CN104561213A - 一种通过微生物转化来制备4-雄烯二酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过微生物转化来制备4-雄烯二酮的方法，尤其涉及4-雄烯二酮制备过程中的串罐发酵技术。本发明中每个发酵罐的种子液来自前一个发酵罐的发酵液，依次类推。这样每一个发酵罐的种子液为上一个发酵罐中刚进入代谢稳定期的发酵液，依次类推，进行串罐发酵培养。通过本方法使得分支杆菌对植物甾醇的转化率与完全用逐级扩大培养成熟的种子液作为发酵罐的种子相比其转化率提高至80%以上，同时运用该工艺使得发酵周期由原来的160～170小时缩短为现在的80～110小时，缩短了罐批运转周期，增加进罐批次，降低了生产成本，获得更大的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过微生物转化来制备4-雄烯二酮的方法，尤其涉及4-雄烯二酮制备过程中的串罐发酵技术，即在利用分支杆菌选择性降解植物甾醇制备4-雄烯二酮的过程中通过串罐发酵技术用微生物三个生长阶段持续降解植物甾醇高产4-雄烯二酮的发酵工艺，属于发酵技术领域。
背景技术
4-雄烯二酮（化学名称：雄甾-4-烯-3，17-二酮，英文名4-Androstenedione，简称AD），该产品外观形状呈近白色晶体粉末，无异味，无毒性，不溶于水，是一种当今世界上用途极广，科技含量高的生物化工中间体。
雄烯二酮是生产激素类原料药的重要中间体，可以说几乎所有甾体激素药物都可以以雄烯二酮为起始原料进行生产，如用于生产皮质激素、性激素、孕激素及蛋白同化激素，又可用于合成可的松、强的松、黄体酮、雌烯醇、地塞米松等100余种药物，也是用于生产抗早孕米非司酮和各类计划生育用药必不可少的原料。
发酵法生产4-雄烯二酮是1998年在美国一家制药公司开始，它以原料来源广、原料成本低、反应专一性强、反应条件温和、生产步骤简化和生产周期短等优点逐渐取代了传统的化学合成法，在国内外受到了普遍的重视。
在微生物转化法生产4-雄烯二酮的过程中，4-雄烯二酮的产品收率通过提取、精制技术的一系列改进进一步提升的空间非常有限，所以目前降低4-雄烯二酮生产成本的潜力在发酵技术的改进方面。如何最大限度地提高微生物对植物甾醇的转化率是每个生产企业研究的重点。目前，微生物转化法生产4-雄烯二酮都采用单纯的间歇式分批培养发酵，种子培养需要采用逐级扩大培养的方法，即从斜面到种子罐，经过一级和二级种子罐逐级扩大培养后，转入发酵罐。种子液进入发酵罐后还要经过对环境的适应期、自身对数生长期最后再进入次级代谢期产生目的产物。这种逐级培养方式使得种子液在发酵罐内较长时间只是进行了自身初级代谢，一般在35~45h才开始进行合成目的产物的次级代谢，并且4-雄烯二酮转化菌种还没有对植物甾醇转化完就会进入菌体代谢衰退期，这样就会延长发酵罐培养周期，增加动力成本，对植物甾醇的转化率一般只能维持在45%~65%，造成生产的不稳定。
发明内容
本发明所解决的技术问题是打破微生物生长代谢三阶段的规律，确保了4-雄烯二酮的制备时间出现在微生物生长代谢的适应期，缩短了整个发酵周期。
微生物转化法是指某种微生物对有机物某一特定部位或基团作用使它转变成结构上相似的另一种化合物的过程。微生物转化与一般的氨基酸和抗生素发酵不同，转化产物不是微生物的代谢产物，而是利用微生物所产生的酶对底物的某一部位进行特定的生物化学反应来获得的特定产物。甾体类物质一般不是微生物代谢途径中起生理作用的物质，因此，甾体类物质不像其他营养物质一样，会被微生物最终分解为二氧化碳和水。
微生物转化植物甾醇的过程可用以下通式表示：
进入 分泌
底物→→→→→→菌体细胞→→→→→→反应产物（胞内或胞外）
