。取此培养液2000毫升装入一3000毫升的三角烧瓶，保鲜膜和橡皮筋封口，放在摇床上摇匀15分钟，放入4℃冰箱保存备用。
步骤2，接种培养取一1500毫升的干净的三角烧瓶，装入步骤1所述的培养液600毫升，取生长旺盛、无污染、指数生长期的紫球藻接种，接种密度每毫升藻液4万个细胞，放在摇床上摇动10分钟，灭菌消毒的报纸和橡皮筋封口，放进光照培养箱中培养，调节温度至24℃，光照强度3500lux，其中光/暗周期16L/8D，即提供间歇光，16小时光照，8小时黑暗；每天手动摇瓶3次，每次45秒钟；
步骤3，补充营养盐培养至第6天，添加步骤1所述的藻液100毫升，以补充营养盐的消耗，并将温度调节至26℃，光照强度5000lux，继续培养，至第7天，再补充步骤1所述培养液100毫升，并将温度调节至27℃，光照强度6000lux，继续培养，至第8天，再补充步骤1所述培养液100毫升，并将温度调节至28℃，光照强度9000lux，继续培养，至第9天，再补充步骤1所述培养液100毫升，并将温度调节至30℃，光照强度12000lux，培养至第10天，再补充步骤1所述培养液100毫升，并将温度调节至31℃，光照强度13000；
步骤4，采收培养至第11天，紫球藻密度可达每毫升240万个细胞，取上面上浮性较好的藻液600毫升转移至另一个1500毫升的三角烧瓶中(下面的老化的藻液即可通过离心法采收)，补充400毫升步骤1所述的培养液，手动摇匀60秒钟，调节温度为32℃，光照强度15000lux，继续培养，每天手动摇瓶6次，每次30秒钟，连续培养4天后，停止培养，将三角烧瓶从光照培养箱中取出，关闭培养箱电源，将培养液用离心机离心，离心机转速每分钟5400转，离心10分钟，弃上清液，可得粘稠牙膏状藻泥，采收完毕。
有益结果
传统上紫球藻大量培养采用开放型跑道式大池培养且是使用Allen培养基，光照强度和温度完全依赖大自然，无法人为控制，生长慢，产量低，易污染，成本高，基础投资大，脂肪酸特别是花生四烯酸含量低，产品质量差，为了克服目前技术的不足，本发明采用光照培养箱进行培养，根据紫球藻不同生长阶段的特定需要调整光照强度和温度，特别是在培养的后期，加大光照强度和温度，胁迫紫球藻积累花生四烯酸，并对传统培养基进行了调整，补充了硝酸钠，尿素，氯化铵，磷酸二氢钠，碳酸氢铵，硫酸亚铁，维生素B1，维生素B12，生物素，尼克酸，α-萘乙酸，硫酸镁，Na2EDTA，且改变了传统一次性培养的做法，在培养的后期持续分批补充营养盐，既满足了紫球藻的营养需求，又克服了一次性添加营养盐造成的早期营养盐浓度太高对藻细胞造成的毒害和压抑及浪费，大大提高了紫球藻的生长速度和产量，对紫球藻合成脂肪酸特别是花生四烯酸大有好处。
附图说明
图1为紫球藻外部形态；其中附图标识为1群体，2单细胞体；
图2为紫球藻生长情况，其中横坐标为培养时间(天)，纵坐标为细胞密度，单位是万个细胞/每毫升藻液。
具体实施方式
步骤1培养液的配制培养液成分：煮沸冷却后的海水1000份，硝酸钠3份，尿素1份，氯化铵1.5份，磷酸二氢钾1.5份，碳酸氢铵2份，硫酸亚铁0.01份，维生素B10.02份，维生素B120.001份，生物素0.004份，尼克酸0.003份，α-萘乙酸0.001份，硫酸镁0.2份，Na2EDTA 0.002份。取此培养液2000毫升装入一3000毫升的三角烧瓶，保鲜膜和橡皮筋封口，放在摇床上摇匀15分钟，放入4℃冰箱保存备用。
步骤2，接种培养取一1500毫升的干净的三角烧瓶，装入步骤1所述的培养液600毫升，取生长旺盛、无污染、指数生长期的紫球藻接种，接种密度每毫升藻液4万个细胞，放在摇床上摇动10分钟，灭菌消毒的报纸和橡皮筋封口，放进光照培养箱中培养，调节温度至24℃，光照强度3500lux，其中光/暗周期16L/8D，即提供间歇光，16小时光照，8小时黑暗；每天手动摇瓶3次，每次45秒钟；
