CN101182555A - 一种利用氧化还原电位调控厌氧发酵产丁二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用氧化还原电位(ORP)调控厌氧发酵生产丁二酸的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵产酸三步骤。本发明根据微生物厌氧发酵生产丁二酸的特性，在发酵体系中引入了ORP电极，结合对发酵过程无抑制作用的氧化剂、还原剂对发酵体系的ORP进行调节。发酵体系中加入氧化剂降低ORP，加入还原剂提高ORP，将ORP控制在最适值，以达到丁二酸的高效率生产，提高了丁二酸的产量和产率，减少了副产物的产生，缩短了发酵时间。
Description
技术领域
本发明属于有机酸生产技术领域，特别涉及一种氧化还原电位(ORP)调控厌氧发酵生产丁二酸的方法。
背景技术
丁二酸(Succinic Acid)，又名琥珀酸，作为三羧酸循环的中间产物之一，在生物的代谢中占有非常重要的地位，因此被广泛应用于合成化学药物的中间体。丁二酸主要消费市场有四个：最大的市场是作为表面活性剂、清洁剂添加剂和起泡剂；第二是离子鳌合剂；第三个市场是食品行业中作为酸化剂、pH改良剂、风味物质和抗菌剂；第四个市场是和健康有关的产品，包括医药、抗生素和维生素的生产，这四个市场总量每年超过四亿美元。但丁二酸真正的潜力是作为大规模工业原料的应用，替代苯和石油等大宗化工原料的前景非常的广阔。
传统丁二酸生产方法采用的是从丁烷经顺丁烯二酐通过电解法来生产，这种生产方法污染大，成本高，严重抑制了丁二酸这一大宗化学品的发展潜力。采用玉米生物炼制进行丁二酸生产的开发，生产成本将有望从目前的12,000元/吨降至4,000元/吨以下，从而有利于打开大宗化学品的市场，取代很多基于苯和石化中间产物的商品，减少在超过250种苯基化学制品的生产和消费过程中所产生的污染，市场总量将由目前的1.8万吨扩展至400万吨。其中C4大宗化学品如1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等、N-甲基吡咯烷酮的市场需求超过200亿元/年，制备新型可完全生物降解塑料PBS(聚丁二酸丁二醇脂)也将成为丁二酸的重要应用领域。US5504004、US5573931、US5723322、EP0389103B1公开了丁二酸生产菌以及其发酵方法，这些生产菌株大多是从瘤胃、犬的口腔等特征厌氧生态环境中筛选出来的，在发酵过程中存在着产物收率较低，副产物较多，以及发酵周期长等问题，因此开发高效的丁二酸生产方法是目前亟待解决的问题。
氧化还原电位(ORP)已被用作发酵过程的一种控制参数，它反映了发酵过程中全部的氧化还原过程尤其是细胞的代谢过程。发酵体系中氧化还原电位是pH值、溶解氧浓度、平衡常数和大量溶解培养基中物质的氧化还原电位的综合反映。在好氧发酵体系，可以通过控制溶解氧水平实现氧化还原电位的控制，这种方法已在木糖醇、柠檬酸、L-赖氨酸、重组蛋白等发酵体系中有应用。韩国专利KR175497公开了控制木糖醇发酵体系，其氧化还原电位在50～100mV可提高木糖醇的产量；韩国专利KR9707922公开了通过改变溶解氧的水平控制L-赖氨酸发酵体系，其氧化还原电位在-110～-55mV，可提高L-赖氨酸收率。
由于在厌氧发酵过程中无法通过控制溶解氧来控制体系的氧化还原电位，因此，采用加入对发酵过程无抑制作用的氧化剂、还原剂，结合氧化还原电位的检测来控制体系的氧化还原电位，可以提高厌氧发酵目标产物产量，降低副产物含量，缩短发酵时间。CN200410087673.7公开了一种利用氧化还原电势调控厌氧发酵1，3-丙二醇的方法，提高了1，3-丙二醇的产量和产率，但该方法需经历两段双底物集成发酵好氧过程，ORP调控下的两段双底物集成发酵过渡过程，以及多次ORP调控下的两段双底物集成发酵厌氧过程。目前国内外未见利用ORP直接调控厌氧发酵过程生产有机酸的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用氧化还原电位调控厌氧发酵过程生产丁二酸的方法，以提高目标产物丁二酸的产量，减少副产物产量，缩短发酵时间。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种利用氧化还原电位(ORP)调控厌氧发酵生产丁二酸的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵产酸三步骤，其特征是根据微生物厌氧发酵生产丁二酸的特性，在发酵体系中引入了ORP电极，结合对发酵过程无抑制作用的氧化剂、还原剂对发酵体系的ORP进行调节。发酵体系中加入氧化剂降低ORP，加入还原剂提高ORP，将ORP控制在最适值，以达到丁二酸的高效率生产。
