CN105647981A - 一种通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法及其应用,包括菌种活化、种子培养和厌氧发酵步骤,所述厌氧发酵采用电化学发酵,在发酵培养基中添加电子载体,所述电子载体的浓度为0.1-1.0?mmol/L。所述电化学发酵中,阳极电解液为磷酸盐缓冲液或者铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液,所述阳极电解液的pH为6-7,浓度为0.1-1.0?mol/L。本发明将生物电化学系统(燃料电池系统)引入微生物发酵体系中,用于平衡及调控胞内辅酶平衡,包括降低胞内还原力水平,平衡还原型底物甘油的消耗及细胞的生长,在此基础之上获得生物电能并增加还原型产物的合成。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法及其应用,属于生物化工技术领域。
背景技术
在还原型产物合成过程中,当以葡萄糖为唯一碳源时,葡萄糖经糖酵解途径进行代谢时产生2分子还原力(NADH),用于强还原型产物合成的还原力会明显不足,产物收率降低;而当以甘油为碳源时,甘油经代谢会产生2分子还原力(NADH),在此基础之上,菌株生长时也会合成一部分NADH,此时,若合成产物的还原性较低,菌体内会积累NADH,此时过剩的还原力会抑制微生物菌体的生长。
为了平衡胞内辅酶代谢,恢复菌体生长的同时保证还原型产物的合成,ClaireVieille等通过引入异源还原性途径增加NADH的消耗,同时一些研究过程中采用微厌氧条件发酵,恢复了产琥珀酸放线杆菌利用甘油代谢生长的能力。但是,微厌氧条件难以控制,与此同时引入异源代谢途径会增加菌体代谢负担,经改造的菌株甘油消耗量也只有10g/L左右,相比以葡萄糖为碳源时,细胞生物量也明显降低。
在燃料电池电化学系统中,菌体通过代谢消耗培养基中的有机物质,碳源或氮源,代谢过程中产生的电子可以通过某种机制运送到胞外,并进一步传到阳极电极,通过外电路最终传递至阴极。在此过程中,代谢底物作为电子供体,阳极电极作为电子受体,形成一个完整的电子传递链,用于促进胞内代谢、底物利用及电能的产生,如AlfredM.Spormann等通过电化学系统强化了二氧化碳的利用并加快了电能的产生。
但是,不同的代谢物所需的还原力并不相同,因此所需的电化学调控手段也会存在一定的差异。其中,电子传递效率与调控手段的不同有着直接的关系。一般情况下,电化学活性菌株(如希瓦氏菌)可以合成导电附属结构(纳米导线)或向胞外分泌电子载体(核黄素)以增加电子的传递效率。但是,对于非电化学活性菌株而言,外源电子载体的添加对于电子在胞内及胞外传递过程中起着决定性作用。由于不同的电子载体本身具有的独特的电化学特性,即使是同一电子载体,在不同浓度条件下对细胞生长及电子的传递作用也并不一致。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法及其应用,将生物电化学系统(燃料电池系统)引入微生物发酵体系中,用于平衡及调控胞内辅酶平衡,包括降低胞内还原力水平,平衡还原型底物甘油的消耗及细胞的生长,在此基础之上获得生物电能并增加还原型产物的合成。
为了实现本发明的技术目的,本发明采用的技术方案如下:
一种通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法,包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵,所述厌氧发酵采用电化学发酵,在发酵培养基中添加电子载体,所述电子载体的浓度为0.1-1.0mmol/L,发酵培养基中甘油浓度为10~40g/L。
所述菌株为任意可在厌氧条件下生长并可发酵积累还原型产物的菌株,包括但不限于产琥珀酸放线(Actinobacillussuccinogenes)。
所述电化学发酵中,选用石墨碳毡作为阴阳两极电极,Ag/AgCl(饱和KCl)作为参比电极,发酵培养基和磷酸盐缓冲液(或铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液)分别作为阴极和阳极电解液,并通过电子载体介导电子由微生物胞内向电极的传递。