4-雄烯二酮的发酵转化过程通常分两个阶段进行，第一阶段是菌体的自身生长阶段，该时期供给菌体丰富的营养，在最适温度、pH和通气条件下进行培养，以得到足够的菌体和大量高活性的转化酶；第二阶段是对植物甾醇进行定向转化的阶段。研究证明这两个阶段有一个共同特点：菌体的最适自身生长阶段的pH范围与菌体对植物甾醇转化的最适pH范围基本相同，这也是本发明取得成功的关键所在。
串罐发酵即每个发酵罐的种子液全部来自前一个发酵罐的发酵液。一般取生长旺盛，刚进入转化期的发酵液。时间：取发酵液培养至20-30小时发酵液作为种子最佳，判断标准为发酵液的pH降至6.8左右，发酵单位小于0.5g/l，镜检无杂菌。这样每一个发酵罐的种子液来自发酵罐中刚进入转化期的种子液，依次类推，进行串罐发酵培养。
本发明中一种通过微生物转化来制备4-雄烯二酮的方法，即4-雄烯二酮制备过程中的串罐发酵工艺，其包括以下步骤：
1）种子制备阶段
其中，所采用的菌株为耻垢分支杆菌（Mycobacterium smegmatis）
一级种子罐培养基的配方为：葡萄糖：0.2~0.5%、硝酸铵：0.2~0.5%、硫酸镁：0.01~0.05%、磷酸氢二钾0.01~0.05%、酵母浸粉：1.0~2.2%，加水定容后调pH至7.0。
一级种子罐培养控制参数：接种量：8~10%，罐温：28~30℃，通气比：1:0.2~1.0vvm，罐压：0.03~0.05Mpa，转速：200~300rpm，周期：30~48小时。
二级种子罐培养基配方为：葡萄糖：0.2~0.5%、硝酸铵：0.2~0.5%、硫酸镁：0.01~0.05%、磷酸氢二钾0.01~0.05%、酵母浸粉：1.0~2.2%，加水定容后调pH至7.0。
二级种子罐的控制参数为：接种量：10~15%，罐温：28~30℃，通气比：1:0.2~1.0vvm，罐压：0.03~0.05Mpa，转速：200~300rpm，周期：20~30小时。
2）发酵半串罐培养
发酵罐培养基配方为：葡萄糖：1.0~5.0%、酵母浸粉：0.5~2.5%、硝酸铵：0.15~0.55%、硫酸镁：0.02~0.2%、磷酸氢二钾：0.1~1.0%、硫酸亚铁：0.001~0.01%、碳酸钙：0.1~0.5%、植物甾醇：1~4%、乳化剂：0.001~0.05（v/v）%、消泡剂：0.03%（v/v）。
发酵罐的控制参数为：接种量：8~10%，罐温：28~30℃，通气比：1:0.2~1.0vvm，罐压：0.03~0.05Mpa，转速：150~260rpm，用10%浓度氨水溶液控制pH在6.6~7.0，用20%浓度的硝酸铵溶液控制发酵液中氨氮含量为50-70mg/100ml。取发酵液培养至20-30小时小部分发酵液作为种子最佳，判断标准为发酵液的pH降至6.8左右，发酵单位小于0.5g/l，镜检无杂菌。每一个发酵罐的种子液来自上一个发酵罐中刚进入转化期的种子液，依次类推，进行串罐发酵培养。发酵罐培养周期为88~108h。
取种时间的选择：按照传统的间歇式发酵理论，随着种子液在发酵罐培养时间的延长，种子首先进入对环境适应期，再进入对数生长期，培养周期大约在20-30小时时菌体量和转化酶活性基本上达到最大，因此取发酵培养20-30小时发酵液作为部分种子最佳。判断标准：发酵液的pH降至6.8左右，发酵单位小于0.5g/l，镜检无杂菌。
3）发酵液有效成分HPLC检测
色谱条件：色谱柱：Kromasil C18 5μm 200×4.6mm，流动相：CH3OH:H2O ＝ 80 :20 (v/v)，流速：1.0ml/min，检测波长：242nm。
标准曲线的测定：
配制一系列不同浓度的AD标准溶液(50-500μg/ml)，分别取各浓度标准溶液的过滤液20μl注入高效液相色谱仪中，测定其吸收峰面积，然后对浓度(Y)和吸收峰面积(X)进行一元线性回归，得到一元线性回归方程。
效价计算方法：