本发明所述的厌氧发酵生产丁二酸的微生物为从特征厌氧环境中筛选的丁二酸生产菌株，包括产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC NO.1716)，产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC55618)，产琥珀酸厌氧螺菌Anaerobiospirillum succiniciproducens(ATCC 53488)。
本发明所述的菌种活化步骤中，菌株活化的斜面培养基为pH 6.0～8.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的固体斜面培养基，斜面培养时将菌株在斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，培养箱含有N2、CO2和H2的混合气体，温度为30～40℃，活化培养24～48h，用于种子培养基接种和菌株保存。
本发明所述的种子培养步骤中，种子培养的培养基为pH 6.0～8.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的液体培养基，培养时将100mL血清瓶中加入种子培养基20～80mL，通入含有N2和CO2混合气，115～121℃灭菌15～30min，冷却后接入斜面培养菌株，培养温度为30～40℃，摇床转速100～300rpm，培养时间为10～16h，用于发酵培养基接种。
本发明所述的厌氧发酵产丁二酸步骤中，发酵培养的培养基为pH 6.0～8.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的液体培养基，7.5L发酵罐中发酵培养基体积为3～5L，放入灭菌ORP电极，接种量为3～7％(v/v)，温度为35～40℃，发酵罐通入CO2，以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速在100～300rpm，并利用各种碳酸盐、氨水、NaOH、尿素、有机酸、无机酸控制发酵过程pH在6.0～7.4，采用氧化剂和还原剂将氧化还原电位值控制在-100mv～-600mv，发酵时间为30～48h。
本发明所述的结合ORP电极使用的氧化剂为过氧化氢，铁氰化钾；结合ORP电极使用的还原剂为二硫苏糖醇，胱氨酸，半胱氨酸，亚硫酸钠，维生素C，维生素E，H2，富马酸二钠，NaHB4。
本发明通过ORP电极检测发酵过程的ORP变化，加入氧化剂和还原剂将体系的ORP控制在最适值，达到丁二酸的高效率生产，提高丁二酸的产量和产率，减少副产物的产生，缩短发酵时间。本发明采用氧化还原电极测定丁二酸发酵体系的ORP，并利用氧化剂、还原剂控制发酵体系的氧化还原电位值，具有重要的理论意义和应用价值。
具体实施方式
以下所述实施例对本发明作了详细说明，但对本发明没有限制。
实施例1
菌种：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC No.1716)
斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，琼脂20g/L。
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，通入CO2气体2min，121℃灭菌15min，冷却。
发酵培养基：葡萄糖100g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl2 0.05g/L，FeCl20.05g/L，CaCl2 0.05g/L，K2HPO4 2.0g/L，MgCO3 80g/L，pH 7.0。
