CN103243035B - 清酒假丝酵母及其发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及清酒假丝酵母新菌株及其发酵生产长链二元酸的方法。
Description
发明领域
本发明涉及清酒假丝酵母(Candidasake)及其发酵生产长链二元酸的方法。
背景技术
长链二元酸(LCDA也称为长链二羧酸和长链二酸)包括化学式HOOC(CH2)nCOOH的二元酸，其中n≥7。LCDA是一系列特种合成材料的基础单体原料。长链二元酸及其衍生单体可以用于生产特种尼龙、聚碳酸酯、粉末涂料、香料、热熔胶、特种润滑剂等，是合成香料、工程塑料、耐寒增塑剂、高级润滑油和聚酰胺热熔胶、粉末涂料等产品的重要原料。
本领域存在多种长链二元酸的化学合成方法，但使用方法不容易且大部分得到的是长链二元酸与短链二元酸的混合物。因此，用这些方法生产长链二元酸时需要进一步纯化步骤。本领域熟知可利用微生物转化烷烃、脂肪酸或其酯生产长链二元酸。由于现有生物方法的限制，化学合成仍然是生产长链二元酸的优选途径。
本领域一般使用几种酵母菌株进行发酵生产长链二元酸，当使用烷烃或脂肪酸作为碳源培养时，长链二元酸作为副产物产生。酵母对烷烃和脂肪酸进行新陈代谢时有三个生物化学过程：烷烃至脂肪酸的alpha-氧化，脂肪酸至alpha-，omega-二羧酸的omega氧化以及脂肪酸至CO2和水的降解型beta-氧化。相对于非生物转化方法，生产二元酸的生物转化方法具有多种潜在优势。其中主要在于使用可再生的原料作为起始材料以及生产二元酸过程中不产生有害化学副产物的能力。使用生物方法的另一重要优势在于这种方法可容易地调节以利用相同生物催化剂和相同设备生产多种二元酸。因为现有有机化学合成仅适于生产单种二元酸，几种不同二元酸合成将需要各二元酸的新的合成方案的开发。另一方面，酵母生物催化剂可以利用相同设备、培养基和步骤生产各种长度的二元酸，不同之处仅在于给酵母提供不同碳原子长度的底物。
虽然可以利用各种技术来提高现有的酵母例如热带假丝酵母(Candidatropicalis)发酵二元酸的产量，但还可以通过提供新的假丝酵母菌株以生产更高产量的长链二元酸，包括十二烷二酸、十三烷二酸、十四烷二酸、十五烷二酸和十六烷二酸。因此本发明的一个目的是提供新的菌株和利用这些菌株生产一种或多种长链二元酸的方法。使用该假丝酵母来生产长链二元酸可以完全取代化学合成法，而且具有产量高，低能耗，节约原材料的优点。
发明内容
在本发明一个实施方案中，提供了清酒假丝酵母CATH4013CCTCCM2011486。所述菌种于2011年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉武汉大学)，保藏编号为：CCTCCM2011486。
在本发明另一实施方案中，提供了利用所述清酒假丝酵母CATH4013CCTCCM2011486生产二元酸的方法，所述方法包括以下步骤：a.在含至少一种氮源和至少一种有机底物的培养基中培养清酒假丝酵母CATH4013；和b.回收从a步中培养的二元酸。
在本发明又一实施方案中，提供了利用所述清酒假丝酵母CATH4013CCTCCM2011486生产二元酸的方法，所述方法包括以下步骤：a.在含至少一种氮源和至少一种有机底物的培养基中培养清酒假丝酵母CATH4013，其中所述至少一种有机底物选自具有12至16个碳原子的烷烃或者12至16个碳原子的正烷烃；和b.回收从a步中培养的二元酸。
在上述实施方案中，所述二元酸为十二碳至十六碳二元酸中至少一种或者正十二碳至十六碳二元酸中至少一种。
在本发明又一实施方案中，提供了利用所述清酒假丝酵母CATH4013CCTCCM2011486生产二元酸的方法，所述方法包括以下步骤：a.在含至少一种氮源和正十三烷烃的培养基中培养清酒假丝酵母CATH4013；和b.回收从a步中培养的正十三烷二酸。
