CN102071226A - 长链二元酸制备过程中的串罐发酵工艺 - Google Patents

长链二元酸制备过程中的串罐发酵工艺 Download PDF

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曹务波
王志洲
葛明华
陈远童
傅深展
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Abstract

本发明属于长链二元酸制备过程中的发酵技术领域，尤其涉及长链二元酸制备过程中的串罐发酵工艺，本发明中每个发酵罐的种子都直接来源于前一个发酵罐的发酵液，而不经过逐级扩大培养，依次类推。取发酵液的一部分作为种子接种到另一发酵罐进行培养发酵，依次类推，进行串罐发酵培养，能够缩短周期，提高设备的利用率，并且微生物发酵稳定高产长碳链二元酸。

Description

长链二元酸制备过程中的串罐发酵工艺 
技术领域
本发明属于长链二元酸制备过程中的发酵技术领域，尤其涉及长链二元酸制备过程中的串罐发酵工艺，即在生产长碳链二元酸的过程中通过串罐技术用微生物三阶段同步发酵正构烷烃高产相应碳链二元酸的工艺。 
背景技术
长碳链二元酸(Long chain dicarboxy acids)是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸(简称DCn或DCA)，包括饱和及不饱和二羧酸，是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品，是化学工业中合成高级香料、高性能工程塑料、高温电介质、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级油漆和涂料等重要原料。发酵法生产DCA是七十年代兴起的微生物发酵技术在石油化工领域的应用。它以原料来源广、反应专一性强和反应条件温和等优点逐渐取代了传统的化学合成法，在国内外受到了普遍的重视。为以DCA为原料的精细化工新材料产业的发展开辟了广阔的空间。 
在生物法生产长碳链二元酸的过程中，长碳链二元酸的产品收率通过提取、精制技术的改进进一步提升的空间非常有限，降低长碳链二元酸生产成本的潜力在发酵技术的提高。如何提高生产菌株的产酸水平是每个生产厂家研究的重点。目前，生物法发酵生产DCA都采用歇间式分批培养发酵，种子培养需采取逐级扩大的方法，即从斜面到摇瓶，再依次经过一级和二级种子罐逐级培养后，转入发酵罐进行目的产物生产。这种培养方式，种子培养累计需要3～5天，造成设备利用率降低，由于转种的次数多，在转种的过程中种子发生染菌的机率大大增加，同时，发酵批次之间产酸水平波动较大，造成生产不稳定。 
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供了一种新的以微生物发酵稳定高产长碳链二元酸的方法。 
DCA的发酵过程分为菌种培养和发酵产酸两个阶段。一般种子培养pH值应控制在4～6，当菌培养到一定浓度后转入到发酵罐中培养，发酵初期以菌体生长为主，应控制pH值在4～6；当菌体长到一定浓度后，光密度OD在1.0以上，再将pH值上调到6.5～8.5，以产酸为主。菌体由生长期转入发酵产酸期称为转发酵，菌种培养是发酵生产DCA的关键步骤。 
串罐发酵即将在发酵罐中生长良好的发酵液接种到另一只发酵罐中继续培养发酵。一般取生长旺盛，产酸速度快时期的发酵液。时间：发酵培养至20～60小时，光密度(OD620)大于0.8，发酵强度大于1.25g/1.h，取发酵液的一部分作为种子接种到另一发酵罐进行培养发酵，依次类推，进行串罐发酵培养。 
本发明中生产长碳链二元酸过程中的串罐发酵工艺具体步骤为： 
1)种子培养： 
其中，所采用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)， 
一级种子培养基的配方为： 
玉米浆：0.15～0.6％、酵母膏：0.2～0.5％、尿素：0.1～0.4％、蔗糖：2～3％、KH2PO4：0.6～1.0％、消泡剂：0.02～0.07(v/v)，蜡油：3～5％。 
控制条件：罐温：27～29℃，通风比：1∶0.5～0.7vvm，罐压：0.09～0.11Mpa，PH：4.5～6.5，培养时间：20～30小时，OD620大于0.60。 
二级种子培养基的配方为：玉米浆：0.15～0.6％、酵母膏：0.2～0.5％、尿素：0.1～0.4％、蔗糖：2～3％、KH2PO4：0.6～1.0％、消泡剂：0.02～0.07(v/v)。 
控制条件：罐温：27～30℃，通风比：1∶0.4～0.8vvm，罐压：0.09～0.11Mpa，PH：4.5～6.5，培养时间：12-18小时，OD620大于0.60。 
2)发酵串罐培养 
发酵罐培养基的配方为： 
玉米浆：2～7％、Nacl：0.1～0.3％、酵母膏：0.15～0.3％、尿素：0.1～0.25％、葡萄糖：3～7％、蔗糖：0.5～2％、KNO3：1.0～2％、KH2PO4：0.5～2％、细胞调节剂：3～7％、乳化剂：0.001～0.05(v/v)％、消泡剂：0.03％(v/v)。 
发酵控制条件： 
接种量：8～10％，罐温：28～30℃，通风比：1∶0.4～0.7vvm，罐压：0.03～0.12Mpa，8小时后开始流加葡萄糖，发酵液中葡萄糖浓度控制在0.5～3％，OD620大于1.0时停止葡萄糖流加，开始流加烷烃，PH：加烷烃前4.0～6.0，加烷烃后6.5～7.5，培养至72～80小时，光密度(OD620)大于0.8，发酵强度大于1.25g/1.h，无杂菌，可取少量部分发酵作为下一发酵罐的种子，接入发酵液的发酵罐在菌种的培养时期，PH控制4～6。 