7.5L发酵罐培养时培养基装液量为4.5L。将菌株在种子斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，控制培养箱中混合气比例为N2∶CO2∶H2＝8∶1∶1，37℃培养36h后的菌株用接种环接一环到含有50mL种子液体培养基的100mL血清瓶中，转速300rpm，37℃培养12h后用于上述发酵培养基接种(7.5L发酵罐)，接种量为5％(v/v)，搅拌转速在300rpm，37℃发酵培养，CO2通气量为0.25vvm。将铁氰化钾，半胱氨酸分别配制成10g/L，2g/L的溶液，121℃，灭菌20min。通过ORP电极测定发酵体系的ORP，控制发酵体系的ORP在-350mV，当电位低于-350mV时采用10g/L铁氰化钾升高ORP，当电位高于-350mV时，采用2g/L半胱氨酸降低ORP，控制ORP值在-350mV±10mV，并与不控制氧化还原电位值培养菌株对比，发酵至葡萄糖不再变化，结果见表1。采用半胱氨酸控制氧化还原电位值在-350mV比不控制氧化还原电位时丁二酸产量提高了14.9％，甲酸减少了45.8％，乙酸含量减少了33.6％，发酵时间缩短了25％。
表1半胱氨酸控制ORP与不控制ORP发酵结果对比
| 细胞干重(g/L) | 丁二酸(g/L) | 甲酸(g/L) | 乙酸(g/L) | 发酵结束时间(h) | |
| 不控制ORP控制ORP在-350mV±10mV | 3.54.1 | 64.674.2 | 8.34.5 | 15.210.1 | 4836 |
注：发酵结束时间为两个小时内糖的消耗小于1g/L判定发酵结束。
实施例2
菌种：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes130Z(ATCC 55618)
斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，琼脂20g/L。
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，通入CO2气体2min，115℃灭菌30min，冷却。
发酵培养基：葡萄糖80g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl2 0.05g/L，FeCl20.05g/L，CaCl2 0.05g/L，K2HPO4 2.0g/L，MgCO3 80g/L，pH 7.0。
7.5L发酵罐培养时培养基装液量为4.5L。将菌株在种子斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，控制培养箱中混合气比例为N2∶CO2∶H2＝8∶1∶1，37℃培养36h后的菌株用接种环接一环到含有50mL种子液体培养基的100mL血清瓶中，转速300rpm，37℃培养12h后用于上述发酵培养基接种(7.5L发酵罐)，接种量为5％(v/v)，搅拌转速在300rpm，CO2通气量为0.25vvm，37℃发酵培养，将H2O2、Vc分别配制成0.1％，2g/L的溶液，经0.45um无菌滤膜过滤除菌。通过ORP电极测定发酵体系的ORP，控制发酵体系的ORP在-300mV，当电位低于-300mV时采用0.1％H2O2升高ORP，当电位高于-300mV时，采用2g/L的Vc降低ORP，控制ORP值在-300mV±10mV，并与不控制ORP值培养菌株作对比，发酵至葡萄糖不再变化，结果见表2。采用Vc控制氧化还原电位值在-300mV比不控制氧化还原电位时丁二酸产量提高了14.0％，甲酸减少了32.1％，乙酸含量减少了28.9％，发酵时间缩短了17.4％。
表2 Vc控制ORP与不控制ORP发酵结果对比
| 细胞干重(g/L) | 丁二酸(g/L) | 甲酸(g/L) | 乙酸(g/L) | 发酵结束时间(h) | |
| 不控制ORP控制ORP在-300mV±10mV | 3.13.5 | 56.464.3 | 5.63.8 | 12.99.2 | 4638 |
实施例3
菌种：产琥珀酸厌氧螺菌Anaerobiospirillum succiniciproducens(ATCC 53488)
斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，琼脂20g/L.
