CN110669796B - 一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种发酵培养基，特别涉及发酵生产长链二元酸用的发酵培养基，本发明还涉及发酵生产长链二元酸的方法。一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，包括：碳源；氮源；无机盐；微量金属元素源；生长因子；所述氮源是碳酸氢铵和尿素中的一种或两种；优选地，所述氮源的浓度为0.5～5g/L。本发明解决了发酵生产长链二元酸的污水处理成本高的技术问题。

Description

一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基及其应用
技术领域
本发明涉及一种发酵培养基，特别涉及发酵生产长链二元酸用的发酵培养基，本发明还涉及发酵生产长链二元酸的方法。
背景技术
长链二元酸有着非常广泛的用途，以长链二元酸为原料可以合成特种尼龙、高级香料、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级防锈剂、高级油漆和涂料等。长链二元酸通常可以用化学法或生物法来合成。化学法合成路线长，反应需要高温高压，对催化剂要求比较苛刻，因此在工业规模上的长链二元酸品种较少，只有十二碳长链二元酸等少数品种。而生物法是以长链烷烃为底物，通过微生物发酵转化得到，利用微生物双末端氧化的特殊功能发酵正构烷烃制取长链二元酸。生物法生产长链二元酸的一重要优点在于可以使用相同的微生物、相同设备、培养基，通过提供不同底物的方案生产各种不同碳链长度的长链二元酸，而化学合成法仅能生产单一二元酸。
发酵培养基的原料成本是发酵法生产长链二元酸的一重要成本。美国专利US6004784中公开了一种半合成发酵培养基，使用玉米浆和酿造酵母提取物以便降低含有昂贵、高标准化酵母提取物的常规发酵培养基的成本。然而玉米浆和酵母提取物中含有的颗粒物质使得培养基灭菌很难彻底，导致发酵染菌概率增加。另外这些玉米浆和酵母提取物有机氮源成分复杂不明，含有许多不可代谢的可产生颜色的成分，且成分批次间稳定性困难。专利EP1220939B1中公开了一种合成培养基，该培养基利用无机氮源替代玉米浆、酵母提取物等有机氮源，但其使用的无机氮源是硫酸铵，硫酸根离子进入发酵体系，二元酸产物提取出来后，硫酸根离子进入污水处理系统很难除去，大幅增加污水处理成本，不除去会造成环境污染。
公开号CN1394232A、公开日2003年1月29日的中国发明专利申请公开了一种发酵培养基，它含有：(a)可代谢的碳源和能源；(b)无机氮源；(c)磷酸盐源；(d)至少一种选自碱金属、碱土金属、过渡金属及其混合物组成的组的金属；和(e)基本上不含颗粒物质和细菌的生物素；该发明的发酵培养基满足了微生物生长的基本营养物需求，同时将需要应作为废物处理和产生工艺气味散发而需要从产物分离的有机和无机成分的添加量减少到最低程度，该发明的的培养基不含颗粒物质，特别适合于在自动培养基制备工艺中的连续灭菌且非常低廉。
另一方面，现有技术中也有报道用尿素或碳酸氢铵作为培养基的单一氮源，但都不是用于发酵生产长链二元酸。如公开号CN101492644A、公开日2009年7月29日的中国发明专利申请，公开了一种生物合成15N标记螺旋藻的培养基，所述培养基中含有碳源、氮源、磷源、无机盐及微量元素，并且15N尿素为氮源，以葡萄糖和碳酸氢钠为碳源。该发明是为了获得高丰度的15N标记螺旋藻。
又如申请公布号CN103243135A，申请公布日2013.08.14的中国发明专利申请一种发酵生产普鲁兰多糖的新培养基及生产工艺，培养基配方如下：碳源为蔗糖，蔗糖浓度为60-120g/L，氮源为尿素，尿素浓度为2-4g/L；无机盐为K2HPO4，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，NaCl：2-4g/L，K2HPO4浓度为3-10g/L，MgSO4·7H2O浓度为0.3-0.5g/L，FeSO4·7H2O浓度为25-100mg/L，pH6-7。该发明所用培养基成分明确，发酵后产物成分简单，降低了后续的提取生产成本。
如申请公布号CN103911298A、申请公布日2014.02.09的中国发明专利申请公开了一种培养基组合物，该培养基组合物含有氮源，其特征在于，所述氮源含有尿素和/或氨基酸，以氮元素计，尿素和/或氨基酸占氮源总含量的80重量％以上，以培养基组合物的总重量为基准，以氮元素计，所述氮源的总含量为0.02-15重量％。该培养基可以实现对酿酒酵母不同菌株同时进行活菌计数。
吴桂秀等研究了不同氮源及其浓度对标志链带藻合成淀粉和油脂的影响(吴桂秀等，微生物学报,2016,56(7))，证明了碳酸氢铵可以作为单一氮源培养标志链带藻合成淀粉和油脂。
综上所述，现有技术没有提出以碳酸氢铵或尿素作为单一氮源发酵生产长链二元酸。
发明内容
