CN104131037A - 一种基于微生物电解池厌氧发酵产丁醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于微生物电解池厌氧发酵产丁醇的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵生产丁醇三步骤。本发明通过在发酵培养基中加入一定浓度的中性红作为电子载体，利用微生物电解池体系对菌体产酸期和产醇期提供相同或不同的直流电压，达到丁醇的高效率生产，缩短了发酵时间，提高了丁醇产量、生产强度以及丁醇比。并将两阶段电压调控的方法应用于不同碳源，如：葡萄糖、木糖和玉米芯水解液，具有相似的效果。这种微生物电解池厌氧发酵贝氏梭菌产丁醇的方法对于提高分批和连续发酵的生产强度都具有重要的理论意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于微生物电解池厌氧发酵产丁醇的方法，具体涉及一种利用微生物电解池单阶段及两阶段厌氧发酵贝氏梭菌制备丁醇的方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
近年来，由于世界石油资源加速枯竭、价格不断上涨，生物燃料逐渐受到了广泛的重视。同时，石油资源的燃烧导致温室气体肆意排放，已对全球气候造成了难以逆转的影响。因此，发展生物燃料已成为许多国家提高能源安全、减排温室气体、应对气候变化的重要措施。生物燃料是指通过生物资源生产的适用于汽油或柴油发动机的燃料，目前市场上以燃料乙醇和生物柴油最为常见。作为新型的生物燃料，生物丁醇与乙醇相似，但却具有许多优于乙醇之处，如：能量密度大、挥发性小、腐蚀性小、可与汽油等其他燃料以任意比例混合使用、可直接用于内燃机、运输方便等。在能源危机日益严峻的今天，生物丁醇作为燃料有着广阔的发展前景。
此外，丁醇作为一种4C醇类，还是重要的有机化工原料，广泛应用于化工、塑料、有机合成、油漆等工业。目前，丁醇主要通过化学法裂解石油产生。但从长远的战略角度考虑，探索以再生资源替代石油原料的发酵法来获取化学品以及能源材料是必经之路。因此，微生物发酵法生产生物丁醇的技术已日益引起广泛关注。
迄今为止，丁醇梭菌厌氧发酵过程调控主要包括：pH调控、ORP调控、添加发酵因子及补料分批调控等。根据丙酮丁醇梭菌XY16发酵过程中的pH值变化，郭亭等设计了两阶段调控策略，即前8小时将pH控制在5.5，后期控制pH在4.9，发酵效果最佳：总溶剂产量达到了20.3 g/L，其中丁醇12.5 g/L（Enhancement of butanol production and reducing power using a two-stage controlled-pH strategy in batch culture of Clostridium acetobutylicum XY16 [J]. World J Microbial Biotechnol, 2012, 28(7): 2551-2558.）。Shaohua Wang等控制Clostridium acetobutylicum发酵培养基ORP在-290mV，产溶剂期提前，前24h加强了主代谢途径，总溶剂产量达到了25.6g/L，较对照提高了35% （Controlling the oxidoreduction potential of the culture of Clostridium acetobutylicum leads to an earlier initiation of solventogenesis, thus increasing solvent productivity [J], Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 93(3): 1021-1030.）。El Kanouni等在含有葡萄糖、木糖的发酵培养基中添加一些CaCO3，不仅提高了菌株对木糖的利用能力，而且提高了对丁醇的耐受能力（El Kanouni A., Zerdani I., et al. The improvement of glucose/xylose fermentation by Clostridium acetobutylicum using calcium carbonate [J]. World J Microbiol Biotechnol, 1998, 14(3): 431-435.)。Tashiro 等以葡萄糖为底物，利用C.saccharoperbutylacetonicum N1- 4 发酵制备丁醇时，采用不断流加葡萄糖和丁酸的补料分批发酵方法能促进丁醇发酵，可得到16 g/L的丁醇，比分别使用葡萄糖或丁酸作为唯一碳源时的丁醇产量有较大幅度的提高(Tashiro Y., Takeda K., et al. High butanol production by Clostridium saccharoperbutylacetonicum N124 in fed-batch culture with pH-stat continuous butyric acid and glucose feeding method [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2004, 98(4): 263-268.)。