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，通入CO2气体2min，115℃灭菌30min，冷却。
发酵培养基：葡萄糖80g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl2 0.05g/L，FeCl20.05g/L，CaCl2 0.05g/L，K2HPO4 2.0g/L，MgCO3 80g/L，pH 7.0。
7.5L发酵罐培养时培养基装液量为4.5L，CO2通气量为0.6L/min，以保持发酵体系的厌氧环境。将菌株在种子斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，控制培养箱中混合气比例为N2∶CO2∶H2＝8∶1∶1，40℃培养36h后的菌株用接种环接一环到含有50mL种子液体培养基的100mL血清瓶中，转速300rpm，37℃培养12h后用于上述发酵培养基接种(7.5L发酵罐)，接种量为5％(v/v)，搅拌转速在300rpm，CO2通气量为0.25vvm，37℃发酵培养，将铁氰化钾，二硫苏糖醇分别配制成10g/L，2g/L的溶液，121℃，灭菌20min。通过ORP电极测定发酵体系的ORP，控制发酵体系的ORP在-400mV，当电位低于-400mV时采用10g/L铁氰化钾升高ORP，当电位高于-400mV时，采用2g/L二硫苏糖醇降低ORP，控制ORP值在-400mV±10mV，并与不控制氧化还原电位值培养菌株，发酵至葡萄糖不再变化，结果见表3。采用二硫苏糖醇控制氧化还原电位值在-400mV比不控制氧化还原电位时丁二酸产量提高了34.6％，乙酸含量减少了42.9％，发酵时间缩短了27.3％。
表3二硫苏糖醇控制ORP与不控制ORP发酵结果对比
| 细胞干重(g/L) | 丁二酸(g/L) | 乙酸(g/L) | 发酵结束时间(h) | |
| 不控制ORP控制ORP在-400mV±10mV | 1.62.1 | 15.320.6 | 4.22.4 | 2216 |
实施例4
菌种：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC No.1716)
斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，琼脂20g/L。
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，通入CO2气体2min，121℃灭菌15min，冷却。
发酵培养基：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl2 0.05g/L，FeCl2 0.05g/L，CaCl20.05g/L，K2HPO4 2.0g/L，MgCO3 80g/L，糖液80g/L。
糖液为玉米皮水解液，制备方法如下：取干燥的玉米皮，经机械粉碎过100目筛，加水制得混浆，玉米皮含量为16％(w/v)，加入98％浓硫酸，加入量为反应液体积的0.5％(v/v)，混浆于121℃水解30min，即得糖液。
7.5L发酵罐培养时培养基装液量为4.5L。将菌株在种子斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，控制培养箱中混合气比例为N2∶CO2∶H2＝8∶1∶1，37℃培养36h后的菌株用接种环接一环到含有50mL种子液体培养基的100mL血清瓶中，转速300rpm，37℃培养12h后用于上述发酵培养基接种(7.5L发酵罐)，接种量为5％(v/v)，搅拌转速在300rpm，37℃发酵培养，CO2通气量为0.25vvm。将铁氰化钾，富马酸二钠分别配制成10g/L，2g/L的溶液，121℃，灭菌20min。通过ORP电极测定发酵体系的ORP，控制发酵体系的ORP在-200mV，当电位低于-200mV时采用10g/L铁氰化钾升高ORP，当电位高于-200mV时，采用2g/L富马酸二钠降低ORP，控制ORP值在-200mV±10mV，并与不控制ORP值培养菌株作对比，发酵至总糖不再变化，结果见表4。采用富马酸二钠控制混合糖液发酵，丁二酸产量提高了22.9％，甲酸减少了37.3％，乙酸含量减少了26.1％，发酵时间缩短了23％。
表4 富马酸二钠控制ORP与不控制ORP发酵结果对比
| 细胞干重(g/L) | 丁二酸(g/L) | 甲酸(g/L) | 乙酸(g/L) | 发酵结束时间(h) | |
| 不控制ORP控制ORP在-200mV±10mV | 3.24.0 | 50.662.2 | 8.35.2 | 16.512.1 | 5240 |
实施例5
菌种：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC No.1716)
斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，琼脂20g/L。
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，通入CO2气体2min，121℃灭菌15min，冷却。