本发明的第一方面目的在于提供一种发酵培养基，以解决发酵生产长链二元酸的污水处理成本高的技术问题。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题，达到本发明的第一方面发明目的。
一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，包括：
碳源；
氮源；
无机盐；
微量金属元素源；
生长因子；
所述氮源是碳酸氢铵和尿素中的一种或两种；优选地，所述氮源的浓度为0.5～5g/L。
本发明的技术方案，以碳酸氢铵和尿素中的一种或两种作为氮源，不带入硫酸根，解决发酵生产长链二元酸的污水处理成本高的技术问题。本发明以碳酸氢铵和尿素作为氮源，与其他培养基成分协同，使发酵培养基能够满足微生物的需要，同时不引起发酵体系的pH的剧烈波动，保证发酵体系的平衡，保证产酸量。本发明中，所述氮源的浓度可以为：0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L。
进一步，所述碳源浓度为10～50g/L；优选地，所述碳源包括或者是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、甲醇、乙醇中的一种或多种；更优选地，所述碳源包括或者是葡萄糖、蔗糖的一种或两种的混合。本发明中，所述氮源的浓度可以为：10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述无机盐，浓度1～5g/L；优选地，所述无机盐包括或者是盐酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种；更优选地，包括或者是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠和硝酸钾中的一种或多种。本发明中，所述无机盐的浓度可以为：1g/L、2g/L、3g/L、3g/L、3g/L、5g/L。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述微量元素源包括或者是钾、钙、镁、铁、铜、锌、锰的盐酸盐和硝酸盐中的一种或多种；优选地，每种所述微量金属元素源浓度各为0.1～50ppm；。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述生长因子包括或者是氨基酸、柠檬酸和维生素中的一种或多种；优选地，所述生长因子包括或者是柠檬酸和生物素；更优选地，每种所述生长因子浓度各为0.01～1ppm。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述长链二元酸为C9-C18的直链饱和二元酸中的一种或多种；优选地，所述长链二元酸为C11～C16的直链饱和二元酸中的一种；更优选地，所述长链二元酸为C11、C12、C13、C14、C15或C16的直链饱和二元酸。
本发明的第二方面目的在于提出一种生产长链二元酸的发酵方法，以解决目前技术问题。
一种生产长链二元酸的发酵方法，包括通过热带假丝酵母(Candida tropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)利用发酵培养基发酵，将底物转化为所述长链二元酸，所述发酵培养基是如上文任一技术方案所述的用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基。
进一步，所述底物为C9～C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选地，所述底物为C11～C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种；更优选地，所述底物为C11、C12、C13、C15、C14或C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述发酵方法包括以下步骤：
A)菌种活化；
B)利用种子培养基在种子罐中制备种子液；
C)将所述种子液接种到含有所述发酵培养基的发酵罐中发酵；接种量相对发酵起始体积为10％～30％(v/v)，发酵起始添加相对所述发酵起始体积0～10％(v/v)的所述底物，发酵过程控制温度28～32℃，通风量为0.3～0.7vvm，罐压为0.05～0.14MPa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧大于等于10％；补加10％～40％(w/v)的NaOH溶液控制发酵液的pH值；发酵起始控制pH为3.5～6.5，随着菌体的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH大于等于3.0，发酵转化期控制pH为5.0～8.5；在发酵周期为10～20小时时开始分5～8批次加入所述底物，控制发酵液中所述底物含量小于等于10％(v/v)，所述底物的总添加量相对发酵起始体积为20％～50％(v/v)，总发酵周期为100～180小时；所述罐压为表压。