以后每个发酵罐的种子都直接来源于前一个发酵罐的发酵液，而不经过逐级扩大培养，依次类推。原发酵罐继续发酵至120～165小时，残烃为0％，结束发酵。 
发酵工艺示意图如附图1所示： 
图中I和II分别表示2种规格的种子罐，工业发酵中分别为2M3和30M3，①，②，③□□n代表发酵罐。从斜面到摇瓶，再依次经过二级种子罐的培养后转入发酵罐①是传统的逐级种子培养方式。发酵罐②的种子液直接从发酵罐①接入，发酵罐③的种子液从罐②接入，以此类推。因此，②和③以后各批发酵罐的种子不再进行逐级培养，而取自上一发酵罐的部分发酵液进行串罐发酵培养。 
取种时间的选择： 
按传统的间歇式发酵理论，随着发酵的进行，细胞代谢物会对微生物造成毒害，菌体也将逐步衰老、死亡。特别是到发酵后期，随着细胞自溶，菌体浓度将下降。因此，取种时机至关重要，取发酵培养至40～60小时发酵液作为种子最佳。判断标准，光密度OD620在0.8以上，发酵强度为1.41g/l.h，镜检，无杂菌。 
正常情况下，一个循环可以循环30～50批次。 
本发明的有益效果为：缩短了发酵生产周期，提高了设备的利用率；稳定了发酵生产，减少了染杂菌的机率；提高了发酵的转化率5％以上；单罐产量提高了10％以上。 
附图说明
图1为发酵工艺示意图 
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，但是本发明不以具体实施例为限。 
实施例1 
发酵串罐培养 
发酵罐培养基的配方为： 
玉米浆：2％、Nacl：0.1％、酵母膏：0.15％、尿素：0.1％、葡萄糖：3％、蔗糖：0.5％、KNO3：1.0％、KH2PO4：0.5％、细胞调节剂：3％、乳化剂：0.001(v/v)％、消泡剂：0.03％(v/v)。 
发酵控制条件： 
接种量：8％，罐温：28℃，通风比：1∶0.4vvm，罐压：0.03Mpa，8小时后开始流加葡萄糖，发酵液中葡萄糖浓度控制在0.5％，OD620为1.03时停止葡萄糖流加，开始流加烷烃，PH：加烷烃前4.0，加烷烃后6.5，培养至72小时，光密度(OD620)为0.9，发酵强度1.35g/l.h，无杂菌，可取少量部分发酵作为下一发酵罐的种子，接入发酵液的发酵罐在菌种的培养时期，PH控制4。 
实施例2 
发酵串罐培养 
发酵罐培养基的配方为： 
玉米浆：3％、Nacl：0.2％、酵母膏：0.2％、尿素：0.15％、葡萄糖：4％、蔗糖：1％、KNO3：1.3％、KH2PO4：0.8％、细胞调节剂：4％、乳化剂：0.001(v/v)％、消泡剂：0.03％(v/v)。 
发酵控制条件： 
接种量：9％，罐温：29℃，通风比：1∶0.5vvm，罐压：0.08Mpa，8小时后开始流加葡萄糖，发酵液中葡萄糖浓度控制在1.7％，OD620为1.0时停止葡萄糖流加，开始流加烷烃，PH：加烷烃前5.0，加烷烃后7.0，培养至75小时，光密度(OD620)为0.9，发酵强度为1.26g/l.h，无杂菌，可取少量部分发酵作为下一发酵罐的种子，接入发酵液的发酵罐在菌种的培养时期，PH控制4～6。 
实施例3 
发酵串罐培养 
发酵罐培养基的配方为： 
玉米浆：5％、Nacl：0.3％、酵母膏：0.3％、尿素：0.25％、葡萄糖：7％、蔗糖：2％、KNO3：2％、KH2PO4：2％、细胞调节剂：7％、乳化剂：0.05 (v/v)％、消泡剂：0.03％(v/v)。 
发酵控制条件： 
接种量：10％，罐温：30℃，通风比：1∶0.7vvm，罐压：0.12Mpa，8小时后开始流加葡萄糖，发酵液中葡萄糖浓度控制在3％，OD620为1.0时停止葡萄糖流加，开始流加烷烃，PH：加烷烃前6.0，加烷烃后7.5，培养至80小时，光密度(OD620)为0.92，发酵强度为1.31g/l.h，无杂菌，可取少量部分发酵作为下一发酵罐的种子，接入发酵液的发酵罐在菌种的培养时期，PH控制6。 
实施例4 
发酵串罐培养 
发酵罐培养基的配方为： 
玉米浆：4％、Nacl：0.3％、酵母膏：0.25％、尿素：0.18％、葡萄糖：5％、蔗糖：1.7％、KNO3：1.8％、KH2PO4：1.5％、细胞调节剂：6％、乳化剂：0.05(v/v)％、消泡剂：0.03％(v/v)。 
发酵控制条件： 
接种量：9％，罐温：29℃，通风比：1∶0.6vvm，罐压：0.09Mpa，8小时后开始流加葡萄糖，发酵液中葡萄糖浓度控制在2.5％，OD620为1.1时停止葡萄糖流加，开始流加烷烃，PH：加烷烃前5.0，加烷烃后7.2，培养至76小时，光密度(OD620)为0.88，发酵强度为1.28g/l.h，无杂菌，可取少量部分发酵作为下一发酵罐的种子，接入发酵液的发酵罐在菌种的培养时期，PH控制5。 
实施例5 
发酵串罐培养 
发酵罐培养基的配方为： 
玉米浆：6％、Nacl：0.3％、酵母膏：0.28％、尿素：0.23％、葡萄糖： 6％、蔗糖：1.8％、KNO3：1.2％、KH2PO4：0.9％、细胞调节剂：7％、乳化剂：0.05(v/v)％、消泡剂：0.03％(v/v)。 
发酵控制条件： 
接种量：10％，罐温：28℃，通风比：1∶0.4vvm，罐压：0.10Mpa，8小时后开始流加葡萄糖，发酵液中葡萄糖浓度控制在1.5％，OD620为1.05时停止葡萄糖流加，开始流加烷烃，PH：加烷烃前5.0，加烷烃后6.8，培养至80小时，光密度(OD620)为0.89，发酵强度为1.29g/l.h，无杂菌，可取少量部分发酵作为下一发酵罐的种子，接入发酵液的发酵罐在菌种的培养时期，PH控制5。 
间歇式发酵与串罐培养发酵结果比较如下表：(在200M3发酵罐上，以生产DC12为例，生产结果如下)。 
Figure GSA00000113528600071