发酵培养基：葡萄糖100g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl2 0.05g/L，FeCl20.05g/L，CaCl2 0.05g/L，K2HPO4 2.0g/L，MgCO3 80g/L，pH 7.0。
7.5L发酵罐培养时培养基装液量为3 L。将菌株在种子斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，控制培养箱中混合气比例为N2∶CO2∶H2＝8∶1∶1，30℃培养24h后的菌株用接种环接一环到含有20mL种子液体培养基的100mL血清瓶中，转速200rpm，30℃培养10h后用于上述发酵培养基接种(7.5L发酵罐)，接种量为3％(v/v)，搅拌转速在100rpm，35℃发酵培养，CO2通气量为0.25vvm。将铁氰化钾，胱氨酸分别配制成10g/L，2g/L的溶液，121℃，灭菌20min。通过ORP电极测定发酵体系的ORP，控制发酵体系的ORP在-100mV，当电位低于-100mV时采用10g/L铁氰化钾升高ORP，当电位高于-100mV时，采用2g/L胱氨酸降低ORP，控制ORP值在-100mV±10mV，并与不控制氧化还原电位值培养菌株对比，发酵至葡萄糖不再变化，结果见表5。采用胱氨酸控制氧化还原电位值在-100mV比不控制氧化还原电位时丁二酸产量提高了11.2％，甲酸减少了32.1％，乙酸含量减少了29.1％，发酵时间缩短了25％。
表5胱氨酸控制ORP与不控制ORP发酵结果对比
| 细胞干重(g/L) | 丁二酸(g/L) | 甲酸(g/L) | 乙酸(g/L) | 发酵结束时间(h) | |
| 不控制ORP控制ORP在-100mV±10mV | 3.04.0 | 51.457.2 | 6.64.5 | 11.38.01 | 4836 |
实施例6
菌种：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes130Z(ATCC 55618)
斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，琼脂20g/L。
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，通入CO2气体2min，115℃灭菌30min，冷却。
发酵培养基：葡萄糖100g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl2 0.05g/L，FeCl20.05g/L，CaCl2 0.05g/L，K2HPO4 2.0g/L，MgCO3 80g/L，pH 7.0。
7.5L发酵罐培养时培养基装液量为5L。将菌株在种子斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，控制培养箱中混合气比例为N2∶CO2∶H2＝8∶1∶1，40℃培养48h后的菌株用接种环接一环到含有80mL种子液体培养基的100mL血清瓶中，转速100rpm，40℃培养16h后用于上述发酵培养基接种(7.5L发酵罐)，接种量为7％(v/v)，搅拌转速在200rpm，40℃发酵培养，CO2通气量为0.25vvm。将H2O2，亚硫酸钠分别配制成0.1％，2g/L的溶液，经0.45um无菌滤膜过滤除菌。通过ORP电极测定发酵体系的ORP，控制发酵体系的ORP在-100mV，当电位低于-100mV时采用0.1％H2O2升高ORP，当电位高于-100mV时，采用2g/L亚硫酸钠降低ORP，控制ORP值在-100mV±10mV，并与不控制ORP电位值培养菌株对比，发酵至葡萄糖不再变化，结果见表6。采用亚硫酸钠控制氧化还原电位值在-100mV比不控制氧化还原电位时丁二酸产量提高了14.1％，甲酸减少了38.9％，乙酸含量减少了30.13％，发酵时间缩短了23.4％。
表6亚硫酸钠控制ORP与不控制ORP发酵结果对比
| 细胞干重(g/L) | 丁二酸(g/L) | 甲酸(g/L) | 乙酸(g/L) | 发酵结束时间(h) | |
| 不控制ORP控制ORP在-100mV±10mV | 3.34.0 | 60.268.7 | 7.24.4 | 13.99.71 | 4836.8 |
实施例7
菌种：产琥珀酸厌氧螺菌Anaerobiospirillum succiniciproducens(ATCC 53488)
斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，琼脂20g/L。
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，通入CO2气体2min，115℃灭菌30min，冷却。
发酵培养基：葡萄糖80g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl2 0.05g/L，FeCl20.05g/L，CaCl2 0.05g/L，K2HPO4 2.0g/L，MgCO3 80g/L，pH 7.0。