又进一步，所述步骤A)菌种活化包括以下步骤：取热带假丝酵母或清酒假丝酵母甘油菌于装有100mL YPD培养基的摇瓶中，摇床培养，转速200～250rpm，振幅40mm～50mm，培养温度28～30℃，培养24-48h，所述YPD培养基包括：蛋白胨10g/kg，酵母膏5g/kg，葡萄糖10g/kg，pH自然。
又进一步，所述步骤B)中所述种子培养基为5～6L；所述步骤B)中所述种子罐的参数是：培养温度28～30℃，搅拌转速400～500rpm，通风比0.3～0.6，罐压为0.08～0.1MPa，培养时间12～36h，种子成熟指标为稀释30倍后OD620为0.5～1.0；所述罐压为表压。
又进一步，所述步骤B)中所述种子培养基是水溶液培养基；优选地，所述种子培养基包含如下成分：蔗糖10～30g/L、玉米浆1.5～10g/L、酵母提取液1～10g/L、磷酸二氢钾4～12g/L、尿素0.5～5g/L、所述底物0～30ml/L。
本发明还提出了一种长链二元酸发酵液，其特征在于，所述长链二元酸发酵液中的硫酸根离子浓度低于160mg/L，优选地，低于100mg/L，更优选地低于50mg/L。
本发明提供一种生产长链二元酸的培养基及利用该培养基发酵生产长链二元酸的方法。本发明利用一种以碳酸氢铵和/或尿素为无机氮源的合成培养基发酵生产长链二元酸，所用培养基成分简单稳定，碳酸氢铵和/或尿素作为氮源发酵后合成菌体细胞，生成CO2，不引入不可降解离子进入污水系统，环境友好，节约生产成本。
具体实施方式
一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，包括
碳源；所述碳源浓度为10～50g/L；优选地，所述碳源包括或者是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、甲醇、乙醇中的一种或多种；更优选地，所述碳源包括或者是葡萄糖、蔗糖的一种或两种的混合；
氮源；所述氮源包括或者是碳酸氢铵或尿素中的一种或两种；优选地，所述氮源的浓度为0.5～5g/L；
无机盐；所述无机盐，浓度1～5g/L；优选地，所述无机盐包括或者是盐酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种；更优选地，包括或者是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠和硝酸钾中的一种或多种。
微量金属元素源；所述微量金属元素源包括或者是钾、钙、镁、铁、铜、锌、锰的盐酸盐和硝酸盐中的一种或多种；每种所述微量金属元素源浓度各为0.1～50ppm；
生长因子；所述生长因子包括或者是氨基酸、柠檬酸、维生素中的一种或多种；优选地，所述生长因子包括或者是柠檬酸和生物素。更优选地，每种所述生长因子浓度各为0.01～1ppm。
一种生产长链二元酸的发酵方法，包括通过热带假丝酵母或清酒假丝酵母利用发酵培养基发酵，将底物转化为所述长链二元酸，所述发酵培养基是如上文任一技术方案所述的用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基；所述底物为C9～C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种；优选地，所述底物为C11～C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种；更优选地，所述底物为C11、C12、C13、C14、C15或C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种；所述发酵方法包括以下步骤：
A)菌种活化：取热带假丝酵母甘油菌或清酒假丝酵母甘油菌于装有100mL YPD培养基(蛋白胨10g/kg，酵母膏5g/kg，葡萄糖10g/kg，pH自然)的摇瓶中，摇床培养，转速200～250rpm，培养温度28～30℃，培养24-48h；
B)利用种子培养基在种子罐中制备种子液；取上述摇瓶种子全部接入5-6L种子培养基，所述种子罐的参数是：培养温度28～30℃，搅拌转速400～500rpm，通风比0.3～0.6，罐压为0.08～0.1MPa，培养时间12～36h，种子成熟指标为稀释30倍后OD620为0.5～1.0；所述罐压为表压；所述种子培养基是水溶液培养基；优选地，所述种子培养基包含如下成分：蔗糖10～30g/L、玉米浆1.5～10g/L、酵母提取液1～10g/L、磷酸二氢钾4～12g/L、尿素0.5～5g/L、所述底物0～30ml/L；