在上述实施方案中，本领域技术人员熟知可以使用的氮源。可使用各种有机氮和无机氮。有机氮源包括但不限于酵母膏、玉米浆、牛肉膏、豆粕水解液、蛋白胨、尿素、各种氨基酸及肽等，优选的氮源为尿素。无机氮源包括但不限于硝酸盐、氨水、液氨、铵盐、亚硝酸盐等。
清酒假丝酵母CATH4013CCTCCM2011486的用途，其主要用于生产长链二元酸的应用。
附图说明
图1所示为CATH4013的POX5基因的蛋白序列对比图。
图2所示为CATH4013的POX5基因DNA序列对比图。
图3所示为CATH4013的POX4基因的蛋白序列对比图。
图4所示为CATH4013的POX4基因DNA序列对比图。
图5所示为CATH4013的CYTb5基因的蛋白序列对比图。
图6所示为CATH4013的CYTb5基因DNA序列对比图。
图7所示为CATH4013的CYP52D2基因的蛋白序列对比图。
图8所示为CATH4013的CYP52D2基因DNA序列对比图。
图9所示为CATH4013的CYP52A12基因的蛋白序列对比图。
图10所示为CATH4013的CYP52A12基因DNA序列对比图。
图11所示为CATH4013的CYP52A15基因的蛋白序列对比图。
图12所示为CATH4013的CYP52A15基因DNA序列对比图。
具体实施方案
通过阅读下述详细说明，本领域技术人员将更易理解本发明的这些和其它实施方案、要素和优点。应理解，提供以下实施例以证明并进一步解释本发明的一些优选的实施方式和方面，不应被解释为限制其范围。
尽管与本文描述相似或相当的方法和材料可用于本公开的实践或试验，但本文描述了合适的方法和材料。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域技术人员通常理解的含义相同。如果有冲突，以本说明的定义为准。
当数量、浓度、或者其它值或参数以范围或者高低值列表给出时，应理解为特定公开任一对任意高低范围界限组成的所有范围，无论范围是否单独公开。当本文列举数值的范围，除非另外说明，该范围意在包括其端点，以及该范围内所有整数和分数。当定义范围时，无意将本发明的范围限于列举的特定值。
当用于本文时，术语“包含”、“包括”、“具有”或其任何其它变体，意在涉及非排他包含。例如，包含一系列要素的工艺、方法、物体、或装置并不必要地限于仅仅那些要素，而是可包括未特别列出的或此类工艺、方法、物体、或装置固有的其它要素。
本文中“一个”或“一种”用于描述多种要素和成分时仅为方便并提供本公开的一般含义。该描述应理解为包括一个或至少一个且单数也包括复数，除非明显其意在其它。
本文的材料、方法、和示例仅作说明用，除非特别说明，无意作为限制。
实施例
本文对部分术语定义如下：
活化培养基
采用称为“YPD培养基”的一种水溶液培养基，其包含如下成分：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取液，和20g/L蛋白胨。所述的“YPD培养基”含有培养基重量2％的琼脂，使培养基在室温下成凝胶状。所述YPD培养基通过水与1N氢氧化钠溶液将pH调节至7.0-7.5制备。将该培养基在121℃下灭菌20min。
摇瓶种子培养基
另一适于培养本发明菌株的培养基为“种子培养基″，其是一种水溶液培养基，包含如下成分：10-30g/L蔗糖，1.5-10g/L玉米浆液，1-10g/L酵母提取液，4-12g/LKH2PO4，0.5-5g/L脲，和0-50ml/L重蜡。所述培养基用水制备，并在121℃下灭菌20min。尿素单独灭菌，110℃下灭菌15分钟，冷却后与灭过菌的其他成分混合，作为种子培养基使用。
摇瓶发酵培养基
