CN1233658A - 高产长链二元酸的假丝酵母的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高产长链二元酸的假丝酵母的筛选方法,首先采用硫酸二乙酯诱变假丝酵母,然后用紫外线二次诱变酵母细胞及氯丙嗪浓缩α、ω－氧化增强的假丝酵母,用培养基系统筛选α、ω－氧化增强的假丝酵母,最后获得α、ω－氧化增强的假丝酵母。使用本发明的方法可以快速地分离获得目的菌株,使α、ω－氧化增强型菌株快速的从大量的处理细胞中分离出来,从而为提高长链二元酸的产酸量和转化率打下基础。
Description
本发明涉及一种高产长链二元酸的假丝酵母的筛选方法，尤其是高效分离获得α-氧化和β-氧化增强的假丝酵母，从而提高二元酸产酸及转化率的方法，属于生物化工技术领域。
长链二元酸(Dicarboxylic Acid,DCA)作为一种重要的化工原料是合成工程塑料、香料、耐寒性增塑剂、润滑油添加剂、涂料、液晶等物质的重要原料。此外，长链二元酸的盐类在医药和食品工业中也具有广泛用途。
国内外研究应用发酵法生产二元酸至今已有三十多年的历史。其中日本和中国在此领域开展了大量的研究工作。从1986年开始，我国石化总公司开始十三碳二元酸的研究和开发工作。国家在“九五”期间，又将长链二元酸的产业化作为重点科技攻关项目；并且到目前为止，我国的十三碳二元酸已初步实现了工业化生产。但是，目前国内外在二元酸生产过程中所面临的首要问题之一是油酸转化率低，以克分子计仅50％左右，从而造成原料的大量消耗和浪费，使成本偏高；其次，在二元酸生产中还面临着产酸水平低的问题，使生产中的操作费用提高。
为解决上述问题，国内外研究人员在以下几个方面开展大量的研究工作：1．菌种选育；2．培养基组成的优化和发酵工艺条件的考察；3．菌体产生二元酸的机理以及代谢调控等。从目前的研究情况开看，在二元酸的高产菌株的选育过程中，主要采用的依然是常规化学诱变或物理诱变的方法。
1997年，依据多年的研究成果，并结合国外最新的研究报道，清华大学提出了烷烃在假丝酵母(Candia tropicalis)细胞内生成DCA的完整代谢网络。这是多个细胞器以及多条代谢途径综合在一起的立体的代谢网络。当烷烃被菌体吸收以后，首先经过α-氧化生成α-一元酸(MCA)，然后再进一步被相同的酶系经过ω-氧化生成DCA。所以，在长链二元酸的生产过程中，α、ω-氧化是将烷烃氧化生成二元酸的反应，其中的关键酶是细胞色素P450酶，所以，选择P450酶强的菌体，其α、ω-氧化的代谢能力也必然增强。其中，在研究中注意到P450是一个多功能酶，他在细胞中主要的作用是消除细胞中的有毒物质，是一个解毒酶，所以通过检测细胞的解毒能力，可以判断出P450酶的代谢能力。我们可以在特定培养液中添加有毒物质，这样通过一定时间的培养以后，P450酶代谢能力强的菌体可以生存下来，而P450酶代谢能力弱的菌体被抑制或杀死，从而使培养液中P450酶活力强的菌体的相对浓度大大增加，也即α、ω-氧化能力强的菌体被浓缩，从而易于分离筛选生产二元酸能力强的菌株。
综合以上所述大量的有关假丝酵母菌种改造的研究工作，无论是应用常规的物理和化学诱变方法还是通过基因工程和代谢工程的改造的方法，最终都将涉及到从改造后的菌株中分离获得高产菌株的问题。
本发明的目的是提出一种高产长链二元酸的假丝酵母的筛选方法，从大量的菌体细胞中分离获得烷烃氧化增强型菌株，即α、ω-氧化阻断的高产酸的菌株，其目的是将上游的菌株改造技术与最终的菌株的分离获得结合起来，在菌体经过改造处理后，可以快速地分离获得目的菌株，使α、ω-氧化增强型菌株快速的从大量的处理细胞中分离出来，从而为提高长链二元酸的产酸量和转化率打下基础和提供前提。