Claims (4)

1.长链二元酸制备过程中的串罐发酵工艺，有①，②，③......n个发酵罐，其特征在于：发酵罐②的种子液直接从发酵罐①接入，发酵罐③的种子液从罐②接入，以此类推，即②和③以后各批发酵罐的种子不再进行逐级培养，而取自上一发酵罐的部分发酵液进行串罐发酵培养。
2.如权利要求1所述的长链二元酸制备过程中的串罐发酵工艺，其特征在于：发酵液的取种时机为：取发酵培养至40～60小时发酵液作为种子最佳，判断标准为光密度OD620在0.8以上，发酵强度大于1.25g/l.h，镜检，无杂菌。
3.如权利要求1所述的长链二元酸制备过程中的串罐发酵工艺，其特征在于：发酵罐培养基的配方为：玉米浆：2～7％、Nacl：0.1～0.3％、酵母膏：0.15～0.3％、尿素：0.1～0.25％、葡萄糖：3～7％、蔗糖：0.5～2％、KNO3：1.0～2％、KH2PO4：0.5～2％、细胞调节剂：3～7％、乳化剂：0.001～0.05(v/v)％、消泡剂：0.03％(v/v)。
4.如权利要求1或3所述的长链二元酸制备过程中的串罐发酵工艺，其特征在于：发酵酵控制条件为：接种量：8～10％，罐温：28～30℃，通风比：1∶0.4～0.7vvm，罐压：0.03～0.12Mpa，8小时后开始流加葡萄糖，发酵液中葡萄糖浓度控制在0.5～3％，OD620大于1.0时停止葡萄糖流加，开始流加烷烃，PH：加烷烃前4.0～6.0，加烷烃后6.5～7.5，培养至72～80小时，光密度(OD620)大于0.8，发酵强度大于1.25g/l.h，无杂菌，可取少量部分发酵作为下一发酵罐的种子，接入发酵液的发酵罐在菌种的培养时期，PH控制4～6。
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