CN104611401A - 一种提高微生物发酵生产2,3-丁二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高微生物发酵生产2,3-丁二醇的方法，包括：（1）种子液培养：以MRS培养基进行乳酸菌的培养，获得乳酸菌种子液；以LB培养基进行克雷伯氏菌的培养，获得克雷伯氏菌种子液；（2）发酵培养：在发酵培养基中接入两种菌株混合的发酵种子液，在发酵初始阶段以厌氧或微氧发酵为主，当光密度OD650大于5时增加通气量，进行好氧发酵。本发明将克雷伯氏菌和乳酸菌进行共发酵生产2,3-丁二醇，一方面以乳酸菌优化糖代谢，增加中间代谢产物的供给，提高2,3-丁二醇的发酵水平；另一方面，通过调控发酵过程中氧气的供给量，调节两种菌的代谢途径，在提高2,3-丁二醇产量的同时，获得经济效益更好的高浓度双乙酰。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种通过两种微生物共发酵来提高发酵菌生产2,3-丁二醇的方法。
背景技术
2,3-丁二醇可以作为一种潜在的平台化合物，替代传统的平台化合物，用于大规模合成甲乙酮（优良溶剂）和1,3-丁二烯（广泛应用于合成橡胶、聚酯和聚亚胺酯等领域）。除此之外，2,3-丁二醇还可用于制备油墨、香水、熏蒸剂、增湿剂、软化剂、增塑剂、炸药及药物手性载体等，2,3-丁二醇的氧化产物3-羟基丁酮和丁二酮可作为食用香料使用；同时，因其热值较高，与乙醇、甲醇相当，故可作为燃料添加剂；2,3-丁二醇酯化后可生成聚氨酯泡沫的前体；2,3-丁二醇与乙酸反应生成2,3-丁二醇二乙酸酯，该酯可加到奶油中改善风味；2,3-丁二醇在我国还被添加到白酒中，以改善白酒的风味。2,3-丁二醇脱氢变成双乙酰，双乙酰在食品工业中作为一种具有很高价值的风味。2,3-丁二醇的L型异构体可用于抗冻剂。2,3-丁二醇酯化物能作为制作药物和化妆品的前体。目前2,3-丁二醇的合成主要采用以石油裂解物为来源的化学法，但随着石油资源的大量消耗和不可再生资源价格的节节攀升，发展环境友好的生物基化学品的生物炼制技术已成为转变经济增长方式、保障生态链良性循环、实现经济社会可持续发展的战略需求。
随着生物技术的广泛应用，2,3-丁二醇主要以微生物发酵法生产，工业发酵生产2,3-丁二醇主要菌种有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)和气单孢菌菌属(Arobacter)，其生物发酵工艺已相对成熟。随着生物发酵生产2,3-丁二醇研究的深入，克雷伯氏菌逐渐成为一种优势菌种，成为研究的热点。
CN200910046726.8公开了一种肺炎克雷伯氏菌及其制备氢气和2,3-丁二醇的方法，其在厌氧的条件下发酵联产氢气和2,3-丁二醇，增加了生产的附加值，但是2,3-丁二醇的产量很低。CN200710021641.5 公开了一种产酸克雷伯氏菌及其应用，利用该产酸克雷伯氏菌生物合成2,3-丁二醇并降低该过程中副产物有机酸的产量，但是该法处理前后 2,3-丁二醇产量增加并不明显。CN200810138838.1公开了一株肺炎克雷伯氏菌及其在制备2,3-丁二醇中的应用，但是以葡萄糖为底物进行2,3-丁二醇的转化属于氧化代谢途径，克雷伯氏菌属于典型的兼性厌氧微生物，在发酵初期生物量累积较慢，以至于发酵周期较长。CN200410037692.3公开了一种微生物两段发酵法由甘油生产1,3-丙二醇和2,3丁二醇的方法，采用前期厌氧后期好氧两段发酵的新工艺，虽然利用厌氧与好氧的条件控制，能够对发酵菌株代谢过程进行人为调控，但是对于由单一发酵菌株的发酵过程而言，这样的调控效果一般，而且会引入更多的发酵副产物。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种提高微生物发酵生产2,3-丁二醇的方法。该方法将克雷伯氏菌和乳酸菌进行共发酵生产2,3-丁二醇，一方面以乳酸菌优化糖代谢，增加中间代谢产物的供给，提高2,3-丁二醇的发酵水平；另一方面，通过调控发酵过程中氧气的供给量，调节两种菌的代谢途径，在提高2,3-丁二醇产量的同时，获得经济效益更好的高浓度双乙酰。
本发明微生物发酵生产2,3-丁二醇的方法，包括以下步骤：（1）种子液培养：以MRS培养基进行乳酸菌的培养，获得乳酸菌种子液；以LB培养基进行克雷伯氏菌的培养，获得克雷伯氏菌种子液；（2）发酵培养：在发酵培养基中接入两种菌株混合的发酵种子液，在发酵初始阶段以厌氧或微氧发酵为主，当光密度OD650（OD650是指波长为650nm光照下测得的OD值）大于5时增加通气量，进行好氧发酵。