本发明提出的高产长链二元酸的假丝酵母的筛选方法，由以下步骤组成：
1、首先采用硫酸二乙酯诱变假丝酵母：从菌体的固体平板上挑取假丝酵母的单菌落，接种于装有20-30毫升麦芽汁培养基的300毫升的三角瓶中，在28-35℃的温度下于150-300转/分钟的摇床上培养24-48小时；将发酵菌液在离心机中2000-8000转/分离心3-10分钟，弃去上清液，用无菌水重新悬浮细胞，使细胞浓度达到1-8×108个/毫升；将上述菌液1-3毫升分装于5毫升的离心管中，2000-8000转/分钟离心3-10分钟，弃去上清液，用1-3毫升的pH7.0的0.1M的磷酸钠缓冲液重新悬浮细胞，混匀，吸取0.1-0.5毫升放置于4℃冰箱中作为对照；在剩余的的菌液中加入1-3％体积的硫酸二乙酯，混匀，在30℃的温度下于150-300转/分钟的摇床上处理20-60分钟，然后加入200-600μl的25％硫代硫酸钠，混匀，终止反应；将处理液在离心机上3000-6000转/分钟离心4-10分钟，沉淀细胞；
2、制备固体平板1，其组成为：酵母浸膏粉：10g/L，蛋白胨：20g/L，葡萄糖：20g/L，制备培养基1，其组成为：磷酸二氢钾：4g/L，葡萄糖：10g/L，磷酸氢二钠：2g/L，氯化钠：1g/L，酵母膏：1g/L，维生素B1：0.1g/L，尿素：2g/L，烷烃：20g/L；pH7.5，加入1-3％的8.3g/L浓度的酚红，制备培养基2：磷酸二氢钾：4g/L，葡萄糖：10g/L，磷酸氢二钠：2g/L，氯化钠：1g/L，酵母膏：1g/L，维生素B1:0.1g/L，尿素：2g/L，烷烃：20g/L；pH10.5，加入1-3％的10g/L浓度的百里香兰酚酞乙醇溶液，备用；
3、紫外线二次诱变酵母细胞及氯丙嗪浓缩α、ω-氧化增强的假丝酵母：将上述沉淀细胞用无菌水稀释至10-2-10-4，从中取0.1-0.4毫升稀释液分别涂于含有1-5毫克/升的氯丙嗪的固体平板1以及不含氯丙嗪的固体平板上，每个稀释度涂3-6个平板，紫外灯预热20到30分钟，以1-5×105J/mm2的计量处理上述平板，同时，设置不用紫外线处理的对照，平板处理完毕后，避光，于30-37℃培养48-120小时；
4、培养基系统筛选α、ω-氧化增强的假丝酵母：经过3处理的平板，在经过一定时间的培养后，可以在平板上获得经过诱变的生长情况不同的菌落，选择致死率为50-90％且在含有氯丙嗪的培养基的条件下获得生长的菌株，分别一一对应的接种于培养基1和培养基2的平板上，与30-37℃培养120-168小时；
5、α、ω-氧化增强的假丝酵母的获得：经过4处理的菌株，在经过一定时间的培养后，观察菌株在不同筛选平板上的生长情况，首先，测定不同菌株在培养基2平板上的R值(R值=产酸圈的面积/菌落面积)，选择R值大的菌株作为目的菌株，另外，观察菌株的菌落在培养基2平板上的变色圈，选择其中显示黄色的菌株。结合在培养基1平板和培养基2平板上的情况，将在培养基1上显示黄色和R值大的菌株筛选出来，即为本发明的α、ω-氧化增强的假丝酵母。