将待测样品制成合适浓度(50-500μg/ml)的甲醇溶液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，准确吸取滤液20μl注入HPLC中，记录色谱图，将AD峰面积代入上述的回归方程中，计算得到样品中AD量。
4）植物甾醇转化率的计算
发酵完成后，发酵液经甲醇处理后，再用液相色谱定量测出雄烯二酮的含量，然后计算植物甾醇的转化率：转化率/%=发酵液中AD含量*100/（投料油中甾醇含量*0.66*0.95）。
本发明的优点：
1、通过本方法使得分支杆菌对植物甾醇的转化率与完全用逐级扩大培养成熟的种子液作为发酵罐的种子相比其转化率提高20%以上；与完全用前一个发酵罐的发酵液作为下一个发酵罐的种子相比其转化率提高15%以上；
2、该发酵工艺为单相水工艺，通过选用合适的乳化剂很好地解决了甾醇在水中溶解度差的问题，为后续提取解决了一系列难题，使得4-雄烯二酮的质量更加稳定。
3、运用该工艺消除了由于种子质量波动引起的发酵产量的波动，稳定了发酵生产；
4、运用该工艺使得发酵周期由原来的160～170小时缩短为现在的80～108小时，缩短了罐批运转周期，增加进罐批次，提高了设备利用率，降低了生产成本，可获得更大的经济效益。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，同时增加对照试验，但是本发明不以具体实施例为限。
1、制备材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种
菌种来源：DY20120806-102（山东东药药业股份有限公司）
1.1.2仪器与分析条件
HPLC：安捷伦-1260，色谱条件：色谱柱---Kromasil C18 5μm 200×4.6mm
流动相---CH3OH:H2O ＝ 80 :20 (v/v)，流速---1.0ml/min，检测波长---242nm。试剂：雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）标准品和甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。含量用外标峰面积法计算。
1.2 对照试验一（传统的间歇式发酵）
1.2.1 培养基及培养工艺
1.2.1.1 种子制备阶段
一级种子罐培养基的配方为：葡萄糖：0.2~0.5%、硝酸铵：0.2~0.5%、硫酸镁：0.01~0.05%、磷酸氢二钾0.01~0.05%、酵母浸粉：1.0~2.2%，加水定容后调pH至7.0。
一级种子罐培养控制参数：接种量：8~10%，罐温：28~30℃，通气比：1:0.2~1.0vvm，罐压：0.03~0.05Mpa，转速：200~300rpm，周期：30~48小时。
二级种子罐培养基配方为：葡萄糖：0.2~0.5%、硝酸铵：0.2~0.5%、硫酸镁：0.01~0.05%、磷酸氢二钾0.01~0.05%、酵母浸粉：1.0~2.2%，加水定容后调pH至7.0。
二级种子罐的控制参数为：接种量：10~15%，罐温：28~30℃，通气比：1:0.2~1.0vvm，罐压：0.03~0.05Mpa，转速：200~300rpm，周期：20~30小时。
1.2.1.2 发酵罐培养
发酵罐培养基配方为：葡萄糖：1.0~5.0%、酵母浸粉：0.5~2.5%、硝酸铵：0.15~0.55%、硫酸镁：0.02~0.2%、磷酸氢二钾：0.1~1.0%、硫酸亚铁：0.001~0.01%、碳酸钙：0.1~0.5%、植物甾醇：1~4%、乳化剂：0.001~0.05（v/v）%、消泡剂：0.03%（v/v）。
发酵罐的控制参数为：接种量：8~10%，罐温：28~30℃，通气比：1:0.2~1.0vvm，罐压：0.03~0.05Mpa，转速：150~260rpm，用10%浓度氨水溶液控制pH在6.6~7.0，用20%浓度的硝酸铵溶液控制发酵液中氨氮含量为50-70mg/100ml。培养周期为160-170小时，放罐。