C)将所述种子液接种到含有所述发酵培养基的发酵罐中发酵；接种量相对发酵起始体积为10％～30％(v/v)，发酵起始添加相对所述发酵起始体积0～10％(v/v)的所述底物，发酵过程控制温度28～32℃，通风量为0.3～0.7vvm，罐压为0.05～0.14MPa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧大于等于10％；补加10％～40％(w/v)的NaOH溶液控制发酵液的pH值；生长期控制pH为3.5～6.5，发酵转化期控制pH5.0～8.0；在发酵周期为10～20小时时开始分5-8批次加入所述底物，控制发酵液中所述底物含量小于等于10％(v/v)，所述底物的总添加量相对发酵起始体积为20％～50％(v/v)，总发酵周期为100～180小时；所述罐压为表压。以下实施例中的种子液的制备方法如下：取热带假丝酵母CAT N1459(其保藏号为CCTCC M2011192，它具备的生物学和遗传学特点如公开号为CN102839133A、公开日为2012-12-26的中国发明专利申请所述)甘油菌于装有100mL YPD培养基(蛋白胨10g/kg，酵母膏5g/kg，葡萄糖10g/kg，pH自然)的摇瓶中，摇床培养(转速200rpm，振幅40mm)，培养温度29℃，培养24h。取上述摇瓶种子接入6L种子培养基(蔗糖20g/L、玉米浆3g/L<总氮含量2.5wt％，下同>、酵母提取液5g/L<购自英格兰OXOID LTD.>、磷酸二氢钾8g/L、尿素3g/L)，所述种子罐的参数是：培养温度29℃，搅拌转速500rpm，通风比0.4，罐压为0.1MPa，培养时间22h，种子成熟指标为稀释30倍后OD620为0.5以上；。
本发明得到的长链二元酸发酵液中的硫酸根离子浓度低于160mg/L，优选地，低于100mg/L，更优选地低于50mg/L。
实施例1
将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的10L发酵罐中，发酵培养基：葡萄糖40g/L，碳酸氢铵2g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化钙2ppm，柠檬酸0.1ppm，接种量10％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加10％(v/v，相对发酵起始体积)的C12正烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.3vvm，罐压(表压)约为0.05MPa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧大于等于10％。补加浓度为20％(w/v，即相当于200g/L)的NaOH溶液控制发酵液的pH值；发酵起始控制pH为5.0，随着菌体的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH大于等于3.0，发酵转化期pH控制为6.0。在发酵周期为20小时开始分5批次加入C12正烷烃，控制发酵液中C12正烷烃含量小于等于10％(v/v)，底物的总添加量相对发酵起始体积为35％(v/v)，总发酵周期约为120小时。产生十二碳二元酸180g/L，发酵烷烃质量转化率98％,发酵液硫酸根离子浓度35mg/L，在国家允许的自来水中的硫酸根离子浓度范围内(国标要求不高于250mg/L)。
实施例2
将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的10L发酵罐中，发酵培养基：葡萄糖50g/L，碳酸氢铵5g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钙50ppm，柠檬酸0.01ppm，生物素0.01ppm，接种量30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始不添加C11正烷烃，发酵过程控制温度30℃，通风量约为0.5vvm，罐压(表压)约为0.08MPa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧大于等于10％。补加浓度为40％(w/v)的NaOH溶液控制发酵液的pH值；发酵起始控制pH为6.5，随着菌体的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH大于等于3.0，发酵中后期转化控制pH为7.5。在发酵周期为20小时时开始分6批次加入C11正烷烃，控制发酵液中C11正烷烃含量小于等于10％，总发酵周期约为100小时。产生十一碳二元酸110g/L，底物的总添加量相对发酵起始体积为20％(v/v)，发酵烷烃质量转化率88％，发酵液硫酸根离子浓度41mg/L，在国家允许的自来水中的硫酸根离子浓度范围内(国标要求不高于250mg/L)。
实施例3