为了验证由本发明方法筛选的α、ω-氧化增强的假丝酵母，对新获得的诱变菌株进行发酵产长链二元酸的培养：将上述获得的通过氯丙嗪浓缩以及培养基筛选体系获得的诱变菌株在种子培养液(硫酸镁：0.5g/L，磷酸二氢钠：0.2g/L，磷酸氢二钾：0.04g/L，氯化钠：1g/L，维生素B1：0.1g/L，尿素：2g/L，蔗糖：20g/L，正十三烷：30g/L)中于28-35℃，150-300转/分钟的摇床上培养24-48小时；培养体积为20-40毫升：在种子培养基中生长完毕后，接种发酵培养基(硫酸镁：0.5g/L，磷酸二氢钠：0.2g/L，磷酸氢二钾：0.04g/L，氯化钠：1g/L，维生素B1:0.1g/L，尿素：4g/L，蔗糖：40g/L，正十三烷：80g/L)，接种量为5-15％，培养体积为40-100毫升，摇床转速为150-300转/分，温度为28-35℃，培养时间为72-120小时。发酵结束后，用6N的硫酸调节发酵液的pH值至2.0-3.0以下，使长链二元酸完全结晶析出，5000-8000转/分钟，离心10-20分钟，去上清，过滤，并用蒸馏水将滤饼洗涤至中性，在60-90℃烘箱中烘干24-48小时，即可获得产品十三碳二元酸。
本发明提供了能够从经过菌种改造的大量假丝酵母中快速而高效的获得α、ω-氧化增强的假丝酵母突变菌株的方法。首先采用氯丙嗪处理可以浓缩α、ω-氧化增强的假丝酵母：在含有氯丙嗪的情况下获得生长的菌株，其细胞中α、ω-氧化代谢途径中的关键酶细胞色素P450酶活性很高，即在这种情况下获得良好生长的菌株，是α、ω-氧化代谢增强的菌株。另外，采用培养基筛选体系，可以同时处理大量的经过诱变和浓缩的菌株，从而极大地加快筛选过程，高效而准确地获得具有菌株α、ω-氧化增强的假丝酵母。该方法的建立，为工业发酵生产长链二元酸中菌种的改造和筛选提供了有效的手段，从而为提高长链二元酸的产酸量和烷烃的转化率打下了基础，必将在石油发酵工业中具有广阔的推广和应用前景。
下面介绍本发明的实施例：
实施例1：
(1)首先采用硫酸二乙酯诱变假丝酵母：本发明实施例所用的假丝酵母从中国石化总公司抚顺石油研究院购买。从菌体的固体平板上挑取假丝酵母的单菌落，接种于装有20毫升麦芽汁培养基的300毫升的三角瓶中，在30℃的温度下于200转/分钟的摇床上培养36小时；将发酵菌液在离心机中5000转/分离心6分钟，弃去上清液，用无菌水重新悬浮细胞，使细胞浓度达到2×102个/毫升；将上述菌液3毫升分装于5毫升的离心管中，5000转/分钟离心6分钟，弃去上清液，用3毫升的pH7.0的0.1M的磷酸钠缓冲液重新悬浮细胞，混匀，吸取0.5毫升放置于4℃冰箱中作为对照；在剩余的的菌液中加入2％体积的硫酸二乙酯，混匀，在30℃的温度下于200转/分钟的摇床上处理40分钟，然后加入300μl的25％硫代硫酸钠，混匀，终止反应；将处理液在离心机上5000转/分钟离心8分钟，沉淀细胞。
(2)紫外二次诱变酵母细胞及氯丙嗪浓缩α、ω-氧化增强的假丝酵母：将上述沉淀细胞用无菌水稀释至10-2-10-4，从中取0.2毫升稀释液分别涂于含有2毫克/升的氯丙嗪的固体平板1(酵母浸膏粉：10g/L，蛋白胨：20g/L，葡萄糖：20g/L)，以及不含氯丙嗪的固体平板1，每个稀释度涂3个平板，紫外线处理剂量为3×105J/mm2。避光，于30℃培养72小时。
(3)培养基系统筛选α、ω-氧化增强的假丝酵母：经过2处理的平板，从平板上获得经过诱变的生长情况不同的菌落，选择致死率为70％，且在含有氯丙嗪的培养基的条件下获得生长的菌株，分别一一对应的接种于培养基1平板和培养基2平板，于30℃培养120小时。培养基1培养基：磷酸二氢钾：4g/L，葡萄糖：10g/L，磷酸氢二钠：2g/L，氯化钠：1g/L，酵母膏：1g/L，维生素B1:0.1g/L，尿素：2g/L，烷烃：20g/L；pH7.5，加入1％的8.3g/L浓度的酚红。培养基2培养基：磷酸二氢钾：4g/L，葡萄糖：10g/L，磷酸氢二钠：2g/L，氯化钠；1g/L，酵母膏：1g/L，维生素B1:0.1g/L，尿素：2g/L，烷烃：20g/L；pH10.5，加入1％的10g/L浓度的百里香兰酚酞乙醇溶液。