1.3 对照试验二（该方案是发酵罐的种子液包括经逐级扩大培养成熟的种子液和上一个发酵罐中刚进入转化期的种子液）
1.3.1 发酵罐培养基及培养工艺
发酵罐培养基配方为：葡萄糖：1.0~5.0%、酵母浸粉：0.5~2.5%、硝酸铵：0.15~0.55%、硫酸镁：0.02~0.2%、磷酸氢二钾：0.1~1.0%、硫酸亚铁：0.001~0.01%、碳酸钙：0.1~0.5%、植物甾醇：1~4%、乳化剂：0.001~0.05（v/v）%、消泡剂：0.03%（v/v）。
发酵罐的控制参数为：接种量：8~10%，罐温：28~30℃，通气比：1:0.2~1.0vvm，罐压：0.03~0.05Mpa，转速：150~260rpm，用10%浓度氨水溶液控制pH在6.6~7.0，用20%浓度的硝酸铵溶液控制发酵液中氨氮含量为50-70mg/100ml。取发酵液培养至20-30小时小部分发酵液作为种子最佳，判断标准为发酵液的pH降至6.8左右，发酵单位小于0.5g/l，镜检无杂菌。发酵罐培养周期为120~144小时，放罐。
1.4 实施例一（发酵串罐培养）
1.4.1 种子制备阶段
一级种子罐培养基的配方为：葡萄糖：0.2~0.5%、硝酸铵：0.2~0.5%、硫酸镁：0.01~0.05%、磷酸氢二钾0.01~0.05%、酵母浸粉：1.0~2.2%，加水定容后调pH至7.0。
一级种子罐培养控制参数：接种量：8~10%，罐温：28~30℃，通气比：1:0.2~1.0vvm，罐压：0.03~0.05Mpa，转速：200~300rpm，周期：30~48小时。
二级种子罐培养基配方为：葡萄糖：0.2~0.5%、硝酸铵：0.2~0.5%、硫酸镁：0.01~0.05%、磷酸氢二钾0.01~0.05%、酵母浸粉：1.0~2.2%，加水定容后调pH至7.0。
二级种子罐的控制参数为：接种量：10~15%，罐温：28~30℃，通气比：1:0.2~1.0vvm，罐压：0.03~0.05Mpa，转速：200~300rpm，周期：20~30小时。
1.4.2发酵串罐培养
发酵罐培养基配方为：葡萄糖：1.0~5.0%、酵母浸粉：0.5~2.5%、硝酸铵：0.15~0.55%、硫酸镁：0.02~0.2%、磷酸氢二钾：0.1~1.0%、硫酸亚铁：0.001~0.01%、碳酸钙：0.1~0.5%、植物甾醇：1~4%、乳化剂：0.001~0.05（v/v）%、消泡剂：0.03%（v/v）。
发酵罐的控制参数为：接种量：8~10%，罐温：28~30℃，通气比：1:0.2~1.0vvm，罐压：0.03~0.05Mpa，转速：150~260rpm，用10%浓度氨水溶液控制pH在6.6~7.0，用20%浓度的硝酸铵溶液控制发酵液中氨氮含量为50-70mg/100ml。取发酵液培养至20-30小时小部分发酵液作为种子最佳，判断标准为发酵液的pH降至6.8左右，发酵单位小于0.5g/l，镜检无杂菌。每一个发酵罐的种子液来自上一个发酵罐中刚进入转化期的种子液，依次类推，进行串罐发酵培养。发酵罐培养周期为88~108h，放罐。
2、说明：以上三种实验方案各做三批，其三种方案发酵结果比较如下：（在20m3发酵罐上进行，以生产4-雄烯二酮为例，生产结果如下）。
Claims (7)
1.一种通过微生物转化来制备4-雄烯二酮的方法，即4-雄烯二酮制备过程中的串罐发酵工艺，有 、、……n个发酵罐，其特征在于：发酵罐的种子液直接从发酵罐移取部分发酵液接入，发酵罐的种子液直接从发酵罐移取部分发酵液接入，以此类推类推，即发酵罐、及以后各批发酵罐的种子来自前一个发酵罐的发酵液，该工艺就是串罐发酵工艺。