将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的10L发酵罐中，发酵培养基：葡萄糖30g/L，碳酸氢铵0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，柠檬酸0.1ppm，生物素0.02ppm，接种量20％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加2％(v/v，相对发酵起始体积)的C13正烷烃，发酵过程控制温度29℃，通风量约为0.6vvm，罐压(表压)约为0.1MPa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧大于等于10％。补加浓度为40％(w/v)的NaOH溶液控制发酵液的pH值；发酵起始控制pH为3.5，随着菌体生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH大于等于3.0，发酵中后期转化控制pH为7.8。在发酵周期为18小时时开始分7批次加入C13正烷烃，控制发酵液中C13正烷烃含量小于等于10％，底物的总添加量相对发酵起始体积为30％(v/v)，总发酵周期约为140小时。产生十三碳二元酸160g/L，发酵烷烃质量转化率95％，发酵液硫酸根离子浓度52mg/L，在国家允许的自来水中的硫酸根离子浓度范围内(国标要求不高于250mg/L)。
实施例4
将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的10L发酵罐中，发酵培养基：葡萄糖30g/L，尿素5g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化铁1ppm，柠檬酸1ppm，生物素0.01ppm，接种量20％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加3％(v/v，相对发酵起始体积)的C14正烷烃，发酵过程控制温度31℃，通风量约为0.4vvm，罐压(表压)约为0.1MPa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧大于等于10％。补加浓度为40％(w/v)的NaOH溶液控制发酵液的pH值；发酵起始控制pH为4.5，随着菌体的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH大于等于3.0，发酵中后期转化控制pH为7.3。在发酵周期为18小时时开始分8批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量小于等于10％，底物的总添加量相对发酵起始体积为40％(v/v)，总发酵周期约为130小时。产生十四碳二元酸190g/L，发酵烷烃质量转化率92％，发酵液硫酸根离子浓度67mg/L，在国家允许的自来水中的硫酸根离子浓度范围内(国标要求不高于250mg/L)。
实施例5
将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的10L发酵罐中，发酵培养基：葡萄糖30g/L，尿素0.5g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化铁1ppm，柠檬酸1ppm，生物素0.01ppm，接种量20％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加3％(v/v，相对发酵起始体积)的C16正烷烃，发酵过程控制温度32℃，通风量约为0.7vvm，罐压(表压)约为0.14MPa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧大于等于10％。补加浓度为40％(w/v)的NaOH溶液控制发酵液的pH值；发酵起始控制pH为5.5，随着菌体的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH大于等于3.0，发酵转化期控制pH为8.5。在发酵周期为18小时时开始分5批次加入C16正烷烃，控制发酵液中C16正烷烃含量小于等于10％，底物的总添加量相对发酵起始体积为33％(v/v)，总发酵周期约为130小时。产生十六碳二元酸130g/L，发酵烷烃质量转化率80％，发酵液硫酸根离子浓度53mg/L，在国家允许的自来水中的硫酸根离子浓度范围内(国标要求不高于250mg/L)。
实施例6
将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的10L发酵罐中，发酵培养基：葡萄糖10g/L，尿素2g/L，磷酸二氢钾钾3g/L，氯化钙2ppm，柠檬酸0.1ppm，接种量10％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加3％(v/v，相对发酵起始体积)的C12烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.3vvm，罐压(表压)约为0.08MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧大于等于10％。控制发酵液的pH值；发酵起始菌体生长pH 5.0，随着菌体的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，发酵转化期控制pH为7.2。在发酵周期为10小时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％，底物的总添加量相对发酵起始体积为50％(v/v)，总发酵周期约为180小时。产生十二碳二元酸220g/L，发酵烷烃质量转化率98％，发酵液硫酸根离子浓度45mg/L，在国家允许的自来水中的硫酸根离子浓度范围内(国标要求不高于250mg/L)。
