CN101407773B - 恶臭假单胞菌gna5菌株及其制备d-氨基葡萄糖酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及恶臭假单胞菌GNA5菌株及其制备D-氨基葡萄糖酸的方法，利用筛选并保藏的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)GNA5菌株(即CCTCCM208138)，通过氧化发酵或者静息细胞转化法，可以高效地将D-氨基葡萄糖转化成D-氨基葡萄糖酸。本发明解决了微生物转化D-氨基葡萄糖制备D-氨基葡萄糖酸的过程中，菌株不能耐受高浓度D-氨基葡萄糖及对产物D-氨基葡萄糖酸代谢能力强的问题。
Description
技术领域
本发明属于应用微生物领域，具体涉及一种恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)GNA5菌株及其制备D-氨基葡萄糖酸的方法。
背景技术
D-氨基葡萄糖酸(D-Glucosaminic acid)，化学名为2-氨基-3，4，5，6-四羟基己酸，是一种很有前景的调味料，可以作为具有抗病毒、抗肿瘤效果的手性氨基酸衍生物等的合成原料。该物质生物相容性好，与金属铬离子形成的配合物，具有医用降糖作用；与金属铂形成的配合物在治疗癌症方面有较好的应用前景。除此之外，D-氨基葡萄糖酸作为一种阳离子配位剂，有望在带电生物分子的色谱分离中得到广泛应用。
现有报道中D-氨基葡萄糖酸的制备方法有三种：化学氧化法，Pringsheim(Chem.Ges.，48：680-682.)等报道了采用醋酸汞氧化D-氨基葡萄糖(D-glucosamine)来制备，但该法氧化程度不易控制，选择性差，收率低；酶转化法，Pezzotti等(Carbohydr.Res.，340：139-141)利用葡萄糖氧化酶耦联过氧化氢酶，以D-氨基葡萄糖为原料制备D-氨基葡萄糖酸，但葡萄糖氧化酶对D-氨基葡萄糖的催化效率只有葡萄糖的2％，该研究利用大量增加酶的用量或延长反应时间可有效提高催化效率，经过72小时酶反应，收率达76％；微生物法制备D-氨基葡萄糖酸因转化率较高而受到关注，但发酵中高浓度底物D-氨基葡萄糖对菌株及相关转化酶有一定的抑制，现有报道中发酵氧化法的底物浓度不超过10g/L(Jap.Pat：S59-014787.1984-01-25；Appl.Microbiol.Biotechnol.，66：253-258)。其次，一般来说，产D-氨基葡萄糖酸的菌株具有进一步分解代谢产物的能力，往往需要添加α-溴代丙酸钠等抑制剂来促进产物的积累(Jap.Pat：S59-014787.1984-01-25)。Moonmangmee等利用高浓度的干燥后Gluconobacter frateurii IFO3246菌体，有效地克服了底物抑制等现象；转化体系中，底物D-氨基葡萄糖盐酸盐的浓度为100g/L，Gluconobacter frateurii IFO 3246的添加量为0.1g干菌体/g底物，摩尔转化率达到80％以上。由于菌体添加量大，带来了副反应，使得转化率并不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)GNA5菌株并用其制备D-氨基葡萄糖酸的方法，解决氧化发酵D-氨基葡萄糖制备D-氨基葡萄糖酸过程中，菌株不能耐受高浓度D-氨基葡萄糖及对产物D-氨基葡萄糖酸代谢能力强的问题。
本发明以D-氨基葡萄糖盐酸盐为唯一碳源和能源对不同来源的土样进行筛选，共选得若干株能快速代谢D-氨基葡萄糖的菌株，再从其中筛选到能够转化D-氨基葡萄糖制备D-氨基葡萄糖酸的菌株。其间采用纸层析法检测不同培养时间发酵液中D-氨基葡萄糖酸的生成情况，选取转化率高的菌株Pseudomonasputida GNA5。该菌株已送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为保藏号：CCTCCNO：M208138，保藏日期为2008年9月27号。