所述电子载体为具有氧化还原对特性的化合物,可以为化学型电子载体,也可以选择可生物型电子载体,包括但不限于中性红、甲基紫精、硫堇和核黄素。
所述电化学发酵中阳极电解液为磷酸盐缓冲液,磷酸盐缓冲液pH6-7,浓度0.1-1.0mol/L,添加氯化钠(0.1-1.0mol/L)以增加电解液的导电率;
电化学发酵中阳极电解液还可以为铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液,将等量铁氰化钾及亚铁氰化钾混合,调pH6-7,浓度控制在0.1-1.0mol/L。
电化学发酵时,阴极室内填充的发酵培养基中包含不同浓度的电子载体,并通过外电阻将阴阳两极室联通。当电子载体为中性红或核黄素时,浓度为0.1-1.0mmol/L;当电子载体为甲基紫精或硫堇时,浓度为0.1-0.5mmol/L。更优选地,中性红1mM核黄素1mM甲基紫精0.5mmol/L硫堇0.5mmol/L。
所述电化学系统为采用气密性良好的微生物电解池装置,通过外加电子载体的协助,将胞内代谢产生的过剩电子从胞内传递至胞外,进而传递至阳极电极以产生电流,在利用强还原型底物的同时降低胞内还原力以恢复(促进)菌株的生长。所述菌株为产琥珀酸放线杆菌,厌氧条件下于电化学装置中发酵时,可以以高还原型底物甘油为碳源进行代谢并合成还原性产物。
所述阳极磷酸盐缓冲液中添加氯化钠以增加电解液的导电率,优选为pH7.0,浓度0.1-1.0mol/L。
所述发酵培养基既可以为复合培养基,也可以是合成培养基。
复合发酵培养基为玉米浆干粉5-10g/L,酵母粉5-15g/L,乙酸钠1.0-2.0g/L,NaCl0.5-2.0g/L,CaCl20.1-0.5g/L,MgCl20.1-0.5g/L,NaH2PO41.0-2.0g/L,Na2HPO40.1-0.5g/L,K2HPO41.0-5.0g/L,碳源甘油,甘油浓度为10~40g/L;优选为甘油10g/L,玉米浆干粉7.5g/L,酵母粉10g/L,乙酸钠1.36g/L,NaCl1g/L,CaCl20.2g/L,MgCl20.2g/L,NaH2PO41.6g/L,Na2HPO40.3g/L,K2HPO43g/L。
合成发酵培养基为CH3COONa1.0-2.0g/L,NaCl0.5-2.0g/L,MgCl20.1-1.0g/L,CaCl20.1-1.0g/L,Na2HPO40.1-1.0g/L,NaH2PO41.0-3.0g/L,K2HPO41.0-5.0g/L,NH4HCO31.0-2.0g/L,甘油10~40g/L,生物素0.01g/L,烟酸0.025g/L,蛋氨酸0.11g/L;优选为甘油10g/L,生物素0.01g/L,烟酸0.025g/L,蛋氨酸0.11g/L,CH3COONa1.36g/L,NaCl1g/L,MgCl20.2g/L,CaCl20.2g/L,Na2HPO40.31g/L,NaH2PO41.6g/L,K2HPO43g/L,NH4HCO31.57g/L。
本发明所述的菌种活化、种子培养步骤是常规的放线杆菌菌种活化方法及种子培养方法,以产琥珀酸放线杆菌NJ113(ActinobacillussuccinogenesNJ113)为例说明菌种活化及种子培养步骤:产琥珀酸放线杆菌NJ113(ActinobacillussuccinogenesNJ113)菌株经固体平板培养基活化后,37℃条件下,在厌氧血清瓶中培养12-14小时后转接于种子培养基,在37℃,200转/分钟的条件下培养6-8小时得到种子液;
将所述种子液按照6%(v/v)的接种量接种于含有所述发酵培养基的H-Cell电化学反应器中,同时添加不同浓度的电子载体。
优选地,所述固体平板培养基和种子培养基的配方为:葡萄糖20g/L,玉米浆干粉7.5g/L,酵母粉10g/L,乙酸钠1.36g/L,NaCl1g/L,CaCl20.2g/L,MgCl20.2g/L,NaH2PO41.6g/L,Na2HPO40.3g/L,K2HPO43g/L,琼脂粉15-20g/L。
优选地,所述发酵培养基中添加单一电子载体。