对比例1
将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的10L发酵罐中，发酵培养基：葡萄糖40g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化钙2ppm，柠檬酸0.1ppm，接种量10％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加10％(v/v，相对发酵起始体积)的C12正烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.3vvm，罐压(表压)约为0.05MPa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧大于等于10％。补加浓度为20％(w/v，即相当于200g/L)的NaOH溶液控制发酵液的pH值；发酵起始控制pH为5.0，随着菌体的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH大于等于3.0，发酵转化期pH控制为7.0。在发酵周期为20小时开始分5批次加入C12正烷烃，控制发酵液中C12正烷烃含量小于等于10％(v/v)，底物的总添加量相对发酵起始体积为35％(v/v)，总发酵周期约为121小时。产生十二碳二元酸179g/L，发酵烷烃质量转化率97％，发酵液硫酸根离子浓度1g/L。
本发明中，测定培养液中的二元酸浓度，可以采用本领域技术人员熟知的技术，例如中国专利ZL 95117436.3公开的测定方法。具体来说，用盐酸溶液调节发酵液的pH到3.0，然后加100mL乙醚用于萃取发酵液中的二元酸，再采用蒸发以去除乙醚，得到二元酸粉末；将得到的二元酸粉末溶解在乙醇中，并用0.1mol/L的NaOH溶液滴定，最终得到发酵液中的二元酸滴定量。
本发明提供一种生产长链二元酸的培养基及利用该培养基发酵生产长链二元酸的方法。本发明利用一种以碳酸氢铵和或为无机氮源的合成培养基发酵生产长链二元酸，所用培养基成分简单稳定，碳酸氢铵和或尿素作为氮源发酵后合成菌体细胞，生成CO2，不引入不可降解离子进入污水系统，环境友好，节约生产成本。与公开号CN1394232A、公开日2003年1月29日的中国发明专利申请相比，本发明的二元酸产量大幅增加。

Claims (23)

1.一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，所述培养基中不包括硫酸根离子，所述培养基包括：
碳源；
氮源；
无机盐；
微量金属元素源，包括钾、钙、镁、铁、铜、锌、锰的盐酸盐和硝酸盐中的一种或多种；
生长因子，包括氨基酸、柠檬酸和维生素中的一种或多种；
其特征在于，所述氮源是碳酸氢铵或碳酸氢铵和尿素的组合，所述氮源的浓度为0.5～5g/L；所述发酵培养基用于热带假丝酵母(Candida tropicalis)或清酒假丝酵母(Candidasake)的发酵。
2.如权利要求1所述的一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，其中，所述碳源浓度为10～50g/L。
3.如权利要求2所述的一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，其中，所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、甲醇、乙醇中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，其中，所述碳源包括葡萄糖、蔗糖的一种或两种的混合。
5.如权利要求1所述的一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，其中，所述无机盐浓度分别为1～5g/L。
6.如权利要求5所述的一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，其中，所述无机盐包括盐酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种。
7.如权利要求6所述的一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，其中，所述无机盐包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠和硝酸钾中的一种或多种。