另一适于培养本发明菌株的培养基为“发酵培养基”，其是一种水溶液培养基，包含如下成分：1-10g/L玉米浆液，1-10g/L酵母提取液，5-12g/LKH2PO4，0-3g/L氯化钠，4-12g/L硝酸钾，10-40g/L蔗糖，0.5-3g/L脲，和200-300mL/L单一烷烃或者混合烷烃，0-1g/L丙烯酸，0-0.5g/L吐温80。所述通过水与1N氢氧化钠溶液将pH调节至7.5-7.8。将该培养基在121℃下灭菌20min。尿素单独灭菌，110℃下灭菌15分钟，冷却后与灭过菌的其他成分混合，作为发酵培养基使用。
根据本发明，菌株可用于各种发酵工艺中，包括500ml发酵摇瓶工艺，其包括如下：
用接种环将细胞在试管斜面中的灭菌的YPD培养基上均匀铺展开。将该斜面在稳定为29-30℃下培养2天。然后将该斜面培养物的三分之一接种装在500ml摇瓶中的30ml的灭菌种子培养基中并在温度为29-30℃下培养36-48小时，摇瓶速度为200-250rpm，摇动的幅度为2.5-3.5cm。然后将种子发酵的肉汤接种至装在500ml发酵瓶中的灭菌的发酵培养基。该培养物在温度为29-30℃下培养90-120小时，摇瓶速度为200-240rpm，摇动的幅度为2.5-3.5cm，并通过监测和用1N氢氧化钠溶液调节将pH维持在7.0-8.0之间。该发酵肉汤中的二羧酸浓度可在此步之后测定。
实施例1清酒假丝酵母的鉴定
从油田筛选了清酒假丝酵母(Candidasake)，经过化学诱变处理得到高产正十三碳二元酸的菌株。
清酒假丝酵母(Candidasake)的鉴定：
1.样品采集：山东省滨州市郊区胜利油田采集，为黑褐色原油污染土样。
2.采集标本的菌种分离：将采集到的所有土样分别制成稀释度为10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液分别在YPD平板上进行涂布。培养条件：30℃，48小时。
经多次分离培养，获得油田酵母菌的纯化单菌落。
3.鉴定
与《酵母菌的分类学研究》(TheYeasts：ATaxonomicStudy)第90章假丝酵母属(CandidaBerkhout)90.241清酒假丝酵母(Candidasake)比对(P1209)，确定是清酒假丝酵母。
3.1碳源和氮源的利用
在公知的微生物鉴定下进行营养物利用实验。在特定培养基中加入下列氮源或碳源，菌体培养2天或3天后，是否生长为判断条件，判断阴性与阳性，结果如下：
其它测试：以N-乙酰葡糖胺为碳源、氮源为(+)
在37℃下为(-)
脲酶为(-)
以此鉴定出该菌株为清酒假丝酵母(Candidasake)。
实施例2清酒假丝酵母CATH4013诱变筛选步骤
1.将一株分离得到的清酒假丝酵母，做成甘油管保藏待用。
2.取待用的保藏于低温冰箱的甘油管菌株一支放室温解冻，解冻后接入装有50mlYPD培养基的500ml三角瓶中，于29℃转速为210rpm的旋转摇床中培养20-24h。
3.在15ml的无菌离心管中加入上述10ml的YPD培养液，2000rpm离心2分钟，倒去上清液，用0.85％的生理盐水离心洗涤3次。
4.倒去上清液，加入2.5％的无菌氯化锂10ml，制备菌悬液。
5.称取0.08mg的NTG诱变剂加入15ml无菌离心管中，并加入10ml0.85％的生理盐水，混匀。
6.将3及4中的各10ml液体加入90mm的放有15mm*3mm搅拌子的无菌平皿中，盖好上盖。
7.上述平板按同样方法处理再制备2块
8.把该平皿放磁力搅拌器上分别搅拌处理10、15、20分钟。
9.每个处理平板分别按以下方法处理。
10.上述的处理液取10ml加入15ml无菌离心管中，2000rpm离心2分钟，倒去上清液，用0.85％的生理盐水离心洗涤3次。
11.倒去上清液，用0.85％的生理盐水进行逐级梯度稀释。
12.每稀释度吸取0.15ml菌液进行平板涂布。
13.涂布后的平板放29℃培养箱倒置培养3-4天。
14.挑取培养成熟的单菌转接入15*150mm试管斜面，放29℃培养箱培养2天。
15.斜面培养成熟后取三分之一斜面菌体接入装有10ml发酵培养基的250ml三角瓶中，于29℃转速为210rpm的旋转摇床中培养4天。剩余斜面放4℃冰箱冷藏。