本发明方法中，所采用的乳酸菌为干酪乳杆菌；所采用克雷伯氏菌优选肺炎克雷伯氏菌。
本发明方法中，乳酸菌种子液与克雷伯氏菌种子液按照1:1～1:3的比例配成发酵种子液。
本发明方法中，种子液培养过程如下：将菌种保藏液与种子培养基按体积1:100～1:500的比例混合于培养反应器内，培养温度为30℃～40℃，搅拌速度为100rpm～400rpm，pH控制在4～7之间，种子液培养过程中保持微氧或厌氧条件。
本发明方法中，微氧发酵时无空气通入，依靠发酵液中溶解氧维持微氧状态；厌氧发酵时通入流速为0.1vvm～0.5vvm的氮气；好氧发酵时通入流速为0.5vvm～1vvm的空气。
本发明方法中，发酵过程如下：发酵培养基以葡萄糖为底物，发酵种子液体积和培养基体积按1:9～1:20比例在生物反应器内混合，培养温度为30℃～40℃，搅拌速度为200rpm～500rpm，pH控制在5～7之间。
本发明方法中，发酵初始葡萄糖底物浓度控制在50g/L～100g/L；发酵过程中，通过流加形式补充葡萄糖，使发酵体系中葡萄糖浓度控制在20g/L～40g/L。
本发明方法中，生物量的累积程度以培养液的OD值作为参考。通过浊度法测量培养液中菌体浓度，根据所测的OD值与细胞浓度成正比的关系，以OD值判断培养液中的菌体浓度。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明方法所采用的乳酸菌、克雷伯氏菌是典型的兼性厌氧微生物，在好氧和厌氧条件下，分别具有不同的代谢途径。因此通过微氧（厌氧）、好氧的条件控制，对两种菌株进行有针对性的代谢调控，即在发酵初期进行微氧（厌氧）控制，以利于乳酸菌的EMP代谢，提高中间代谢物（丙酮酸、3-磷酸甘油酸等）的浓度，促进克雷伯氏菌生物量的积累；在发酵的中后期进行好氧控制，以利于克雷伯氏菌进行2,3-丁二醇的生产。通过这样的过程调控强化了克雷伯氏菌生长的微氧增殖阶段和2，3-丁二醇积累的发酵阶段，更有利于提高2,3-丁二醇的发酵水平，提高2,3-丁二醇的产量。
2、乳酸菌在微氧或厌氧条件下具有高效的葡萄糖分解能力，相对而言，克雷伯氏菌的葡萄糖分解能力较慢，表现在发酵初期葡萄糖消耗较少，菌体生物量积累较慢，发酵周期较长。因此通过乳酸菌的加入，利用其在厌氧条件下高效的EMP效率，加速葡萄糖的分解，促进克雷伯氏菌对中间代谢物的吸收利用，缩短了2,3-丁二醇的发酵周期。
3、乳酸菌不仅在微氧阶段能够进行微氧代谢，形成高浓度的中间代谢物；并且在转入好氧阶段后，能够进行好氧发酵，利用乙酰乳酸合成经济价值更高的双乙酰，增加了发酵生产的附加值。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的效果，但不构成对本发明的限制。
本发明实施例中，以Waters 2695分离系统与Waters 2414示差检测器构成液相分析系统，其中分离柱选用Aminex HPX-87H 有机酸和醇分析柱用于酸类和醇类的分离。以葡萄糖、琥珀酸、乳酸、乙酸、2,3-丁二醇、乙醇标准样品建立标准图谱，反应过程中定时测量反应体系中葡萄糖的消耗情况、产物2,3-丁二醇的积累情况。
本发明实施例中，所用的菌种为克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae），来自中国石化抚顺石油化工研究院专利菌种，保藏编号CGMCC NO.0798；干酪乳杆菌FY-04（Lactobacillus casei）来自中国石化抚顺石油化工研究院专利菌种，保藏编号CGMCC NO.3269。上述菌株在中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）保藏。
本发明实施例中，种子培养基及发酵培养基的配方如表1所示。
表1 培养基配方
| 配方 | LB培养基（/L） | MRS基本培养（/L） | 发酵用培养（/L） |
| Tryptone | 10g | 10g | |
| Yeast Extrac | 5g | 5g | |
| NaCl | 10g | ||
| 葡萄糖 | 20g | 100g | |
| 醋酸钠 | 5g | ||
| 柠檬酸二铵 | 2g | ||
| MgSO4·7H2O | 0.52g | 0.25g | |