2.如权利要求1所述的一种通过微生物转化来制备4-雄烯二酮的方法，即4-雄烯二酮制备过程中的串罐发酵工艺，其特征在于：发酵液的取种时机为：取发酵液培养至20～30小时发酵液作为种子最佳，判断标准为发酵液的pH降至6.8左右，发酵单位小于0.5g/l，镜检无杂菌。
3.如权利要求1所述的一种通过微生物转化来制备4-雄烯二酮的方法，即4-雄烯二酮制备过程中的串罐发酵工艺，其特征在于：
一级种子罐培养基配方为：葡萄糖0.2~0.5%、硝酸铵0.2~0.5%、硫酸镁0.01~0.05%、磷酸氢二钾0.01~0.05%、酵母浸粉1.0~2.2%，加水定容后调pH至7.0；
二级种子罐培养基配方为：葡萄糖0.2~0.5%、硝酸铵0.2~0.5%、硫酸镁0.01~0.05%、磷酸氢二钾0.01~0.05%、酵母浸粉1.0~2.2%，加水定容后调pH至7.0；
发酵罐培养基配方为：葡萄糖1.0~5.0%、酵母浸粉0.5~2.5%、硝酸铵0.15~0.55%、硫酸镁0.02~0.2%、磷酸氢二钾0.1~1.0%、硫酸亚铁0.001~0.01%、碳酸钙0.1~0.5%、植物甾醇1~4%、乳化剂0.001~0.05（v/v）%、消泡剂0.03%（v/v）。
4.如权利要求1所述的一种通过微生物转化来制备4-雄烯二酮的方法，即4-雄烯二酮制备过程中的串罐发酵工艺，其特征在于：
一级种子罐的控制参数为：接种量：8~10%，罐温：28~30℃，通气比：1:0.2~1.0vvm，罐压：0.03~0.05Mpa，转速：200~300rpm，周期：30~48小时；
二级种子罐的控制参数为：接种量：10~15%，罐温：28~30℃，通气比：1:0.2~1.0vvm，罐压：0.03~0.05Mpa，转速：200~300rpm，周期：20~30小时；
发酵罐的控制参数为：接种量：8~10%，罐温：28~30℃，通气比：1:0.2~1.0vvm，罐压：0.03~0.05Mpa，转速：150~260rpm，用10%浓度氨水溶液控制pH在6.6~7.0，用20%浓度的硝酸铵溶液控制发酵液中氨氮含量为50～70mg/100ml，周期：88~108h。
5.如权利要求1所述的一种通过微生物转化来制备4-雄烯二酮的方法，即4-雄烯二酮制备过程中的串罐发酵工艺，其特征在于：步骤（4）发酵液的放罐指标是：效价增长缓慢，泡沫消失，pH升高，AD含量达到18.0g/l左右。
6.如权利要求1所述的一种通过微生物转化来制备4-雄烯二酮的方法，即4-雄烯二酮制备过程中的串罐发酵工艺，其特征在于：步骤（4）发酵液效价检测方法为高效液相色谱法：
色谱条件：色谱柱：Kromasil C18 5μm 200×4.6mm，流动相：CH3OH:H2O ＝ 80 :20 (v/v)，流速：1.0ml/min，检测波长：242nm；
标准曲线的测定：
配制一系列不同浓度的AD标准溶液(50～500μg/ml)，分别取各浓度标准溶液20μl注入高效液相色谱仪中，测定其吸收峰面积，然后对浓度(Y)和吸收峰面积(X)进行一元线性回归，得到一元线性回归方程；
效价计算方法：
将待测样品制成合适浓度(50～500μg/ml)的甲醇溶液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，准确吸取滤液20μl注入HPLC中，记录色谱图，将AD峰面积代入上述的回归方程中，计算得到样品中AD量。
7.如权利要求1所述的一种通过微生物转化来制备4-雄烯二酮的方法，即4-雄烯二酮制备过程中的串罐发酵工艺，其特征在于：步骤（4）发酵液中植物甾醇转化率计算方法：发酵完成后，发酵液经甲醇处理后，再用液相色谱定量测出雄烯二酮的含量，然后计算植物甾醇的转化率：转化率/%=发酵液中AD含量*100/（投料油中甾醇含量*0.66*0.95）。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20150429 |