16.计算对照菌株的摇瓶平均耗碱量及筛选菌株的耗碱量，确定所要筛选菌株的耗碱水平，一般比初筛对照菌株耗碱量提高10％以上。
17.按照发酵摇瓶耗碱量的多少确定进行再次复筛的菌株。
18.一般100株摇瓶初筛菌株中选取5株耗碱量高的菌株进行复筛。
19.选取复筛菌株对应的初筛斜面，上述接初筛后剩余的三分之二斜面，再铲取五分之一斜面菌体转接斜面F2，放29℃培养箱培养2天。剩余斜面继续放冰箱冷藏。
20.培养成熟的斜面菌体整支全部接入装有30ml种子培养基的500ml三角瓶中，于29℃转速为210rpm的旋转摇床中培养44-48h。同时将对照菌株的1支甘油管菌液也全部接入1个种子摇瓶中。
21.培养成熟后的种子液吸取3ml加入装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于29℃转速为210rpm的旋转摇床中培养110h放瓶测定。一般每个种子瓶对应接2瓶发酵液。
22.复筛摇瓶测定方法：酸碱滴定法
23.经多次筛选得到高产十三碳二元酸的菌株，命名为CATH4013。
根据热带假丝酵母二元酸代谢途径，选定15个与生产二元酸有关的基因，具体如下：CYP52A12，CYP52A13，CYP52A14，CYP52A15，CYP52A16，CYP52A17，CYP52A18，CYP52A19，CYP52A20，CYP52D2，POX4，POX5，CPRA，CPRB，和CYTb5。将清酒假丝酵母CATH4013送到专业测序机构，采用Illumina平台末端配对测序法进行了全基因组测序，并从基因组序列中提取出与这15个热带假丝酵母基因同源的基因序列。发现本发明清酒假丝酵母CATH4013CCTCCM2011486在如下基因与热带假丝酵母的同源基因有区别：CYP52A12、CYP52A15、CYP52D2、POX4、POX5和CYTb5。基因序列对比见图1-图12。
实施例3正十三烷烃发酵
发酵物中二元酸测试方法：
二元酸样品的制备：发酵终了，在500mL三角瓶中，用6mol/L盐酸溶液调pH值至3.0，每瓶加入120mL乙醚，摇动100次，放置30min以上，静置分层，取出40mL乙醚提取液，加到100mL烧杯中，除去乙醚，得到白色固体。然后进行二元酸的测定。
确定二元酸的长度，或是否有一元酸，则需要通过气相色谱法GC，即将产物处理后，经过毛细管柱进行分离，不同碳链长度的二元酸和一元酸，在不同时间出峰，因此就可以确定最终产物。例如：色谱仪器型号(GC9800)：毛细管柱FFAP30*0.53mm*0.5um，检测器FID，确定最终产物是以保留时间Rf与标准品作对照得出的，标准品是Sigma或TGI公司产的AR试剂。
二元酸产量的测定：将提取得到的白色固体，加入100mL内标溶液(含有4mg/mL己二酸的四甲基氢氧化铵溶液)，当提取得到的白色固体全部溶解后，进气相色谱，记录内标和样品的面积比；同时称取标准品(不同碳链长度的二元酸标准品，购自Sigma或TGI试剂公司)0.4000g左右，加入100mL内标溶液(含有4mg/mL己二酸的四甲基氢氧化铵溶液)，当标准品全部溶解后，进气相色谱，记录标准品和样品的面积比；根据气相色谱法中的面积归一法计算以及面积比计算，即可得到不同碳链长度的二元酸含量。通过气相色谱法得到已知质量的标准品与内标物的面积比，进而得到面积比与质量比的关系。再通过气相色谱法得到样品与内标物的面积比，根据前述面积比与质量比的关系和内标物的质量，得到样品的质量。
500ml摇瓶发酵工艺流程及描述：
斜面种子培养-摇瓶种子培养-摇瓶发酵
斜面种子培养：4℃冰箱保藏的冻干管斜面转接斜面，29℃培养箱中培养48h后转接种子摇瓶，种子培养在29℃摇床间，230rpm，培养48小时后发酵。发酵摇瓶接入3.0mL的种子，接种后，摇瓶放29℃摇床间，230rpm振荡培养90-110h后放瓶测定产酸量。