| MnSO4·H2O | 0.28g | 0.001g | |
| 吐温80 | 0.1g | ||
| K2HPO4·3H2O | 13.7g | ||
| KH2PO4 | 2g | ||
| (NH4)2SO4 | 6.6g | ||
| (NH4)2HPO4 | 3.3g | ||
| FeSO4·7H2O | 0.05g | ||
| ZnSO4·7H2O | 0.001g | ||
| CaCl2 | 0.01g | ||
| EDTA | 0.05g |
实施例1
（1）种子液培养：取液体保藏的克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）菌种保藏液1mL加入400mL的LB培养基中，混合于1L种子罐中，进行种子液培养。培养条件控制为：培养温度为 37℃，搅拌速度设为200rpm，pH控制在7.0，培养过程中保持微氧。
取液体保藏的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）菌种保藏液1mL加入400mL的MRS培养基中，混合于1L种子罐中，进行种子液培养。培养条件控制为：培养温度为 35℃，搅拌速度设为200rpm，pH控制在6.0，培养过程中保持微氧。
（2）发酵培养：采用间歇发酵模式，发酵罐体积为15L，上罐体积为8L。具体步骤如下：
a、分别取400mL克雷伯杆菌种子液及400mL干酪乳杆菌种子液加入到7.2L发酵培养基中；
b、发酵过程控制培养温度为37℃，搅拌速度为200rpm，过程中以30%NaOH调节pH，使其控制为6，发酵初始阶段进行微氧发酵。随着发酵反应的进行，以浊度计定时测量发酵液的OD值，当OD值大于5时，开始通入空气以转入好氧发酵阶段，空气通入量为0.6vvm，直到反应结束。
c、发酵过程中，通过液相分析系统，测量反应体系中葡萄糖的消耗情况，并及时通过流加方式加入葡萄糖，使其在反应体系中的浓度维持在30g/L水平。
（3）发酵结果：发酵过程进行10小时后OD值为5.12，转入好氧发酵，发酵周期48h，最终产物中2,3-丁二醇浓度为90.25g/L，双乙酰为3.24g/L。
实施例2
（1）种子液培养：取液体保藏的克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）菌种保藏液1mL加入600mL的LB培养基中，混合于1L发酵罐中，进行种子液培养。培养条件控制为：培养温度为37℃，搅拌速度设为300rpm，pH控制在6.5，培养过程中保持微氧。
取液体保藏的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）菌种保藏液1mL加入300mL的MRS培养基中，混合于1L发酵罐中，进行种子液培养。培养条件控制为：培养温度为 35℃，搅拌速度设为100rpm，pH控制在6.0，培养过程中保持微氧。
（2）发酵培养：采用间歇发酵模式，发酵罐体积为15L，上罐体积为10L。具体步骤如下：
a、分别取600mL克雷伯杆菌种子液及300mL干酪乳杆菌种子液加入到9.1L发酵培养基中；
b、发酵过程控制培养温度为37℃，搅拌速度为200rpm，过程中以30%的NaOH调节pH，使其控制为6.5，发酵初始阶段进行微氧发酵。随着发酵反应的进行，以浊度计定时测量发酵液的OD值，当OD值大于5时，开始通入空气以转入好氧发酵阶段，空气通入量为1vvm，直到反应结束。
c、发酵过程中，通过液相分析系统，测量反应体系中葡萄糖的消耗情况，并及时通过流加方式加入葡萄糖，使其在反应体系中的浓度维持在35g/L水平。
（3）发酵结果：发酵过程进行13小时后OD值为5.06，转入好氧发酵，发酵周期48h，最终产物中2,3-丁二醇的浓度为100.35g/L，双乙酰为5.2g/L。
对比例1
（1）种子液培养：取液体保藏的克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）菌种保藏液2mL加入800mL的LB培养基中，混合于1L发酵罐中，进行种子液培养；培养条件控制为：培养温度为 37℃，搅拌速度设为200rpm，pH控制在7.0，培养过程中保持微氧。
（2）发酵培养：采用间歇发酵模式，发酵罐体积为15L，上罐体积为8L。具体步骤如下：
a、取800mL克雷伯杆菌种子液加入到7.2L发酵培养基中；