(4)α、ω-氧化增强的假丝酵母的获得：经过3处理的菌株，在经过一定时间的培养后，观察菌株在不同筛选平板上的生长情况。测定培养基2平板上菌株的R值，同时观察这些菌株在培养基1平板上的产酸变色情况，选择R值大于1.85且在培养基1平板上形成黄色产酸圈的菌株，即为α、ω-氧化增强的假丝酵母。
对新获得的诱变菌株进行发酵产长链二元酸的培养：将上述获得的通过氯丙嗪浓缩以及培养基筛选体系获得的诱变菌株在种子培养液中于30℃,200转/分钟的摇床上培养30小时；培养体积为20毫升；在种子培养基中生长完毕后，接种发酵培养基，接种量为10％，培养体积为50毫升，摇床转速为200转/分，温度为30℃，培养时间为120小时。发酵结束后，用6N的硫酸调节发酵液的pH值至2.0以下，使长链二元酸完全结晶析出，8000转/分钟，离心10分钟，去上清，过滤，并用蒸馏水将滤饼洗涤至中性，在90℃烘箱中烘干48小时，即可获得产品十三碳二元酸。
实施例2：
(1)同实施例1中的(1)，应用硫酸二乙酯诱变假丝酵母细胞：
(2)紫外二次诱变酵母细胞及氯丙嗪浓缩α、ω-氧化增强的假丝酵母：将上述沉淀细胞用无菌水稀释至10-2-10-4，从中取0.3毫升稀释液涂于含有3毫克/升的氯丙嗪的YPD固体平板(酵母浸膏粉：10g/L，蛋白胨：20g/L，葡萄糖：20g/L)，每个稀释度涂3个平板以及不含氯丙嗪的YPD平板，每个稀释度涂3个平板，紫外线处理剂量为2×105J/mm2，紫外线处理。避光，于37℃培养120小时。
(3)培养基系统筛选α、ω-氧化增强的假丝酵母：经过2处理的平板，从平板上获得经过诱变的生长情况不同的菌落，在含有氯丙嗪的培养基的条件下获得生长的菌株，分别一一对应的接种于培养基1平板和培养基2平板，与30℃培养168小时。培养基1培养基：磷酸二氢钾：4g/L，葡萄糖：10g/L，磷酸氢二钠：2g/L，氯化钠：1g/L，酵母膏：1g/L，维生素B1:0.1g/L，尿素：2g/L，烷烃：20g/L；pH7.5，加入2％的8.3g/L浓度的酚红。培养基2培养基：磷酸二氢钾：4g/L，葡萄糖：10g/L，磷酸氢二钠：2g/L，氯化钠：1g/L，酵母膏：1g/L，维生素B1：0.1g/L，尿素：2g/L，烷烃：20g/L；pH10.5，加入3％的10g/L浓度的百里香兰酚酞乙醇溶液。
(4)同实施例1中的(4)，对α、ω-氧化增强的假丝酵母的进行复筛确认。
对新获得的诱变菌株进行发酵产长链二元酸的培养：将上述通过氯丙嗪浓缩以及SRC筛选体系获得的诱变菌株在种子培养液中于30℃,250转/分钟的摇床上培养24小时；培养体积为30毫升；在种子培养基中生长完毕后，接种发酵培养基，接种量为10％，培养体积为60毫升，摇床转速为250转/分，温度为30℃，培养时间为96小时。发酵结束后，用6N的硫酸调节发酵液的pH值至2.0以下，使长链二元酸完全结晶析出，8000转/分钟，离心10分钟，去上清，过滤，并用蒸馏水将滤饼洗涤至中性，在90℃烘箱中烘干48小时，即可获得产品十三碳二元酸。
实施例3：
(1)应用硫酸二乙酶诱变假丝酵母，各项操作基本同实施例1中的(1)，但将硫酸二乙酯的处理用量改为3％，处理菌量为8×108个/毫升，处理时间为40分钟，并且应用600μl的硫代硫酸钠终止反应；