8.如权利要求1所述的一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，其中，每种微量金属元素源浓度各为0.1～50ppm。
9.如权利要求1所述的一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，其中，所述生长因子包括柠檬酸和生物素。
10.如权利要求1所述的一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，其中，每种所述生长因子浓度各为0.01～1ppm。
11.如权利要求1-10任一项所述的一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，其中，所述长链二元酸为C9-C18的直链饱和二元酸中的一种或多种。
12.如权利要求11任一项所述的一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，其中，所述长链二元酸为C11～C16的直链饱和二元酸中的一种。
13.如权利要求12任一项所述的一种用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基，其中，所述长链二元酸为C11、C12、C13、C14、C15或C16的直链饱和二元酸。
14.一种发酵生产长链二元酸的方法，包括通过热带假丝酵母(Candida tropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)利用发酵培养基发酵，将底物转化为所述长链二元酸，其特征在于：所述发酵培养基是如权利要求1-13任一项所述的用于发酵生产长链二元酸的发酵培养基。
15.如权利要求14所述的发酵生产长链二元酸的方法，其中，所述底物为C9～C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种。
16.如权利要求15所述的发酵生产长链二元酸的方法，其中，所述底物为C11～C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种。
17.如权利要求16所述的发酵生产长链二元酸的方法，其中，所述底物为C11、C12、C13、C14、C15、C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种。
18.如权利要求15-17中任一项所述的发酵生产长链二元酸的方法，其中，包括以下步骤：
A)菌种活化；所述菌种活化包括以下步骤：取热带假丝酵母或清酒假丝酵母甘油菌于装有YPD培养基的摇瓶中，摇床培养，转速200～250rpm，培养温度28～30℃，培养24-48h；
B)利用种子培养基在种子罐中制备种子液；
C)将所述种子液接种到含有所述发酵培养基的发酵罐中发酵；接种量相对发酵起始体积为10％～30％(v/v)，发酵起始添加相对所述发酵起始体积0～10％(v/v)的所述底物，发酵过程控制温度28～32℃，通风量为0.3～0.7vvm，罐压为0.05～0.14MPa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧大于等于10％；补加10％～40％(w/v)的NaOH溶液控制发酵液的pH值；发酵起始控制pH为3.5～6.5，随着菌体的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH大于等于3.0，发酵中后期转化控制pH为5.0～8.5；在发酵周期为10～20小时时开始分5～8批次加入所述底物，控制发酵液中所述底物含量小于等于10％(v/v)，所述底物的总添加量相对发酵起始体积为20％～50％(v/v)，总发酵周期为100～180小时；所述罐压为表压。
19.如权利要求18所述的发酵生产长链二元酸的方法，其中，所述步骤B)中所述种子培养基为5～6L；所述步骤B)中所述种子罐的参数是：培养温度28～30℃，搅拌转速400～500rpm，通风比0.3～0.6，罐压为0.08～0.1MPa，培养时间12～36h，种子成熟指标为稀释30倍后OD620为0.5～1.0；所述罐压为表压；所述种子培养基是水溶液培养基。
20.如权利要求19所述的发酵生产长链二元酸的方法，其中，所述种子培养基包含如下成分：蔗糖10～30g/L、玉米浆1.5～10g/L、酵母提取液1～10g/L、磷酸二氢钾4～12g/L、尿素0.5～5g/L、所述底物0～30ml/L。
21.如权利要求14所述的发酵生产长链二元酸的方法，其中，所得到的长链二元酸发酵液中的硫酸根离子浓度低于160mg/L。
22.如权利要求21所述的发酵生产长链二元酸的方法，其中，所得到的长链二元酸发酵液中的硫酸根离子浓度低于100mg/L。
23.如权利要求22所述的发酵生产长链二元酸的方法，其中，所得到的长链二元酸发酵液中的硫酸根离子浓度低于50mg/L。
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