7.5L发酵罐培养时培养基装液量为3L。将菌株在种子斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，控制培养箱中混合气比例为N2∶CO2∶H2＝8∶1∶1，30℃培养48h后的菌株用接种环接一环到含有20mL种子液体培养基的100mL血清瓶中，转速300rpm，37℃培养12h后用于上述发酵培养基接种(7.5L发酵罐)，接种量为7％(v/v)，搅拌转速在200rpm，CO2通气量为0.25vvm，37℃发酵培养，将H2O2、VE分别配制成0.1％，2g/L的溶液，经0.45um无菌滤膜过滤除菌。通过ORP电极测定发酵体系的ORP，控制发酵体系的ORP在-350mV，当电位低于-350mV时采用0.1％H2O2升高ORP，当电位高于-350mV时，采用2g/L的VE降低ORP，控制ORP值在-350mV±10mV，并与不控制ORP值培养菌株作对比，发酵至葡萄糖不再变化，结果见表7。采用VE控制氧化还原电位值在-350mV比不控制氧化还原电位时丁二酸产量提高了14.0％，甲酸减少了32.1％，乙酸含量减少了28.9％， 发酵时间缩短了17.4％。
表7 VE控制ORP与不控制ORP发酵结果对比
| 细胞干重(g/L) | 丁二酸(g/L) | 甲酸(g/L) | 乙酸(g/L) | 发酵结束时间(h) | |
| 不控制ORP控制ORP在-350mV±10mV | 3.13.5 | 56.464.3 | 5.63.8 | 12.99.2 | 4638 |
实施例8
菌种：产琥珀酸厌氧螺菌Anaerobiospirillum succiniciproducensATCC 53488
斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，琼脂20g/L.
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，通入CO2气体2min，121℃灭菌15min，冷却。
发酵培养基：葡萄糖80g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl2 0.05g/L，FeCl20.05g/L，CaCl2 0.05g/L，K2HPO4 2.0g/L，MgCO3 80g/L，pH 7.0。
7.5L发酵罐培养时培养基装液量为5L。将菌株在种子斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，控制培养箱中混合气比例为N2∶CO2∶H2=8∶1∶1，37℃培养24h后的菌株用接种环接一环到含有50mL种子液体培养基的100mL血清瓶中，转速200rpm，40℃培养10h后用于上述发酵培养基接种(7.5L发酵罐)，接种量为7％(v/v)，搅拌转速在100rpm，CO2通气量为0.25vvm，37℃发酵培养，将铁氰化钾，NaHB4分别配制成10g/L，2g/L的溶液，121℃，灭菌20min。通过ORP电极测定发酵体系的ORP，控制发酵体系的ORP在-600mV，当电位低于-600mV时采用10g/L铁氰化钾升高ORP，当电位高于-600mV时，采用2g/L NaHB4降低ORP，控制ORP值在-600mV±10mV，并与不控制ORP值培养菌株，发酵至葡萄糖不再变化，结果见表8。采用NaHB4控制氧化还原电位值在-600mV比不控制氧化还原电位时丁二酸产量提高了13.7％，甲酸减少了30.5％，乙酸含量减少了40.1％，发酵时间缩短了24％。
表8 NaHB4控制ORP与不控制ORP发酵结果对比
| 细胞干重(g/L) | 丁二酸(g/L) | 甲酸(g/L) | 乙酸(g/L) | 发酵结束时间(h) | |
| 不控制ORP控制ORP在-600mV±10mV | 3.33.9 | 56.263.9 | 8.15.6 | 14.58.6 | 5139 |
实施例9
菌种：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes130Z(ATCC 55618)
斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，琼脂20g/L。
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO3 10g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 4g/L，通入CO2气体2min，121℃灭菌15min，冷却。
发酵培养基：葡萄糖80g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl20.05g/L，FeCl20.05g/L，CaCl2 0.05g/L，K2HPO4 2.0g/L，MgCO3 80g/L，pH 7.0。