(2)应用紫外线诱变及氯丙嗪浓缩α、ω-氧化增强假丝酵母，基本操作同实施例2中的(2)；
(3)培养基系统筛选的假丝酵母，基本操作同实施例2种的(3)；
(4)α、ω-氧化增强的假丝酵母的获得：经过3处理的菌株，在经过一定时间的培养后，观察菌株在不同筛选平板上的生长情况。测定培养基2平板上菌株的R值，同时观察这些菌株在培养基1平板上的产酸变色情况，选择R值大于1.5且在培养基1平板上形成黄色产酸圈的菌株。
对新获得的诱变菌株进行发酵产长链二元酸的培养：将上述获得的通过氯丙嗪浓缩以及培养基筛选体系获得的诱变菌株在种子培养液中于30℃,200转/分钟的摇床上培养30小时；培养体积为20毫升；在种子培养基中生长完毕后，接种发酵培养基，接种量为10％，培养体积为50毫升，摇床转速为200转/分，温度为30℃，培养时间为120小时。发酵结束后，用6N的硫酸调节发酵液的pH值至2.0以下，使长链二元酸完全结晶析出，8000转/分钟，离心10分钟，去上清，过滤，并用蒸馏水将滤饼洗涤至中性，在90℃烘箱中烘干48小时，即可获得产品十三碳二元酸。
实施例4：
(1)应用硫酸二乙酯诱变假丝酵母，各项操作基本同实施例1中的(1)，但将硫酸二乙酯的处理用量改为1％，处理时间改为60分钟，并且应用200μl的硫代硫酸钠终止反应；
(2)应用紫外线诱变及氯丙嗪浓缩α、ω-氧化增强的假丝酵母，基本操作同实施例1中的(2)，但将氯丙嗪的用量改为1毫克/升；
(3)同实施例1中的(3)，应用培养基筛选体系筛选α、ω-氧化增强的菌株；
(4)同实施例1中的(4)，从含有氯丙嗪的YPD平板上共对应挑取菌株接种于培养基1和培养基2的菌株为200株，从中筛选出R值大于1.85及在培养基1显示黄色的菌株7株；
对新获得的诱变菌株进行发酵产长链二元酸的培养：将上述通过氯丙嗪浓缩以及培养基筛选体系获得的诱变菌株在种子培养液中于30℃,250转/分钟的摇床上培养24小时；培养体积为30毫升；在种子培养基中生长完毕后，接种发酵培养基，接种量为10％，培养体积为60毫升，摇床转速为250转/分，温度为30℃，培养时间为96小时。发酵结束后，用6N的硫酸调节发酵液的pH值至2.0以下，使长链二元酸完全结晶析出，8000转/分钟，离心10分钟，去上清，过滤，并用蒸馏水将滤饼洗涤至中性，在90℃烘箱中烘干48小时，即可获得产品十三碳二元酸。
实施例5：
(1)同实施例4中的(1)；
(2)同实施例1中的(2)；
(3)同实施例1中的(3)；在含有氯丙嗪的YPD平板上经过诱变后，共有117个菌株生长，再不含有氯丙嗪的YPD平板上经过诱变后，共有1124个菌落生长，说明氯丙嗪的浓缩效率为10倍；
(4)同实施例1中的(4)，通过培养基筛选体系从(3)中的117株菌株中获得了4株R值大于1.85且在培养基1平板上形成黄色产酸斑的假丝酵母；
所获得的菌株2-11,2-7,2-9,2-3，的产酸量分别为7.67g/L,7.10g/L,6.85g/L以及6.20g/L，其对应的R值分别为2.04,1.95,1.95,1.85；说明R值可以准确地反应菌株产酸能力的强弱。发酵结束后，用6N的硫酸调节发酵液的pH值至2.0以下，使长链二元酸完全结晶析出，8000转/分钟，离心10分钟，去上清，过滤，并用蒸馏水将滤饼洗涤至中性，在90℃烘箱中烘干48小时，即可获得产品十三碳二元酸。
实施例6：
(1)应用硫酸二乙酯诱变假丝酵母，各项操作基本同实施例1中的(1)，但将硫酸二乙酯的处理用量改为1.5％，处理时间为60分钟，处理菌液的浓度为3×108，体积为3毫升，应用300μl的硫代硫酸钠终止反应；