本发明筛选到的Pseudomonas putida GNA5菌株为革兰氏阴性菌，无芽孢，杆状。经BIOLOG全自动细菌鉴定仪鉴定，表明该菌株与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)相似度(sim)为0.82，经16S rDNA序列分析表明该序列与菌株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)M G-Y2同源性高达99％。因此，该菌株为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)GNA5。
迄今为止，没有文献报道恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)能够积累D-氨基葡萄糖酸
本发明在不添加任何抑制剂的情况下，将筛选得到的菌株Pseudomonasputida GNA5，在含有D-氨基葡萄糖的培养基中氧化发酵直接积累D-氨基葡萄糖酸。
所述D-氨基葡萄糖可以D-氨基葡萄糖盐酸盐或者D-氨基葡萄糖硫酸盐的形式添加。
D-氨基葡萄糖盐酸盐或D-氨基葡萄糖硫酸酸盐可先配制成水溶液，再用NaOH调节pH至6.5-7.5，然后添加入培养基。
所述培养基中碳氮源的含量≤25g/L，其中碳源优选糖类，尤其是葡萄糖，添加量≤10g/L；其中的氮源是无机和有机氮，无机氮源可为氯化铵或硝酸铵，含量≤5g/L；有机氮源可为酵母粉、尿素、蛋白胨或牛肉膏，添加量≤10g/L。
添加入培养基中的D-氨基葡萄糖盐酸盐或者D-氨基葡萄糖硫酸盐浓度小于等于0.4mol/L时，可以获得较高的转化率。
所述培养基中还包含以下成份：缓冲剂磷酸二氢钾，含量≤5g/L；pH调节剂碳酸钙含量为5-30g/L；生长因子的微量元素镁盐，例如可选用七水合硫酸镁；发酵液初始pH为4.5—8.5。
菌种接种量(体积百分比)一般为1％-10％，在100-200转/分钟转速搅动下，保持温度在25-40℃，发酵时间一般为40-80小时。
本发明提供另外一种制备D-氨基葡萄糖酸的方法，即采用Pseudomonasputida GNA5菌株的静息细胞转化D-氨基葡萄糖制备D-氨基葡萄糖酸，包括：(1)将Pseudomonas putida GNA5菌株进行常规培养，发酵，获得静息细胞；(2)将D-氨基葡萄糖配制成溶液为生物转化底物；(3)将(1)静息细胞，加入(2)的底物溶液进行转化反应，生成D-氨基葡萄糖酸。
Pseudomonas putida GNA5菌株发酵培养基中以葡萄糖作为碳源，发酵时间优选稳定期初期。将获得的静息细胞，用低温的生理盐水洗去表面残留物。反应中的D-氨基葡萄糖可以D-氨基葡萄糖盐酸盐或者D-氨基葡萄糖硫酸盐形式添加；底物浓度小于等于0.7mol/L，静息细胞的加入量0.02—0.2g/mM底物，转化反应温度为25-40℃，转化反应时间为1-48小时。
综上所述，本发明筛选到了Pseudomonas putida GNA5菌株，该菌株能够耐受高浓度D-氨基葡萄糖且对产物D-氨基葡萄糖酸代谢能力极弱，能够通过氧化发酵法及静息细胞转化法制备D-氨基葡萄糖酸，转化率高，是优良的生产菌株。
附图说明
图1是分离菌株发酵液的纸层析图。其中1：50mg/L D-氨基葡萄糖和5mg/LD-氨基葡萄糖酸标准品；2：培养基；3：菌株Pseudomonas putida GNA5的发酵液上清；4：菌株GNA7的发酵液上清。
具体实施例
实施例1
本实验说明高产D-氨基葡萄糖酸天然生产菌株的筛选程序。
筛选培养基配方(g/L)为：D-氨基葡萄糖盐酸盐10、CaCO3 3、磷酸二氢钾1、七水合硫酸镁0.5、硝酸钠1、酵母粉0.5，pH7.0。取少量不同来源的土样加入到筛选培养基中，在30℃，120转/分钟下振荡培养，装液量10ml/试管(25*200mm)培养5～7天，其间用无菌蒸馏水补充蒸发损失水分；取富集培养液0.1ml，转接入新鲜的无菌筛选培养基中，转接富集培养3代，并采用纸层析法检测富集培养液中D-氨基葡萄糖的消耗及D-氨基葡萄糖酸的生成。
