CN102851214B - 盐生杜氏藻培养基配方及四级培养技术 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种盐生杜氏藻培养基配方及四级培养技术，配方如下：NH₄NO₃20mg、尿素15mg、KH₂PO₄13.6mg、NaHCO₃ 504mg、柠檬酸铁16.75mg、维生素B₁2×10-4mg、维生素B128×10^-4mg、生物素1×10^-3mg、消毒海水1000mL。实验结果表明，使用优化培养基并采用四级培养方法培养盐生杜氏藻具有生长速度快、产量高、β-胡萝卜素含量高、成本低、易于操作、不易污染的优点。

Description

盐生杜氏藻培养基配方及四级培养技术

技术领域  本发明属于海洋微藻养殖领域，尤其涉及一种盐生杜氏藻培养基配方及四级培养技术。

背景技术

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)是一种双鞭毛单细胞真核生物，可耐高盐度(20-300‰)。杜氏藻在胁迫条件下可大量积累β-胡萝卜素，最高可达干重的8-14％，为自然界所有生物之首，因此早在1966年，Massyuk就提出可大规模培养杜氏藻生产β-胡萝卜素；另外杜氏藻含有的甘油可达干重的40％，具有生产甘油的潜在前途；杜氏藻还是水产养殖动物(对虾、扇贝、鲍鱼等)良好的单细胞蛋白饲料。美国、澳大利亚、以色列、日本等很早就开始了杜氏藻的研究，并已经投入工业化养殖。我国拥有漫长的海岸线(18000Km)和众多的内陆盐湖，具有养殖杜氏藻生产β-胡萝卜素优越的自然条件。本发明给出了盐生杜氏藻培养的最适营养盐配方，可提高杜氏藻产量、促进盐生杜氏藻大量积累β-胡萝卜素并降低养殖成本。氮、磷盐种类、浓度及其比例、温度、光照、盐度等对杜氏藻生长和β-胡萝卜素的合成都有重要影响。氮在细胞代谢中是形成氨基酸、嘌呤、嘧啶、卟啉、氨基糖和胺化合物等的基本元素，因而氮是杜氏藻生长最重要的营养元素。

海水中无机碳的存在形式以HCO₃ ^-为主(90％)，而游离的CO₂不足1％。过去人们一直认为，水体中游离CO₂是藻类利用外源无机碳的唯一形式。张学成的工作表明，螺旋藻培养基中添加50～100mmol/dm³NaHCO₃时，不仅可以满足螺旋藻生长的需要，而且有助于保持藻体生长的pH值。林惠民认为，NaHCO₃在培养基中的作用之一是作为营养的碳源。我的研究结果表明，培养过程的前5天，NaHCO₃含量急剧减少与杜氏藻的快速生长是相吻合的，说明杜氏藻可以利用HCO₃ ^-作为碳源。

目前，盐生杜氏藻规模化培养存在的主要问题是藻细胞生长缓慢、倍增时间长、易污染。合适的培养基是实现盐生杜氏藻高密度培养的重要因素之一。以前使用的培养基没有加入碳酸氢钠和生物素，但大量实验表明，盐生杜氏藻除了能利用空气中游离的CO₂，还能有效地利用培养液中的HCO₃ ^-作为碳源。添加NaHCO₃不仅缩短了盐生杜氏藻的倍增时间，而且延长了盐生杜氏藻的生长时间。我的实验表明，添加504mg/L的NaHCO₃和1×10^-3mg/L的生物素能大大提高生长速度，盐生杜氏藻的产量能提高44％。

总之，使用优化培养基并采用四级培养方法培养盐生杜氏藻具有生长速度快、产量高、β-胡萝卜素含量高、成本低、易于操作、不易污染的优势。

发明内容  为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种盐生杜氏藻培养基配方及制备方法，具体技术方案如下：一种盐生杜氏藻培养基，配方如下：NH₄NO₃20mg、尿素15mg、KH₂PO₄13.6mg、NaHCO₃504mg、柠檬酸铁16.75mg、维生素B₁2×10^-4mg、维生素B₁₂8×10^-4mg、生物素1×10^-3mg、消毒海水1000mL。

一种盐生杜氏藻培养基，其特征在于该盐生杜氏藻培养基配方如下：NH₄NO₃20mg、CO(NH₂)₂(尿素)15mg、KH₂PO₄13.6mg、NaHCO₃504mg、FeC₆H₅O₇·5H₂O(柠檬酸铁)16.75mg、维生素B₁2×10^-4mg、维生素B₁₂8×10^-4mg、VB₆ 0.1mg、生物素1×10^-3mg、ZnSO₄500mg、体积比1％的钼酸水溶液15ml、硫酸锰5mg、磷酸二氢钾10mg、氯化钾3mg以及海水1000mL。