7.5L发酵罐培养时培养基装液量为4.5L。将菌株在种子斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，控制培养箱中混合气比例为N2∶CO2∶H2＝8∶1∶1，37℃培养36h后的菌株用接种环接一环到含有50mL种子液体培养基的100mL血清瓶中，转速300rpm，37℃培养12h后用于上述发酵培养基接种(7.5L发酵罐)，接种量为5％(v/v)，搅拌转速在300rpm，CO2通气量为0.25vvm，37℃发酵培养，将H2O2配制成0.1％的溶液，经0.45um无菌滤膜过滤除菌。通过ORP电极测定发酵体系的ORP，控制发酵体系的ORP在-100mV，当电位低于-600mV时采用0.1％H2O2升高ORP，当电位高于-600mV时，通入经0.45um无菌滤膜过滤除菌的H2降低ORP，控制ORP值在-600mV±10mV，并与不控制ORP值培养菌株作对比，发酵至葡萄糖不再变化，结果见表9。采用H2控制氧化还原电位值在-600mV比不控制氧化还原电位时丁二酸产量提高了12.8％，甲酸减少了26.3％，乙酸含量减少了22.1％，发酵时间缩短了19.6％。
表9 H2控制ORP与不控制ORP发酵结果对比
| 细胞干重(g/L) | 丁二酸(g/L) | 甲酸(g/L) | 乙酸(g/L) | 发酵结束时间(h) | |
| 不控制ORP控制ORP在-600mV±10mV | 2.93.3 | 49.856.2 | 4.73.5 | 10.58.2 | 4637 |
Claims (8)
1.一种利用氧化还原电位(ORP)调控厌氧发酵生产丁二酸的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵产酸三步骤，其特征在于：根据微生物厌氧发酵生产丁二酸的特性，在发酵体系中引入了ORP电极，结合氧化剂、还原剂对发酵体系的ORP进行调节，以提高目标产物丁二酸的产量，减少副产物产量，缩短发酵时间。
2.根据权利要求1所述的利用氧化还原电位(ORP)调控厌氧发酵生产丁二酸的方法，其特征在于所述的厌氧发酵生产丁二酸的微生物为从特征厌氧环境中筛选的丁二酸生产菌株。
3.根据权利2所述的利用氧化还原电位(ORP)调控厌氧发酵生产丁二酸的方法，其特征在于所述的从特征厌氧环境中筛选出丁二酸生产菌株为产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC NO.1716)，产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes130Z(ATCC55618)，产琥珀酸厌氧螺菌Anaerobiospirillum succiniciproducens(ATCC 53488)。
4.根据权利要求1所述的利用氧化还原电位(ORP)调控厌氧发酵生产丁二酸的方法，其特征在于所述的菌株活化的斜面培养基为pH 6.0～8.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的固体斜面培养基，斜面培养时将菌株在斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，培养箱含有N2、CO2和H2的混合气体，温度为30～40℃，活化培养24～48h，用于种子培养基接种和菌株保存。
5.根据权利要求1所述的利用氧化还原电位(ORP)调控厌氧发酵生产丁二酸的方法，其特征在于所述的种子培养的培养基为pH 6.0～8.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的液体培养基，培养时将100mL血清瓶中加入种子培养基20～80mL，通入含有N2和CO2混合气，115～121℃灭菌15～30min，冷却后接入斜面培养菌株，培养温度为30～40℃，摇床转速100～300rpm，培养时间为10～16h，用于发酵培养基接种。
6.根据权利要求1所述的利用氧化还原电位(ORP)调控厌氧发酵生产丁二酸的方法，其特征在于所述的发酵培养的培养基为pH 6.0～8.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的液体培养基，7.5L发酵罐中发酵培养基体积为3～5L，放入灭菌ORP电极，接种量为3～7％(v/v)，温度为35～40℃，发酵罐通入CO2，以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速在100～300rpm，发酵过程控制pH在6.0～7.4，采用氧化剂和还原剂将氧化还原电位值控制在-100mv～-600mv，发酵时间为30～48h。
7.根据权利要求1和6所述的利用氧化还原电位(ORP)调控厌氧发酵生产丁二酸的方法，其特征在于所述的结合ORP电极使用的氧化剂为过氧化氢，铁氰化钾。
8.根据权利要求1和6所述的利用氧化还原电位(ORP)调控厌氧发酵生产丁二酸的方法，其特征在于所述的结合ORP电极使用的还原剂为二硫苏糖醇，胱氨酸，半胱氨酸，亚硫酸钠，维生素C，维生素E，H2，富马酸二钠，NaHB4。
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