(2)紫外线诱变及氯丙嗪浓缩处理经过诱变的假丝酵母，采用的方法基本同实施例1中的(2)，但将氯丙嗪的用量改为3毫克/升：紫外线处理计量为5×105J/mm2；
(3)、(4)同实施例2中的(3)、(4)。
Claims (1)
1．一种高产长链二元酸的假丝酵母的筛选方法，其特征在于，该方法由以下步骤组成：
(1)、首先采用硫酸二乙酯诱变假丝酵母：从菌体的固体平板上挑取假丝酵母的单菌落，接种于装有20-30毫升麦芽汁培养基的300毫升的三角瓶中，在28-35℃的温度下于150-300转/分钟的摇床上培养24-48小时：将发酵菌液在离心机中2000-8000转/分离心3-10分钟，弃去上清液，用无菌水重新悬浮细胞，使细胞浓度达到1-8×108个/毫升：将上述菌液1-3毫升分装于5毫升的离心管中，2000-8000转/分钟离心3-10分钟，弃去上清液，用1-3毫升的pH7.0的0.1M的磷酸钠缓冲液重新悬浮细胞，混匀，吸取0.1-0.5毫升放置于4℃冰箱中作为对照；在剩余的的菌液中加入1-3％体积的硫酸二乙酯，混匀，在30℃的温度下于150-300转/分钟的摇床上处理20-60分钟，然后加入200-600μl的25％硫代硫酸钠，混匀，终止反应；将处理液在离心机上3000-6000转/分钟离心4-10分钟，沉淀细胞；
(2)、制备固体平板1，其组成为：酵母浸膏粉：10g/L，蛋白胨：20g/L，葡萄糖：20g/L，制备培养基1，其组成为：磷酸二氢钾：4g/L，葡萄糖：10g/L，磷酸氢二钠：2g/L，氯化钠：1g/L，酵母膏：1g/L，维生素B1:0.1g/L，尿素：2g/L，烷烃：20g/L；pH7.5，加入1-3％的8.3g/L浓度的酚红，制备培养基2：磷酸二氢钾：4g/L，葡萄糖：10g/L，磷酸氢二钠：2g/L，氯化钠：1g/L，酵母膏：1g/L，维生素B1:0.1g/L，尿素：2g/L，烷烃：20g/L；pH10.5，加入1-3％的10g/L浓度的百里香兰酚酞乙醇溶液，备用；
(3)、紫外线二次诱变酵母细胞及氯丙嗪浓缩α、ω-氧化增强的假丝酵母：将上述沉淀细胞用无菌水稀释至10-2-10-4，从中取0.1-0.4毫升稀释液分别涂于含有1-5毫克/升的氯丙嗪的固体平板1以及不含氯丙嗪的固体平板上，每个稀释度涂3-6个平板，紫外灯预热20到30分钟，以1-5×105J/mm2的计量处理上述平板，同时，设置不用紫外线处理的对照，平板处理完毕后，避光，在30-37℃培养48-120小时；
(4)、培养基系统筛选α、ω-氧化增强的假丝酵母：经过3处理的平板，选择致死率为50-90％且在含有氯丙嗪的培养基的条件下获得生长的菌株，分别一一对应的接种于培养基1和培养基2的平板上，在30-37℃培养120-168小时；
(5)、α、ω-氧化增强的假丝酵母的获得：经过4处理的菌株，首先，测定不同菌株在培养基2平板上的R值，选择R值大的菌株作为目的菌株，观察菌株的菌落在培养基2平板上的变色圈，选择其中显示黄色的菌株，结合在培养基1平板和培养基2平板上的情况，将在培养基1上显示黄色和R值大的菌株筛选出来，即为本发明的α、ω-氧化增强的假丝酵母。
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1999
- 1999-05-28 CN CN 99107779 patent/CN1233658A/zh active Pending
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