通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法在微生物利用甘油发酵生产还原型有机酸或者累积电能中的应用。
有益效果:
本发明采用微生物电化学调控手段,能明显增加菌株的生长代谢能力,特别是以甘油为唯一碳源时菌株生长受限的微生物菌株,例如产琥珀酸放线杆菌菌株NJ113(ActinobacillussuccinogenesNJ113)通过电化学系统调控策略,在发酵培养基中能够利用甘油生长及代谢,能明显增加还原型产物的合成。当以甘油为主要碳源时,厌氧条件下菌株可以利用甘油生长并合成还原型代谢产物:厌氧条件下在复合培养基中添加电子载体,发酵48小时后,甘油消耗量可达40g/L,总还原酸累计量达66.96g/L,在合成培养基中进行厌氧发酵时,甘油消耗量也可达到10g/L,有机酸积累量22.07g/L,两种发酵模式下能获得的最大电压分别为460mV和210mV。证明了在微生物电化学系统的调控下,非电化学活性微生物菌株可以将胞内过剩的还原力以电子的形式经电子载体传递至胞外,降低胞内还原力水平,恢复细胞的生长能力,同时在此基础之上,有利于还原型产物的积累及电能的产生。
具体实施方式
产琥珀酸放线杆菌NJ113(ActinobacillussuccinogenesNJ113)保藏号CGMCCNo.11716。
本发明中将产琥珀酸放线杆菌NJ113菌株通过固体平板培养基培养后接种至种子培养基中培养得到种子液;然后将种子液接种到发酵培养基中,并通过电化学调控强化菌株的代谢性能。
固体平板培养基和种子培养基的配方为:葡萄糖20g/L,玉米浆干粉7.5g/L,酵母粉10g/L,乙酸钠1.36g/L,NaCl1g/L,CaCl20.2g/L,MgCl20.2g/L,NaH2PO41.6g/L,Na2HPO40.3g/L,K2HPO43g/L,琼脂粉15-20g/L。
产琥珀酸放线杆菌NJ113菌株经固体平板培养基活化后转接至厌氧血清瓶,37℃,厌氧条件下培养12-14小时后转接于种子培养基,在37℃,200转/分钟的条件下培养6-8小时得到种子液;
将种子液按照6-10%(v/v)的接种量接种于含有发酵培养基的电化学装置中,于37℃进行厌氧发酵。在发酵过程中每隔一段时间进行无菌取样,对样品离心处理后测定甘油及有机酸浓度。
根据以下实施例,可以更好的理解本发明。实施案例中所描述的具体的物料配比,工艺条件及其结果仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
本实施例说明将产琥珀酸放线杆菌NJ113(ActinobacillussuccinogenesNJ113)菌株进行厌氧电化学发酵的方法及其应用。
产琥珀酸放线杆菌NJ113(ActinobacillussuccinogenesNJ113)厌氧电化学发酵方法如下:
将冻存管中的产琥珀酸放线杆菌NJ113(ActinobacillussuccinogenesNJ113)作为出发菌株,按上述所述方法获得种子液后接种于含有发酵培养基的电化学反应器中装置中,同时添加1mM中性红。向反应器内持续通入无菌二氧化碳以维持厌氧环境。发酵过程中定时无菌取样,检测培养装置中菌体的密度;将样品离心后保留上清,通过高效液相色谱检测有机酸含量。
所述发酵培养基组成为:甘油10g/L,玉米浆干粉7.5g/L,酵母粉10g/L,乙酸钠1.36g/L,NaCl1g/L,CaCl20.2g/L,MgCl20.2g/L,NaH2PO41.6g/L,Na2HPO40.3g/L,K2HPO43g/L,中性红1.0mM。
作为对照,将上述所述方法获得种子液后接种于含有复合发酵培养基的恒化器(500mL,不含任何外源添加的电子载体)中进行厌氧发酵并定期取样,测定体系中甘油及有机酸浓度。
检测的有机酸浓度和电量如表1所示:
表1厌氧发酵48h后有机酸及最大电压值
实施例2
本实施例说明将产琥珀酸放线杆菌NJ113菌株进行厌氧电化学发酵的方法及其应用。
产琥珀酸放线杆菌NJ113厌氧电化学发酵方法如下:
将冻存管中的产琥珀酸放线杆菌NJ113作为出发菌株,按上述所述方法获得种子液后接种于含有发酵培养基的电化学反应器中装置中,同时添加0.5mM甲基紫精。向反应器内持续通入无菌二氧化碳以维持厌氧环境。发酵过程中定时无菌取样,检测培养装置中菌体的密度;将样品离心后保留上清,通过高效液相色谱检测有机酸含量。