b、c步骤的控制条件与实施例1完全相同。
（3）发酵结果：发酵过程进行18小时后OD值为5.25，转入好氧发酵，发酵周期48h，最终产物中2，3-丁二醇的浓度为75.23g/L，双乙酰为0.25g/L。
对比例2
（1）种子液培养：取液体保藏的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）菌种保藏液2mL加入800mL的MRS培养基中，混合于1L发酵罐中，进行种子液培养。培养条件控制为：培养温度为 35℃，搅拌速度设为200rpm，pH控制在6.0，培养过程中保持微氧。
（2）发酵培养：采用间歇发酵模式，发酵罐体积为15L，上罐体积为8L。具体步骤如下：
a、取800mL干酪乳杆菌种子液加入到7.2L发酵培养基中；
b、c控制条件与实施例1完全相同。
（3）发酵结果：发酵过程进行8小时后OD值为5.32，转入好氧发酵，发酵48h，最终产物中2,3-丁二醇的浓度为2.25g/L，双乙酰为6.2g/L。
对比例3
（1）种子液培养：取液体保藏的克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）菌种保藏液2mL加入800mL的LB培养基中，混合于1L发酵罐中，进行种子液培养；培养条件控制为：培养温度为 37℃，搅拌速度设为200rpm，pH控制在7.0，培养过程中保持微氧。
（2）发酵培养：采用间歇发酵模式，发酵罐体积为15L，上罐体积为8L。具体步骤如下：
a、取800mL克雷伯杆菌种子液加入到7.2L发酵培养基中；
b、发酵过程控制培养温度为37℃，搅拌速度为200rpm，过程中以30%的NaOH调节pH，使其控制为6，发酵全程通入空气进行好氧发酵，空气通入量为0.6vvm，直到反应结束。
c、发酵过程中，通过液相分析系统，测量反应体系中葡萄糖的消耗情况，并及时通过流加方式加入葡萄糖，使其在反应体系中的浓度维持在30g/L水平。
（3）发酵结果：发酵周期48h，最终产物中2，3-丁二醇的浓度为73.62g/L，双乙酰为0.12g/L。
Claims (7)
1.一种提高微生物发酵生产2,3-丁二醇的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）种子液培养：以MRS培养基进行乳酸菌的培养，获得乳酸菌种子液；以LB培养基进行克雷伯氏菌的培养，获得克雷伯氏菌种子液；（2）发酵培养：在发酵培养基中接入两种菌混合的发酵种子液，在发酵初始阶段以厌氧或微氧发酵为主，当光密度OD650大于5时增加通气量，进行好氧发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的乳酸菌为干酪乳杆菌，克雷伯氏菌为肺炎克雷伯氏菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的乳酸菌种子液与克雷伯氏菌种子液按照1:1～1:3的比例配成发酵种子液。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的种子液的培养过程如下：将菌种保藏液与种子培养基按体积1:100～1:500的比例混合于培养反应器内，培养温度为30℃～40℃，搅拌速度为100rpm～400rpm，pH控制在4～7之间，种子液培养过程中保持微氧或厌氧条件。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的微氧发酵时无空气通入，依靠发酵液中溶解氧维持微氧状态；厌氧发酵时通入流速为0.1vvm～0.5vvm的氮气；好氧发酵时通入流速为0.5vvm～1vvm的空气。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于：所述的发酵过程如下：培养基以葡萄糖为底物，发酵种子液体积和培养基体积按1:9～1:20比例在生物反应器内混合，培养温度为30℃～40℃，搅拌速度为200rpm～500rpm，pH控制在5～7之间。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的发酵初始葡萄糖底物浓度控制在50g/L～100g/L；发酵过程中，通过流加形式补充葡萄糖，使发酵体系中葡萄糖浓度控制在20g/L～40g/L。
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