平板培养基配方(g/L)为：葡萄糖10、磷酸二氢钾2、NH4NO3 2、七水合硫酸镁0.5、酵母粉5、琼脂18，pH7.0。将富集培养液稀释涂布于平板培养基上，30℃培养1～2天；挑选生长良好、不同形态的菌落进行画线分离，获得单一菌株。将单一菌株分别接入新鲜的无菌筛选培养基中进行复筛，其间测定发酵液中D-氨基葡萄糖及D-氨基葡萄糖酸的含量，选择D-氨基葡萄糖消耗快或积累D-氨基葡萄糖酸能力较强的菌株。
从附图1中可以看到，菌株GNA5的氧化发酵培养液中有D-氨基葡萄糖酸存在，且D-氨基葡萄糖的斑点较小较淡，说明菌株GNA5能够转化D-氨基葡萄糖制备D-氨基葡萄糖酸，且具有较高的转化能力，至此，筛选到目标菌株。采用BIOLOG全自动细菌鉴定仪鉴定及16S rDNA序列分析，表明该菌株为Pseudomonas putida，命名为Pseudomonas putida GNA5。
上述筛选过程中，培养液中的D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖酸采用纸层析法检测，方法如下：展开剂为乙醇：冰醋酸：水＝6:1:1(体积比)；取富集培养液或者纯菌株的发酵液2μl，用微量进样器点样于滤纸上；纸层析结束后吹干滤纸，喷洒0.2％茚三酮溶液并在95℃加热5分钟显色。底物D-氨基葡萄糖与产物D-氨基葡萄糖酸的斑点均呈紫红色，比移值(Rf)分别为0.65和0.21。
实施例2
本实验说明利用Pseudomonas putida GNA5菌株氧化发酵制备D-氨基葡萄糖酸的方法。
(1)Pseudomonas putida GNA5菌株在培养基A中氧化发酵制备D-氨基葡萄糖酸。
培养基的A配制：
1.将D-氨基葡萄糖盐酸盐或D-氨基葡萄糖硫酸盐配制成浓度为0.9mol/L的浓溶液，采用过滤灭菌法除菌(选用0.22μm膜)。
2.配制培养基的其余部分(g/L)：葡萄糖5、磷酸二氢钾1、七水合硫酸镁0.5、碳酸钙20、尿素3、酵母粉2，初始pH＝6.5。之后，在121℃灭菌15分钟。
3.将步骤1和2所得溶液在无菌环境下混合，使D-氨基葡萄糖盐酸盐或D-氨基葡萄糖硫酸盐的终浓度为0.35mol/L。
Pseudomonas putida GNA5菌株在培养基A中氧化发酵，其接种量为4％(体积百分数)，培养温度为30℃，摇床转速180转/分钟。发酵70小时可制备34.1g/LD-氨基葡萄糖酸，摩尔转化率为49.87％。
培养基A配制中步骤1的D-氨基葡萄糖盐酸盐或D-氨基葡萄糖硫酸盐浓溶液，也可以用NaOH调节pH至6.5—7.5，然后再过滤灭菌。
(2)Pseudomonas putida GNA5菌株在培养基B中氧化发酵。
培养基B的配制：
1.将D-氨基葡萄糖盐酸盐/D-氨基葡萄糖硫酸盐配制成浓度为0.9mol/L的浓溶液，采用过滤灭菌法除菌(选用0.22μm膜)。
2.配制培养基的其余部分(g/L)：葡萄糖5、尿素5、磷酸二氢钾2、七水合硫酸镁0.5、碳酸钙10，pH＝7.0。之后，在121℃灭菌15分钟。
3.将步骤1和2所得溶液在无菌环境下混合，使D-氨基葡萄糖盐酸盐/D-氨基葡萄糖硫酸盐的终浓度为0.14mol/L。
Pseudomonas putida GNA5菌株在培养基B中氧化发酵，其接种量为6％(体积百分数)，培养温度为30℃，摇床转速180转/分钟。发酵48小时可制备25g/L D-氨基葡萄糖酸，摩尔转化率为91.33％。
培养基B配制中步骤1的D-氨基葡萄糖盐酸盐或D-氨基葡萄糖硫酸盐浓溶液，也可以用NaOH调节pH至6.5—7.5，然后再过滤灭菌。
(3)D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖酸的检测方法
本实验中，D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖酸采用高效液相色谱法(HPLC)定量检测。发酵液在6000转/分钟，4℃条件下离心15min后，获得上清液，用于HPLC分析。采用戴安(Dionex)高效液相色谱仪，色谱条件：色谱柱为ShodexAsahipak NH2P-504E氨基柱；流动相为乙腈：0.01M醋酸铵＝40:13(体积比)；流速，0.5mL/min；检测器，RI-101示差折光检测器；柱温，30℃。