目前，对微生物电解池厌氧发酵产丁醇的研究还不多。Sophie Peguin等将丙丁梭菌824于三电极体系恒化器中培养，外加甲基紫精（MV）作为电子载体，阴极电势控制在-560mV(ENH)，pH控制为5.5时，丁醇产量大幅提高(Sophie Peguin and Philippe Soucaille. Modulation of metabolism of Clostridium acetobutylicum grown in chemostat culture in a three-electrode potentiostatic system with methyl viologen as electron carrier [J]. Biotechnology and Bioengineering, 1996, 51: 342-348.)。Aditya V Pandit等对大肠杆菌代谢模式菌株进行电化学调控，通电只加强了菌体生长，对丁醇的合成并没有影响(Aditya V Pandit and Radhakrishnan Mahadevan. In silico characterization of microbial electrosynthesis for metabolic engineering of biochemicals [J]. Microbial Cell Factories, 2011, 10: 76.)。
Clostridium acetobutylicum 和Clostridium beijerinckii 是目前丁醇发酵中常用的菌株，其中C. acetobutylicum的淀粉酶活力高，对玉米粉等淀粉原料有明显的优势；而C. beijerinckii 底物的抗逆性相对较强，产物转化率较高，底物利用范围较广等。C. beijerinckii IB4是以贝氏梭菌NCIMB8052为出发菌株经离子束诱变后获得的菌株(201110020102.6)，其特性是对木质纤维酸解糖液中抑制物的耐受性高、溶剂产量高、糖转化率高，因此是一种适合利用低劣质原料发酵产丁醇的优良菌株；通过微生物电解池的应用，从而使C. beijerinckii IB4能高效利用木质纤维素酸解糖液等低劣质原料，对发酵法制备生物丁醇经济性的提高有一定的指导意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种微生物电解池单阶段及两阶段厌氧发酵产丁醇的方法，以缩短发酵时间，提高产量、生产强度和丁醇比。
为了解决上述问题，本发明提供了一种基于微生物电解池厌氧发酵产丁醇的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵生产丁醇三步骤，其特征在于厌氧发酵步骤中，在发酵液中外加电子载体，采用石墨毡为阴极电极和阳极电极、质子交换膜为隔膜材料的H型两室电解池，两室分别注入发酵液和磷酸盐(PBS)缓冲液，以电化学工作站提供直流恒压电源，工作电极接发酵液，辅助电极接上述磷酸盐缓冲液，参比电极接发酵液，以参比电极和工作电极控制发酵液中的电极电位，或将参比电极线接在辅助电极上直接控制两室间电压，在发酵产酸期和产醇期对其提供阶段性的外加电压，对贝氏梭菌产丁醇的厌氧发酵过程进行调控。
本发明所述的基于微生物电解池厌氧发酵产丁醇的方法中，所述参比电极为Ag/AgCl电极，所述阶段性外加电压为单阶段外加电压或者两阶段外加电压。
本发明所述的基于微生物电解池厌氧发酵产丁醇的方法中，所述电子载体为中性红，浓度为0.05mmol/L-0.2mmol/L，优选为0.1mmol/L。
本发明所述的基于微生物电解池厌氧发酵产丁醇的方法中，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.5-8.0，浓度为0.05-0.3mol/L，优选为pH7.0，浓度0.1mol/L。
本发明所述的菌种为贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4(CCTCC NO：M 2010310)。本发明所述的菌种活化步骤是常规的贝氏梭菌所采用的菌种活化方法。在本发明中，是将菌种由冻存的甘油管中接入50 mL血清瓶的pH为6. 0~7. 0的含有淀粉的能提供碳源、氮源以及无机盐的常规液体培养基中，通入N2或CO2，在恒温培养箱中培养，温度为30~37℃，活化培养12~24 h，用于种子培养基接种和菌种保存。
本发明所述的种子培养步骤是常规的贝氏梭菌所采用的种子培养方法。在本发明中，种子培养的培养基为pH 6. 0~7. 0的含有糖类的能提供碳源、氮源以及无机盐的常规液体培养基，培养时将250mL血清瓶中加入种子培养基50~150 mL，通入N2或CO2，115~121℃灭菌15~30 min，冷却后接入活化的种子液，培养温度为30~40℃，在恒温培养箱中培养，培养时间为8~12 h，用于微生物电解池接种。
本发明所述的厌氧发酵生产丁醇的步骤中，发酵培养的培养基为pH 6. 0~7. 0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基，注入过滤灭菌的中性红作为电子载体，微生物电解池中发酵培养基的体积为250 mL；且厌氧发酵的操作和发酵条件也是常规的利用贝氏梭菌厌氧发酵产丁醇的方法，在本发明中，接种量为体积比5%~10%，温度为35～40℃，微生物电解池通入N2或CO2，以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速在100~200 rpm，发酵时间为24~72 h。
本发明的有益效果在于：
本发明将微生物电解池体系与丁醇厌氧发酵技术相结合，通过在发酵培养基中加入一定浓度的中性红作为电子载体，利用微生物电解池体系对菌体产酸期和产醇期提供相同或不同的直流电压，达到丁醇的高效率生产，有效缩短了发酵时间，显著提高了丁醇产量、生产强度以及丁醇比；本发明采用的基于微生物电解池厌氧发酵产丁醇的方法，对于缩短发酵时间，提高产量，提高分批和连续发酵的生产强度都具有重要的理论意义和应用价值。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
菌种：贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4（CCTCC NO：M 2010310）