所述的盐生杜氏藻培养基的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)按权利要求1中的培养基配方中的顺序和剂量依次加入培养基；

2)因柠檬酸铁(C₆H₅O₇Fe·5H₂O)较难溶解，可加少量自来水在火炉上微热至80-90℃，并不断搅拌至全部融化；

3)培养基配方中的各种营养盐可先配成浓度较高的母液，再依次添加；

4)营养盐可分两次加入，第一天和第四天各加入总量的1/2；

5)全部营养盐加完后再充分搅拌15分钟，即可接种；一般接种密度为2×10⁴-5×10⁴cell/mL；培养至第四天，按同样的顺序和方法加入另外一半营养盐；一般培养7-9天，藻液密度可达到60×10⁴-100×10⁴ cell/ml；

6)此培养基配方对盐生杜氏藻扩种阶段和大规模培养阶段都适用；

所述的盐生杜氏藻培养基的四级培养方法，其特征在于步骤如下：

第一阶段：三角烧瓶培养；饱和卤水取自内陆盐湖，用蒸馏水稀释至盐度120‰；室内培养；添加上述营养盐；空调控温，25±1℃；日光灯管照明，光强2000-6000lx，光/暗周期为16L/8D；用3000-5000mL三角烧瓶培养，工作体积占瓶体积的3/5，取对数生长期藻种接种；接种密度1.2×10⁴cell/mL-2.0×10⁴cell/mL；每天摇瓶6次；藻细胞密度达70×10⁴cell/mL-90×10⁴cell/mL，转入下一阶段培养；

第二阶段：玻璃瓦缸培养；使用玻璃瓦缸或大塑料盆培养，添加权利要求1所述的培养基配方；饱和卤水取自内陆盐湖，用洁净淡水稀释至盐度120‰；用次氯酸钠消毒海水的方法消毒，消毒方法为每立方米海水中加入含有效氯20毫克/千克的次氯酸钠，如果次氯酸钠的有效氯含量为8％，则每立方米海水加入次氯酸钠250立方厘米；加入次氯酸钠后，充气10分钟，停气，经6-8小时消毒后，按每立方米水体加入25克的量加入硫代硫酸钠，强充气4-6小时，用硫酸-碘化钾-淀粉试液测定无余氯存在即可使用；玻璃瓦缸盛装培养液300-1000斤，接种密度2×10⁴cell/mL-4×10⁴cell/mL，室内培养，光强2000-6000lx，每隔1-2小时用木钯搅动池水一次，使藻细胞上浮；藻细胞密度达75×10⁴cell/mL-100×10⁴cell/mL，转入下一阶段培养。

第三阶段：水泥池培养；池方形较好，混砖结构，内贴瓷砖，面积30-60m²，池深50cm，水深30cm，消毒海水的方法同上，接种密度3×10⁴cell/mL-4×10⁴cell/mL；上面遮以塑料大棚，以遮挡灰尘，冬天和早春提高水温；自然光照射；培养基成分同上，每隔1-2小时用木钯搅动池水一次，使藻细胞上浮；藻细胞密度达70×10⁴cell/mL-90×10⁴cell/mL，转入下一阶段培养。

第四阶段：跑道池培养；环形跑道池，混砖结构，内贴瓷砖，室外培养，自然光照射；消毒海水的方法同上；池面积500-1500m²，池深50cm，水深30cm，水车搅动池水，使藻细胞上浮；但水车转速不宜过快，以免打碎藻细胞；接种密度4×10⁴cell/mL-6×10⁴cell/mL；当藻细胞密度达60×10⁴cell/mL-120×10⁴cell/mL，藻液呈砖红色，说明细胞已大量积累β-胡萝卜素，即可收获；一般采用离心收获，洗去盐分后干燥机干燥成藻粉装袋即可。

有益效果：

实验结果表明，用此培养基配方培养的杜氏藻不仅生物量大，而且β-胡萝卜素含量高，生产成本低，易于操作。

具体实施方式

一种盐生杜氏藻培养基，配方如下：NH₄NO₃20mg、尿素15mg、KH₂PO₄13.6mg、NaHCO₃504mg、柠檬酸铁16.75mg、维生素B₁2×10^-4mg、维生素B₁₂8×10^-4mg、生物素1×10^-3mg、消毒海水1000mL。