实施例3
本实验说明利用Pseudomonas putida GNA5菌株的静息细胞制备D-氨基葡萄糖酸的方法。
发酵培养基组成(g/L)为：葡萄糖7、尿素7、玉米浆2(v/L)、磷酸二氢钾2、蛋白胨5、七水合硫酸镁0.5，pH＝7.0。将恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)GNA5菌株以10％(体积百分数)的接种量接种于发酵培养基，培养温度为30℃，摇床转速180转/分钟，当发酵时间达8小时，在无菌条件下，向培养液中加入无菌的D-氨基葡萄糖盐酸盐/D-氨基葡萄糖硫酸盐，使其终浓度为25mM/L。当发酵时间为24小时，停止发酵。将发酵液在8000转/分钟，4℃条件下离心15min，获得初步的静息细胞。将该静息细胞用4℃的浓度为50mM，pH7.0的磷酸缓冲液悬浮后再次以同样的条件离心，重复两次，可获得转化用的静息细胞。
在静息细胞中，按照0.1g细胞/mM底物添加生物转化底物(相当于0.045g干细胞/g D-氨基葡萄糖盐酸盐)，在30℃下振荡反应10小时，生成D-氨基葡萄糖酸，转化率达到90％。
实施例4
本实验说明利用Pseudomonas putida GNA5菌株制备的产物的纯化与结构验证。
将发酵液在6000转/分钟，4℃条件下离心15min后，获得上清液；在此上清液中加入等体积的乙醇，在4℃冰箱内放置过夜，抽滤得白色结晶状物质。将该白色结晶状物质溶于水，再次乙醇沉淀获得高纯度的产物。对高纯度的产物进行核磁共振谱(1H-NMR、13C-NMR)分析，以D-氨基葡萄糖酸标准品(纯度>97％)核磁共振谱为参照。
本研究所制结晶产物的核磁共振波谱图与日本东京化成株式会社提供的97％纯度的D-氨基葡萄糖酸标准品图谱完全一致，表明Pseudomonas putida GNA5氧化D-氨基葡萄糖所得产物为D-氨基葡萄糖酸。
Claims (9)
1.一种转化D-氨基葡萄糖制备D-氨基葡萄糖酸的菌株，其特征在于该菌株是恶臭假单胞菌GNA5菌株，已由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号：CCTCC NO：M 208138。
2.一种用权利要求1所述菌株制备D-氨基葡萄糖酸的方法，其特征在于将所述的恶臭假单胞菌GNA5菌株置于含有D-氨基葡萄糖的培养基中氧化发酵直接积累D-氨基葡萄糖酸，所述D-氨基葡萄糖以D-氨基葡萄糖盐酸盐或者D-氨基葡萄糖硫酸盐的形式添加，所述培养基中的D-氨基葡萄糖盐酸盐或者D-氨基葡萄糖硫酸盐浓度小于等于0.4mol/L。
3.根据权利要求2所述的制备D-氨基葡萄糖酸的方法，其特征在于所述的培养基中碳氮源的含量小于等于25g/L。
4.根据权利要求3所述的制备D-氨基葡萄糖酸的方法，其特征在于所述的碳源为糖类物质。
5.根据权利要求4所述的制备D-氨基葡萄糖酸的方法，其特征在于所述的糖为葡萄糖。
6.根据权利要求2所述的制备D-氨基葡萄糖酸的方法，其特征在于所述的D-氨基葡萄糖盐酸盐或者D-氨基葡萄糖硫酸盐先配制成水溶液，再用NaOH调节pH至6.5-7.5，然后添加入培养基。
7.一种用权利要求1所述菌株制备D-氨基葡萄糖酸的方法，包括：
(1)将权利要求1所述的恶臭假单胞菌GNA5菌株，在培养基中进行常规培养，获得静息细胞；
(2)将D-氨基葡萄糖配制成溶液，作为生物转化底物，该底物浓度小于等于0.7mol/L；
(3)将(1)所得静息细胞加入(2)的底物溶液中进行转化反应，生成D-氨基葡萄糖酸，所述静息细胞的加入量为0.02-0.2g/mM底物，转化反应温度为25-40℃，转化反应时间为1-48小时。
8.根据权利要求7所述的制备D-氨基葡萄糖酸的方法，其特征在于步骤(1)中恶臭假单胞菌GNA5菌株发酵用的培养基以葡萄糖为碳源。
9.根据权利要求7所述的制备D-氨基葡萄糖酸的方法，其特征在于所述生物转化底物中的D-氨基葡萄糖以D-氨基葡萄糖盐酸盐或者D-氨基葡萄糖硫酸盐的形式添加。
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