种子培养基：种子培养基：酵母粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，乙酸铵 2 g/L，NaCl 2 g/L，MgSO4 3 g/L，KH2PO4 1 g/L，K2HPO4 1 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 6.0；
发酵培养基（P2）：碳源（葡萄糖 60 g/L 分消)，K2HPO4 0.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，CH3COONH4 2.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，NaCl 0.01 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L；玉米浆 1 g/L；中性红 0.1mM（过滤灭菌）。
300 mL微生物电解池培养时培养基装液量为250 mL。将冻存的甘油管中的菌种接入50 mL血清瓶中30 mL的种子培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为37℃，活化培养。培养12 h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有150 mL种子培养基的250 mL血清瓶中，扩大培养，12 h后用于上述发酵培养基接种（300 mL微生物电解池），接种量为10%（v/v），接种后通入N2，通气量为0.25 vvm，10 min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。将PBS缓冲液（pH 7.0）注入另一室，通入N2排尽氧气，通气量为0.25 vvm，10 min后停止通气，通气口插入液面以下。控制发酵液的搅拌转速在120 rpm，37℃发酵培养。本实施例采用施加单阶段外加电压的方式，将电化学工作站的工作电极接发酵液，辅助电极和参比电极线接0.1M PBS缓冲液（pH 7.0），控制两极间电压为+0.5V（发酵液为阳极），发酵至总溶剂产量不再变化。并与同体积发酵液单批发酵的结果对比，结果如表1。
表1 两电极体系+0.5V外加电压调控与对照结果对比
由表1中的实验结果可看出，发酵液做阳极，两极间外加电压+0.5V情况下，菌体生长快，发酵时间大大缩短，丁醇产量无明显变化，丁醇产率大大提高，丁醇比稍有降低。
实施例2
菌种：贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4（CCTCC NO：M 2010310）
种子培养基：种子培养基：酵母粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，乙酸铵 2 g/L，NaCl 2 g/L，MgSO4 3 g/L，KH2PO4 1 g/L，K2HPO4 1 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 6.0；
发酵培养基（P2）：碳源（葡萄糖 60 g/L 分消)，K2HPO4 0.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，CH3COONH4 2.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，NaCl 0.01 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L；玉米浆 1 g/L；中性红 0.1mM（过滤灭菌）。
300 mL微生物电解池培养时培养基装液量为250 mL。将冻存的甘油管中的菌种接入50 mL血清瓶中30 mL的种子培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为37℃，活化培养。培养12 h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有150 mL种子培养基的250 mL血清瓶中，扩大培养，12 h后用于上述发酵培养基接种（300 mL微生物电解池），接种量为10%（v/v），接种后通入N2，通气量为0.25 vvm，10 min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。将PBS缓冲液（pH 7.0）注入另一室，通入N2排尽氧气，通气量为0.25 vvm，10 min后停止通气，通气口插入液面以下。控制发酵液的搅拌转速在120 rpm，37℃发酵培养。将电化学工作站的工作电极和参比电极接发酵液，辅助电极接0.1M PBS缓冲液（pH 7.0），控制工作电极和参比电极间电位为-1.0V（发酵液为阴极），发酵至总溶剂产量不再变化，并与同体积发酵液单批发酵的结果对比，结果如表2。
表2 三电极体系-1.0V外加电压调控与对照结果对比
由表2中的实验结果可看出，发酵液做阴极，外加电压-1.0V情况下，菌体生长稍慢，发酵时间相同，丁醇产量稍高，丁醇产率有所提高，丁醇比有较大提升。
实施例3
菌种：贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4（CCTCC NO：M 2010310）
种子培养基：种子培养基：酵母粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，乙酸铵 2 g/L，NaCl 2 g/L，MgSO4 3 g/L，KH2PO4 1 g/L，K2HPO4 1 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 6.0；