一种盐生杜氏藻培养基，其特征在于该盐生杜氏藻培养基配方如下：NH₄NO₃20mg、CO(NH₂)₂(尿素)15mg、KH₂PO₄13.6mg、NaHCO₃504mg、FeC₆H₅O₇·5H₂O(柠檬酸铁)16.75mg、维生素B₁2×10^-4mg、维生素B₁₂8×10^-4mg、VB₆ 0.1mg、生物素1×10^-3mg、ZnSO₄500mg、体积比1％的钼酸水溶液15ml、硫酸锰5mg、磷酸二氢钾10mg、氯化钾3mg以及海水1000mL。

所述的盐生杜氏藻培养基的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)按权利要求1中的培养基配方中的顺序和剂量依次加入培养基；

2)因柠檬酸铁(C₆H₅O₇Fe·5H₂O)较难溶解，可加少量自来水在火炉上微热至80-90℃，并不断搅拌至全部融化；

3)培养基配方中的各种营养盐可先配成浓度较高的母液，再依次添加；

4)营养盐可分两次加入，第一天和第四天各加入总量的1/2；

5)全部营养盐加完后再充分搅拌15分钟，即可接种；一般接种密度为2×10⁴-5×10⁴cell/mL；培养至第四天，按同样的顺序和方法加入另外一半营养盐；一般培养7-9天，藻液密度可达到60×10⁴-100×10⁴cell/ml；

6)此培养基配方对盐生杜氏藻扩种阶段和大规模培养阶段都适用；

所述的盐生杜氏藻培养基的四级培养方法，其特征在于步骤如下：

第一阶段：三角烧瓶培养；饱和卤水取自内陆盐湖，用蒸馏水稀释至盐度120‰；室内培养；添加上述营养盐；空调控温，25±1℃；日光灯管照明，光强2000-6000lx，光/暗周期为16L/8D；用3000-5000mL三角烧瓶培养，工作体积占瓶体积的3/5，取对数生长期藻种接种；接种密度1.2×10⁴cell/mL-2.0×10⁴cell/mL；每天摇瓶6次；藻细胞密度达70×10⁴cell/mL-90×10⁴cell/mL，转入下一阶段培养；

第二阶段：玻璃瓦缸培养；使用玻璃瓦缸或大塑料盆培养，添加权利要求1所述的培养基配方；饱和卤水取自内陆盐湖，用洁净淡水稀释至盐度120‰；用次氯酸钠消毒海水的方法消毒，消毒方法为每立方米海水中加入含有效氯20毫克/千克的次氯酸钠，如果次氯酸钠的有效氯含量为8％，则每立方米海水加入次氯酸钠250立方厘米；加入次氯酸钠后，充气10分钟，停气，经6-8小时消毒后，按每立方米水体加入25克的量加入硫代硫酸钠，强充气4-6小时，用硫酸-碘化钾-淀粉试液测定无余氯存在即可使用；玻璃瓦缸盛装培养液300-1000斤，接种密度2×10⁴cell/mL-4×10⁴cell/mL，室内培养，光强2000-6000lx，每隔1-2小时用木钯搅动池水一次，使藻细胞上浮；藻细胞密度达75×10⁴cell/mL-100×10⁴cell/mL，转入下一阶段培养。

第三阶段：水泥池培养；池方形较好，混砖结构，内贴瓷砖，面积30-60m²，池深50cm，水深30cm，消毒海水的方法同上，接种密度3×10⁴cell/mL-4×10⁴cell/mL；上面遮以塑料大棚，以遮挡灰尘，冬天和早春提高水温；自然光照射；培养基成分同上，每隔1-2小时用木钯搅动池水一次，使藻细胞上浮；藻细胞密度达70×10⁴cell/mL-90×10⁴cell/mL，转入下一阶段培养。

第四阶段：跑道池培养；环形跑道池，混砖结构，内贴瓷砖，室外培养，自然光照射；消毒海水的方法同上；池面积500-1500m²，池深50cm，水深30cm，水车搅动池水，使藻细胞上浮；但水车转速不宜过快，以免打碎藻细胞；接种密度4×10⁴cell/mL-6×10⁴cell/mL；当藻细胞密度达60×10⁴cell/mL-120×10⁴cell/mL，藻液呈砖红色，说明细胞已大量积累β-胡萝卜素，即可收获；一般采用离心收获，洗去盐分后干燥机干燥成藻粉装袋即可。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (1)