步骤3，补充营养盐培养至第6天，添加步骤1所述的藻液100毫升，以补充营养盐的消耗，并将温度调节至26℃，光照强度5000lux，继续培养，至第7天，再补充步骤1所述培养液100毫升，并将温度调节至27℃，光照强度6000lux，继续培养，至第8天，再补充步骤1所述培养液100毫升，并将温度调节至28℃，光照强度9000lux，继续培养，至第9天，再补充步骤1所述培养液100毫升，并将温度调节至30℃，光照强度12000lux，培养至第10天，再补充步骤1所述培养液100毫升，并将温度调节至31℃，光照强度13000；
步骤4，采收培养至第11天，紫球藻密度可达每毫升240万个细胞，取上面上浮性较好的藻液600毫升转移至另一个1500毫升的三角烧瓶中(下面的老化的藻液即可通过离心法采收)，补充400毫升步骤1所述的培养液，手动摇匀60秒钟，调节温度为32℃，光照强度15000lux，继续培养，每天手动摇瓶6次，每次30秒钟，连续培养4天后，停止培养，将三角烧瓶从光照培养箱中取出，关闭培养箱电源，将培养液用离心机离心，离心机转速每分钟5400转，离心10分钟，弃上清液，可得粘稠牙膏状藻泥，采收完毕。
步骤2中接种用的紫球藻预先进行提纯(本领域常规方法，只要可实现提纯即可，例如凯氏提取法)，以确保接种时藻种为纯种且处于生长旺盛的指数生长期；
步骤1中各种营养盐要按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；
步骤1中各种无机物营养盐和维生素可预先配成母液且置于4℃冰箱冷藏保存备用，放置时间不要超过45天；
步骤1和2中所用三角烧瓶等玻璃仪器均需洗刷干净放在70℃烘箱中烘干后使用；
步骤2所述接种过程需在无菌操作台上进行；
步骤1中所用化学药品纯度均需化学纯级别。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (1)

1.一种提高紫球藻花生四烯酸含量的方法，其特征在于具体步骤如下：
步骤1)培养液的配制
培养液成分：煮沸冷却后的海水1000份，硝酸钠3份，尿素1份，氯化铵1.5份，磷酸二氢钾1.5份，碳酸氢铵2份，硫酸亚铁0.01份，维生素B10.02份，维生素B120.001份，生物素0.004份，尼克酸0.003份，α-萘乙酸0.001份，硫酸镁0.2份，Na2EDTA 0.002份。取此培养液2000毫升装入一3000毫升的三角烧瓶，保鲜膜和橡皮筋封口，放在摇床上摇匀15分钟，放入4℃冰箱保存备用；
步骤2)接种培养
取一1500毫升的干净三角烧瓶，装入步骤1所述的培养液600毫升，取生长旺盛、无污染、指数生长期的紫球藻接种，接种密度每毫升藻液4万个细胞，放在摇床上摇动10分钟，灭菌消毒的报纸和橡皮筋封口，放进光照培养箱中培养，调节温度至24℃，光照强度3500lux，其中光/暗周期16L/8D，即提供间歇光，16小时光照，8小时黑暗；每天手动摇瓶3次，每次45秒钟；
步骤3)补充营养盐
培养至第6天，添加步骤1)所述的藻液100毫升，以补充营养盐的消耗，并将温度调节至26℃，光照强度5000lux，继续培养，至第7天，再补充步骤1所述培养液100毫升，并将温度调节至27℃，光照强度6000lux，继续培养，至第8天，再补充步骤1所述培养液100毫升，并将温度调节至28℃，光照强度9000lux，继续培养，至第9天，再补充步骤1所述培养液100毫升，并将温度调节至30℃，光照强度12000lux，培养至第10天，再补充步骤1所述培养液100毫升，并将温度调节至31℃，光照强度13000；
步骤4)，采收
培养至第11天，紫球藻密度可达每毫升240万个细胞，将上面上浮性较好的藻液600毫升转移至另一个1500毫升的三角烧瓶中(下面的老化的藻液即可通过离心法采收)，补充400毫升步骤1所述的培养液，手动摇匀60秒钟，调节温度为32℃，光照强度15000lux，继续培养，每天手动摇瓶6次，每次30秒钟，连续培养4天后，停止培养，将三角烧瓶从光照培养箱中取出，关闭培养箱电源，将培养液用离心机离心，离心机转速每分钟5400转，离心10分钟，弃上清液，可得粘稠牙膏状藻泥，采收完毕。
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