CN107201313A

CN107201313A - 一种杜氏盐藻光发酵培养液配方及其快速培养方法

Info

Publication number: CN107201313A
Application number: CN201710475303.2A
Authority: CN
Inventors: 侯仕营; 刘振华; 孙亚敏; 梁亚; 王玲玲
Original assignee: Weihai Ocean Vocational College
Current assignee: Weihai Ocean Vocational College
Priority date: 2017-06-21
Filing date: 2017-06-21
Publication date: 2017-09-26

Abstract

一种杜氏盐藻光发酵培养液配方及其快速培养方法，其配方是由乳糖、NaCl、NaNO₃、KH₂PO₄、Na₂EDTA、柠檬酸铁等所组成的，培养方法为，一级培养用1000mL灭菌锥形瓶，二级培养用0.2~0.3立方水体的半透明塑料水塔，三级培养用1~3立方水体的半透明塑料水塔，培养液循环流动培养(温度25℃左右)，夜间辅助日光灯照射，光照强度3000~5000lx，培养5~7天后采收，密度可以达到800~900×10⁴cell/ml，本发明培养液配方营养均衡，杜氏盐藻生长速度快，产量高，过程操作简单，成本低，不用人工搅动，可大规模推广应用。

Description

一种杜氏盐藻光发酵培养液配方及其快速培养方法

技术领域

本发明涉及水产养殖饲料领域，特别是用乳糖替代葡萄糖进行杜氏盐藻光发酵培养，提高藻种的生长速度和产量所使用的一种杜氏盐藻光发酵培养液配方及其快速培养方法。

背景技术

杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一种单细胞绿藻，是迄今为止发现的最耐盐的真核生物之一，可在高盐、高温、高光照的极端环境中生存，广泛分布于海洋、盐湖等盐度较高地区。杜氏盐藻含有丰富的油脂、β-胡萝卜素、蛋白质、多糖等，累积的甘油为干重的40%-50%，在适当的条件下，体内合成的β-胡萝卜素可达细胞干重的14%。杜氏盐藻无细胞壁,藻粉可作鱼、虾、贝等幼体的饵料, 可提高其生长速度及饲料转化率。杜氏盐藻在食品、医药保健以及化工和养殖业中具有独特经济价值。这种藻类在澳大利亚、美国和以色列等国家已经实现了工业化生产。

目前，杜氏盐藻在许多国家成功开展了大规模培养，并逐步实现了产业化。但不合理的培养液配比及开放式培养方法，使杜氏盐藻培养受到自然光照、天气、敌害生物等因素制约，导致培养周期长、细胞密度低、受到微生物污染、藻种质量差、活力低，严重影响了杜氏盐藻的培养效率。

大量实验表明，向培养液中添加无机碳源碳酸氢钠能有效提高杜氏盐藻的产量。实验表明为了弥补光自氧营养时能源和碳源的不足，藻类能利用一些有机物进行混养生长。异养转化不仅可以提高藻类的生长效率、降低其生产的成本，而且还有利于藻细胞内某些代谢产物的积累。

发明内容

本实发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种低成本、利于杜氏盐藻快速高产的光发酵培养液，并合理利用半透明塑料水塔进行快速培养。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是：

1、一种杜氏盐藻光发酵培养基基本培养液配方，一级培养液配方包括：乳糖：10 g/L；NaCl：20 g/L；NaNO₃：80mg/L；KH₂PO₄： 10mg/L；NaHCO₃：l.0 g/L；Na₂EDTA：6mg/L ；柠檬酸铁：2.24 mg/L；微量元素液：H₃BO₃：0.61 mg/L；ZnC1₂：41 ug/L ；(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O：0.38mg/L；CuSO₄·4 H₂O：60ug/L；CoCl₂·6H ₂O：51 ug/L；MnCl₂·4H₂O：41ug/L；pH为6.5-7.0；消毒海水1L；高压灭菌锅中121℃灭菌15min。

本发明二、三级培养液配方包括：乳糖：10 g/L；NaCl :20 g/L；NaNO₃：80mg/L；KH₂PO₄: 30mg/L；MgSO₄·7H₂O :1.2 g/L；NaHCO₃：l.0 g/L；柠檬酸铁：2.24 mg/L；V_B1：200ug/L；V_B6：20ug/L；V_B12：200mug/L；消毒海水1L。

培养基配制方法：

步骤1、按重量配比取得各组成成分，并按顺序依次加入；

步骤2、微量元素液可以先配制成浓度较高的母液，然后稀释加入；

步骤3、用次氯酸钠消毒海水的方法消毒：消毒方法为每立方米海水中加入300ml 10%的次氯酸钠溶液，有效消毒浓度为30ppm，加入次氯酸钠过夜8h后，在每立方米海水中加入20g无水硫代硫酸钠，充气5h左右，测定无残氯即可使用。