1.一种盐生杜氏藻的四级培养方法，其特征在于步骤如下：

配置盐生杜氏藻培养基，该盐生杜氏藻培养基配方如下：NH₄NO₃20mg、CO(NH₂)₂15mg、NaHCO₃504mg、FeC₆H₅O₇·5H₂O16.75mg、维生素B₁2×10^-4mg、维生素B₁₂8×10^-4mg、VB₆0.1mg、生物素1×10^-3mg、ZnSO₄500mg、体积比1％的钼酸水溶液15ml、硫酸锰5mg、磷酸二氢钾13.6mg、氯化钾3mg以及海水1000mL；

所述的盐生杜氏藻培养基的制备方法，步骤如下，

1)按上述的培养基配方中的顺序和剂量依次加入培养基；

2)因柠檬酸铁(C₆H₅O₇Fe·5H₂O)较难溶解，加少量自来水在火炉上微热至80-90℃，并不断搅拌至全部融化；

3)培养基配方中的各种营养盐可先配成浓度较高的母液，再依次添加；

4)营养盐可分两次加入，第一天和第四天各加入总量的1/2；

5)全部营养盐加完后再充分搅拌15分钟，即可接种；一般接种密度为2×10⁴-5×10⁴cell/mL；培养至第四天，按同样的顺序和方法加入另外一半营养盐；一般培养7-9天，藻液密度能达到60×10⁴-100×10⁴cell/ml；

6)此培养基配方对盐生杜氏藻扩种阶段和大规模培养阶段都适用；

盐生杜氏藻的四级培养方法，步骤如下：

第一阶段：三角烧瓶培养；饱和卤水取自内陆盐湖，用蒸馏水稀释至盐度120‰；室内培养；添加上述营养盐；空调控温，25±1℃；日光灯管照明，光强2000-6000lx，光/暗周期为16L/8D；用3000-5000mL三角烧瓶培养，工作体积占瓶体积的3/5，取对数生长期藻种接种；接种密度1.2×10⁴cell/mL-2.0×10⁴cell/mL；每天摇瓶6次；藻细胞密度达70×10⁴cell/mL-90×10⁴cell/mL，转入下一阶段培养；

第二阶段：玻璃瓦缸培养；使用玻璃瓦缸或大塑料盆培养，添加所述的培养基配方；饱和卤水取自内陆盐湖，用洁净淡水稀释至盐度120‰；用次氯酸钠消毒海水的方法消毒，消毒方法为每立方米海水中加入含有效氯20毫克/千克的次氯酸钠，如果次氯酸钠的有效氯含量为8％，则每立方米海水加入次氯酸钠250立方厘米；加入次氯酸钠后，充气10分钟，停气，经6-8小时消毒后，按每立方米水体加入25克的量加入硫代硫酸钠，强充气4-6小时，用硫酸-碘化钾-淀粉试液测定无余氯存在即可使用；玻璃瓦缸盛装培养液300-1000斤，接种密度2×10⁴cell/mL-4×10⁴cell/mL，室内培养，光强2000-6000lx，每隔1-2小时用木钯搅动池水一次，使藻细胞上浮；藻细胞密度达75×10⁴cell/mL-100×10⁴cell/mL，转入下一阶段培养；

第三阶段：水泥池培养；池方形较好，混砖结构，内贴瓷砖，面积30-60m²，池深50cm，水深30cm，消毒海水的方法同上，接种密度3×10⁴cell/mL-4×10⁴cell/mL；上面遮以塑料大棚，以遮挡灰尘，冬天和早春提高水温；自然光照射；培养基成分同上，每隔1-2小时用木钯搅动池水一次，使藻细胞上浮；藻细胞密度达70×10⁴cell/mL-90×10⁴cell/mL，转入下一阶段培养；

第四阶段：跑道池培养；环形跑道池，混砖结构，内贴瓷砖，室外培养，自然光照射；消毒海水的方法同上；池面积500-1500m²，池深50cm，水深30cm，水车搅动池水，使藻细胞上浮；但水车转速不宜过快，以免打碎藻细胞；接种密度4×10⁴cell/mL-6×10⁴cell/mL；当藻细胞密度达60×10⁴cell/mL-120×10⁴cell/mL，藻液呈砖红色，说明细胞已大量积累β-胡萝卜素，即可收获；一般采用离心收获，洗去盐分后干燥机干燥成藻粉装袋即可。