所述发酵培养基组成为:甘油10g/L,玉米浆干粉7.5g/L,酵母粉10g/L,乙酸钠1.36g/L,NaCl1g/L,CaCl20.2g/L,MgCl20.2g/L,NaH2PO41.6g/L,Na2HPO40.3g/L,K2HPO43g/L,甲基紫精0.5mM。
检测的有机酸浓度和电量如表2所示:
表2厌氧发酵48h后有机酸及最大电压值
实施例3
本实施例说明将产琥珀酸放线杆菌NJ113菌株进行厌氧电化学发酵的方法及其应用。
产琥珀酸放线杆菌NJ113厌氧电化学发酵方法如下:
将冻存管中的产琥珀酸放线杆菌NJ113作为出发菌株,按上述所述方法获得种子液后接种于含有发酵培养基的电化学反应器中装置中,同时添加0.5mM硫堇。向反应器内持续通入无菌二氧化碳以维持厌氧环境。发酵过程中定时无菌取样,检测培养装置中菌体的密度;将样品离心后保留上清,通过高效液相色谱检测有机酸含量。
所述发酵培养基组成为:甘油10g/L,玉米浆干粉7.5g/L,酵母粉10g/L,乙酸钠1.36g/L,NaCl1g/L,CaCl20.2g/L,MgCl20.2g/L,NaH2PO41.6g/L,Na2HPO40.3g/L,K2HPO43g/L,硫堇0.5mM。
检测的有机酸浓度和电量如表3所示:
表3厌氧发酵48h后有机酸及最大电压值
实施例4
本实施例说明将产琥珀酸放线杆菌NJ113菌株进行厌氧电化学发酵的方法及其应用。
产琥珀酸放线杆菌NJ113厌氧电化学发酵方法如下:
将冻存管中的产琥珀酸放线杆菌NJ113作为出发菌株,按上述所述方法获得种子液后接种于含有发酵培养基的电化学反应器中装置中,同时添加1mM核黄素。向反应器内持续通入无菌二氧化碳以维持厌氧环境。发酵过程中定时无菌取样,检测培养装置中菌体的密度;将样品离心后保留上清,通过高效液相色谱检测有机酸含量。
所述发酵培养基组成为:甘油10g/L,玉米浆干粉7.5g/L,酵母粉10g/L,乙酸钠1.36g/L,NaCl1g/L,CaCl20.2g/L,MgCl20.2g/L,NaH2PO41.6g/L,Na2HPO40.3g/L,K2HPO43g/L,核黄素1.0mM。
检测的有机酸浓度和电量如表4所示:
表4厌氧发酵48h后有机酸及最大电压值
实施例5
本实施例说明将产琥珀酸放线杆菌NJ113(ActinobacillussuccinogenesNJ113)菌株进行厌氧电化学发酵的方法及其应用。
产琥珀酸放线杆菌NJ113(ActinobacillussuccinogenesNJ113)厌氧电化学发酵方法如下:
将冻存管中的产琥珀酸放线杆菌NJ113(ActinobacillussuccinogenesNJ113)作为出发菌株,按上述所述方法获得种子液后接种于含有发酵培养基的电化学反应器中装置中,同时添加1mM中性红。向反应器内持续通入无菌二氧化碳以维持厌氧环境。发酵过程中定时无菌取样,检测培养装置中菌体的密度;将样品离心后保留上清,通过高效液相色谱检测有机酸含量。
所述发酵培养基组成为:甘油40g/L,玉米浆干粉7.5g/L,酵母粉10g/L,乙酸钠1.36g/L,NaCl1g/L,CaCl20.2g/L,MgCl20.2g/L,NaH2PO41.6g/L,Na2HPO40.3g/L,K2HPO43g/L,中性红1.0mM。
检测的有机酸浓度和电量如表5所示:
表5厌氧发酵48h后有机酸及最大电压值
OD660 | 甘油消耗量(g/L) | 丁二酸(g/L) | 乙酸(g/L) | 甲酸(g/L) | 乳酸(g/L) | 电压(mV) |
1.33 | 37.9 | 42.9 | 11.32 | 4.98 | 7.76 | 438.6 |
实施例6
本实施例说明将产琥珀酸放线杆菌NJ113菌株进行厌氧电化学发酵的方法及其应用。
产琥珀酸放线杆菌NJ113厌氧电化学发酵方法如下:
将冻存管中的产琥珀酸放线杆菌NJ113作为出发菌株,按上述所述方法获得种子液后接种于含有发酵培养基的电化学反应器中装置中,向反应器内持续通入无菌二氧化碳以维持厌氧环境。发酵过程中定时无菌取样,检测培养装置中菌体的密度;将样品离心后保留上清,通过高效液相色谱检测有机酸含量。