发酵培养基（P2）：碳源（葡萄糖 60 g/L 分消)，K2HPO4 0.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，CH3COONH4 2.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，NaCl 0.01 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L；玉米浆 1 g/L；中性红 0.1mM（过滤灭菌）。
300 mL微生物电解池培养时培养基装液量为250 mL。将冻存的甘油管中的菌种接入50 mL血清瓶中30 mL的种子培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为37℃，活化培养。培养12 h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有150 mL种子培养基的250 mL血清瓶中，扩大培养，12 h后用于上述发酵培养基接种（300 mL微生物电解池），接种量为10%（v/v），接种后通入N2，通气量为0.25 vvm，10 min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。将PBS缓冲液（pH 7.0）注入另一室，通入N2排尽氧气，通气量为0.25 vvm，10 min后停止通气，通气口插入液面以下。控制发酵液的搅拌转速在120 rpm，37℃发酵培养。本实施例采用施加两阶段外加电压的方式，在发酵前12h，将电化学工作站的工作电极接发酵液，辅助电极和参比电极线接0.1M PBS缓冲液（pH 7.0），控制两极间电压为+0.5V（发酵液为阳极）；发酵12h后，将电化学工作站的工作电极和参比电极接发酵液，辅助电极接0.1M PBS缓冲液（pH 7.0），控制工作电极和参比电极间电位为-1.0V（发酵液为阴极），发酵至总溶剂产量不再变化。并与同体积发酵液单批发酵的结果对比。结果如表3。
表3 两阶段外加电压调控与对照结果对比
由表3中的实验结果可看出，两阶段通电（+0.5V~-1.0V）情况下，菌体生长稍快，发酵时间缩短，丁醇产量、产率及丁醇比均提高。
实施例4
菌种：贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4（CCTCC NO：M 2010310）
种子培养基：种子培养基：酵母粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，乙酸铵 2 g/L，NaCl 2 g/L，MgSO4 3 g/L，KH2PO4 1 g/L，K2HPO4 1 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 6.0；
发酵培养基（P2）：碳源（木糖 35 g/L 分消)，K2HPO4 0.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，CH3COONH4 2.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，NaCl 0.01 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L；玉米浆 1 g/L；中性红 0.1mM（过滤灭菌）。
300 mL微生物电解池培养时培养基装液量为250 mL。将冻存的甘油管中的菌种接入50 mL血清瓶中30 mL的种子培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为37℃，活化培养。培养12 h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有150 mL种子培养基的250 mL血清瓶中，扩大培养，12 h后用于上述发酵培养基接种（300 mL微生物电解池），接种量为10%（v/v），接种后通入N2，通气量为0.25 vvm，10 min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。将PBS缓冲液（pH 7.0）注入另一室，通入N2排尽氧气，通气量为0.25 vvm，10 min后停止通气，通气口插入液面以下。控制发酵液的搅拌转速在120 rpm，37℃发酵培养。在发酵前12h，将电化学工作站的工作电极接发酵液，辅助电极和参比电极线接0.1M PBS缓冲液（pH 7.0），控制两极间电压为+0.5V（发酵液为阳极）；发酵12h后，将电化学工作站的工作电极和参比电极接发酵液，辅助电极接0.1M PBS缓冲液（pH 7.0），控制工作电极和参比电极间电位为-1.0V（发酵液为阴极），发酵至总溶剂产量不再变化。并与同体积发酵液单批发酵的结果对比。结果如表4。
表4 两阶段外加电压调控与对照结果对比
由表4中的实验结果可看出，两阶段通电（+0.5V~-1.0V）情况下，菌体生长稍快，发酵时间缩短，丁醇产量、产率及丁醇比均提高。同以上实例的结果一致，两阶段通电（+0.5V~-1.0V）同样有助于贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4利用木糖发酵产丁醇。
实施例5
菌种：贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4（CCTCC NO：M 2010310）
种子培养基：种子培养基：酵母粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，乙酸铵 2 g/L，NaCl 2 g/L，MgSO4 3 g/L，KH2PO4 1 g/L，K2HPO4 1 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 6.0；