本实施例中使用的培养基具体如下：
斜面种子培养基：
20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取液和20g/L蛋白胨，以及为YPD培养基重量的2％的琼脂。添加琼脂目的在于使培养基在室温下成凝胶状。
摇瓶种子培养基如下：
| 名称 | 配比 |
| 蔗糖 | 20g/L |
| 玉米浆 | 3g/L |
| 酵母膏 | 5g/L |
| KH2PO4 | 8g/L |
| 重蜡 | 50ml/L |
| 尿素(单独灭菌) | 3g/L |
按照种子培养基配比表称取各种原材料并记录称取的量，称取完毕后用自来水原材料完全溶解，定量加液器分装，30mL/个500mL摇瓶，分装，分装后用1.0mL移液枪往摇瓶加入1.5ml的重蜡，6层纱布和牛皮纸包扎后121℃下灭菌20min，备用。
发酵培养基：
| 名称 | 配比 |
| 玉米浆 | 2.5g/L |
| 酵母膏 | 2g/L |
| KNO3 | 9g/L |
| NaCl | 1g/L |
| 蔗糖 | 30g/L |
| KH2PO4 | 8g/L |
| 正十三烷烃 | 23ml/L |
| 尿素(单独消毒) | 1g/L |
按照发酵培养基配比称取各种原材料并记录称取的量，称取完毕后用自来水使原材料完全溶解，用碱液调节pH到7.5，15mL/个500mL摇瓶，发酵培养基中加入正十三烷烃，用6层纱布和牛皮纸包扎后121℃下灭菌20min，备用。
500ml摇瓶发酵结果：
单一烷烃500ml摇瓶发酵结果：
| 菌株 | 二元酸种类 | 产酸量g/L |
| CAT H4013 | 正十三碳 | 74.47 |
实施例4混合烷烃发酵
混合烷烃为正十二烷烃、正十三烷烃、正十四烷烃、正十五烷烃和正十六烷烃(nC12+nC13+nC14+nC15+nC16)等体积混合。发酵培养基如下：
| 名称 | 配比 |
| 玉米浆 | 2.5g/L |
| 酵母膏 | 2g/L |
| KNO3 | 9g/L |
| NaCl | 1g/L |
| 蔗糖 | 30g/L |
| KH2PO4 | 8g/L |
| 混合烷烃 | 23ml/L |
| 尿素(单独消毒) | 1g/L |
发酵过程、发酵物中二元酸种类和产量测试均与实施例3相同。
混合烷烃500ml摇瓶发酵结果：
Claims (7)
1.清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4013，其保藏号为CCTCCM2011486。
2.制备二元酸的方法，所述方法包括以下步骤：a.在含至少一种氮源和至少一种有机底物的培养基中培养如权利要求1所述的清酒假丝酵母CATH4013；和b.回收从a步中培养的二元酸，
其中所述至少一种有机底物选自具有12至16个碳原子的正烷烃，所述二元酸为正十二烷二酸、正十三烷二酸、正十四烷二酸、正十五烷二酸和正十六烷二酸中至少一种。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述至少一种有机底物为正十三烷烃。
4.如权利要求2-3中任一项所述的方法，其中所述氮源为有机氮源或者无机氮源。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述的有机氮源为酵母膏、玉米浆、牛肉膏、豆粕水解液、蛋白胨、尿素、各种氨基酸及肽中的一种或多种。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述的无机氮源为硝酸盐、氨水、铵盐中的一种或多种。
7.如权利要求1所述清酒假丝酵母在生产正十二碳至正十六碳二元酸中的应用。
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