甘油10g/L,生物素0.01g/L,烟酸0.025g/L,蛋氨酸0.11g/L,CH3COONa1.36g/L,NaCl1g/L,MgCl20.2g/L,CaCl20.2g/L,Na2HPO40.31g/L,NaH2PO41.6g/L,K2HPO43g/L,NH4HCO31.57g/L。根据不同情况,添加中性红,甲基紫精,硫堇和核黄素作为电子载体,浓度分别为1.0,0.5,0.5,1.0mM。
检测的有机酸浓度和电量如表6所示:
表6厌氧发酵48h后有机酸及最大电压值
Claims (10)
1.一种通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法,包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵,其特征在于,所述厌氧发酵采用电化学发酵,在发酵培养基中添加电子载体,所述电子载体的浓度为0.1-1.0mmol/L。
2.根据权利要求1所述的通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法,其特征在于,所述电子载体为具有氧化还原对特性的化合物。
3.根据权利要求1所述的通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法,其特征在于,所述电化学发酵中,阳极电解液为磷酸盐缓冲液或者铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液,所述阳极电解液的pH为6-7,浓度为0.1-1.0mol/L。
4.根据权利要求1所述的通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法,其特征在于,所述微生物菌体为产琥珀酸放线杆菌NJ113。
5.根据权利要求1所述的通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法,其特征在于,所述发酵培养基为:玉米浆干粉5-10g/L,酵母粉5-15g/L,乙酸钠1.0-2.0g/L,NaCl0.5-2.0g/L,CaCl20.1-0.5g/L,MgCl20.1-0.5g/L,NaH2PO41.0-2.0g/L,Na2HPO40.1-0.5g/L,K2HPO41.0-5.0g/L,碳源甘油,甘油浓度为10~40g/L。
6.根据权利要求1所述的通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法,其特征在于,所述发酵培养基为:CH3COONa1.0-2.0g/L,NaCl0.5-2.0g/L,MgCl20.1-1.0g/L,CaCl20.1-1.0g/L,Na2HPO40.1-1.0g/L,NaH2PO41.0-3.0g/L,K2HPO41.0-5.0g/L,NH4HCO31.0-2.0g/L,甘油10~40g/L,生物素0.01g/L,烟酸0.025g/L,蛋氨酸0.11g/L。
7.根据权利要求2所述的通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法,其特征在于,所述电子载体为中性红或核黄素,浓度为0.1-1.0mmol/L。
8.根据权利要求2所述的通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法,其特征在于,所述电子载体为甲基紫精或硫堇时,浓度为0.1-0.5mmol/L。
9.根据权利要求3所述的通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲液中添加氯化钠以增加电解液的导电率,氯化钠浓度为0.1-1.0mol/L。
10.权利要求1至9中任意一种通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法在微生物利用甘油发酵生产还原型有机酸或者累积电能中的应用。
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