发酵培养基（P2）：碳源（玉米芯酸解糖液：木糖43.6g/L，葡萄糖5.0g/L，阿拉伯糖3.1g/L)，K2HPO4 0.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，CH3COONH4 2.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，NaCl 0.01 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L；玉米浆 1 g/L；中性红 0.1mM（过滤灭菌）。
300 mL微生物电解池培养时培养基装液量为250 mL。将冻存的甘油管中的菌种接入50 mL血清瓶中30 mL的种子培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为37℃，活化培养。培养12 h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有150 mL种子培养基的250 mL血清瓶中，扩大培养，12 h后用于上述发酵培养基接种（300 mL微生物电解池），接种量为10%（v/v），接种后通入N2，通气量为0.25 vvm，10 min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。将PBS缓冲液（pH 7.0）注入另一室，通入N2排尽氧气，通气量为0.25 vvm，10 min后停止通气，通气口插入液面以下。控制发酵液的搅拌转速在120 rpm，37℃发酵培养。在发酵前12h，将电化学工作站的工作电极接发酵液，辅助电极和参比电极线接0.1M PBS缓冲液（pH 7.0），控制两极间电压为+0.5V（发酵液为阳极）；发酵12h后，将电化学工作站的工作电极和参比电极接发酵液，辅助电极接0.1M PBS缓冲液（pH 7.0），控制工作电极和参比电极间电位为-1.0V（发酵液为阴极），发酵至总溶剂产量不再变化。并与同体积发酵液单批发酵的结果对比。结果如表5。
表5 两阶段外加电压调控与对照结果对比
由表5中的实验结果可看出，两阶段通电（+0.5V~-1.0V）情况下，菌体生长稍快，发酵时间缩短，丁醇产量、产率及丁醇比均提高。同以上实例的结果一致，两阶段通电（+0.5V~-1.0V）同样有助于贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4利用玉米芯酸解糖液发酵产丁醇。
Claims (10)
1.一种基于微生物电解池厌氧发酵产丁醇的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵生产丁醇三步骤，其特征在于厌氧发酵步骤中，在发酵液中外加电子载体，采用微生物电解池体系作为反应装置，在厌氧发酵过程中提供阶段性外加电压。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的微生物电解池体系是采用石墨毡为阴极电极和阳极电极、质子交换膜为隔膜材料的H型两室电解池，两室分别注入发酵液和磷酸盐缓冲液，以电化学工作站提供直流恒压电源，工作电极和参比电极接发酵液，辅助电极接上述磷酸盐缓冲液，以参比电极和工作电极控制发酵液中的电极电位；或者将参比电极线接在辅助电极上直接控制两室间电压。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述电子载体为中性红。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述阶段性外加电压为单阶段外加电压或者两阶段外加电压。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的菌种为贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述电子载体的浓度为0.05mmol/L-0.2mmol/L。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述电子载体的浓度为0.1mmol/L。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述参比电极为Ag/AgCl电极。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述磷酸盐缓冲液的pH为6.5-8.0，浓度为0.05-0.3mol/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0，浓度为0.1mol/L。
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|---|---|---|---|---|
| CN104531784A (zh) * | 2015-01-12 | 2015-04-22 | 南京工业大学 | 一种电化学装置利用玉米芯水解液的方法 |
| CN105647981A (zh) * | 2016-03-29 | 2016-06-08 | 南京工业大学 | 一种通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法及其应用 |
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2014
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN105647981A (zh) * | 2016-03-29 | 2016-06-08 | 南京工业大学 | 一种通过电化学系统强化微生物菌体利用甘油的方法及其应用 |
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