步骤4、对于一级培养液需调节pH后高温灭菌使用；对于二、本发明三级培养液直接用消毒海水溶解后喷洒全池即可。

一级培养工艺流程如下：

a投放培养液约600mL于1000mL灭菌锥形瓶中；

b按照1:3~1:5接入藻种，接种密度为1.2-2.0×10⁴cell/ml；

c控制光照强度，3000~5000lx；

d温度控制在24~27℃；

e第一天每小时摇瓶1次；

f一天后每天摇瓶3次。藻细胞密度达到90×10⁴cell/ml转入下一阶段培养。

本发明二、三级培养工艺流程如下：

a投放培养液2/3于半透明塑料水塔内；

b培养按照藻种接种密度为2.0~4.0×10⁴cell/ml进行接种；

c控制光照强度，3000~5000lx；

d温度控制在24~27℃；

e期间培养液循环流动培养；

f 5~7天即可达800~900×10⁴个/mL。

本发明的优点：①本发明所用原料简单，成本较低；②本发明利用合适配比的NaHCO₃和乳糖的混合碳源作为杜氏盐藻的光发酵培养液能有效提高杜氏盐藻的生长速率和产量。③本发明在三级培养中添加维生素V_B1、V_B6、V_B12有利于盐藻的快速生长强，并采用强光强盐培养，有利于其β-胡萝卜素的积累。

实验证明：在海珍品育苗场进行养殖实验。

将一级培养藻细胞密度达到90×10⁴cell/ml后转入二级培养，培养至第6天，测定藻细胞的浓度，如下所示：

三级培养

a投放培养液2/3于半透明塑料水塔内；

b按照藻种接种密度为2.0~4.0×10⁴cell/ml进行接种；

c控制光照强度，3000~5000lx光暗周期比为：12L:12D；

d温度控制在24~27℃；

e期间用气石充气，每小时搅池6次；

f 5~7天即可达800~900×10⁴ cell /mL。

通过优化杜氏盐藻的光发酵培养液配方，调整合适的碳源比例，最终选定l.0 g/LNaHCO₃和10g/L乳糖作为混合碳源进行培养，经过6天的充气光照培养，测定藻细胞浓度，与优化前的培养液相比，藻细胞浓度提高了8~10倍。在三级培养中添加维生素V_B1、V_B6、V_B12有利于盐藻的快速生长强，并采用强光强盐培养，有利于其β-胡萝卜素的积累。

Claims

1.一种杜氏盐藻光发酵培养液配方及其快速培养方法，其特征是：一级培养液配方包括乳糖：10 g/L；NaCl：20 g/L；NaNO₃：80mg/L；KH₂PO₄： 10mg/L；NaHCO₃：l.0 g/L；Na₂EDTA：6mg/L ；柠檬酸铁：2.24 mg/L；微量元素液：H₃BO₃：0.61 mg/L；ZnC1₂：41 ug/L ； (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O：0.38 mg/L；CuSO₄·4 H₂O：60ug/L；CoCl₂·6H ₂O：51 ug/L；MnCl₂ ·4H₂O：41ug/L；pH为6.5-7.0；消毒海水1L；高压灭菌锅中121℃灭菌15min，二、三级培养液配方包括乳糖：10 g/L；NaCl :20 g/L；NaNO₃：80mg/L；KH₂PO₄: 30mg/L；MgSO₄·7H₂O :1.2 g/L；NaHCO₃：l.0 g/L；柠檬酸铁：2.24 mg/L；V_B1：200ug/L；V_B6：20ug/L；V_B12：200mug/L；消毒海水1L。

2.一种杜氏盐藻光发酵培养液配方及其快速培养方法，其特征是：培养液配制方法：步骤1、按重量配比取得各组成成分，并按顺序依次加入；步骤2、微量元素液可以先配制成浓度较高的母液，然后稀释加入；步骤3、用次氯酸钠消毒海水的方法消毒：消毒方法为每立方米海水中加入300ml 10%的次氯酸钠溶液，有效消毒浓度为30ppm，加入次氯酸钠后，过夜8h后，在每立方米海水中加入20g无水硫代硫酸钠，充气5h左右，测定无残氯即可使用；步骤4、对于一级培养液需调节pH后高温灭菌使用；对于二、三级培养液直接用消毒海水溶解后喷洒半透明塑料水塔即可。

3.根据权利要求2所述的一种杜氏盐藻光发酵培养液配方及其快速培养方法，其特征是，一级培养工艺流程如下：a投放培养液约600mL于1000mL灭菌锥形瓶中；b按照1:3~1:5接入藻种，接种密度为1.2~2.0×10⁴cell/ml；c夜间辅助日光灯照射，控制光照强度，3000~5000lx；d温度控制在24~27℃；第一天每小时摇瓶1次；e一天后每天摇瓶3次;f藻细胞密度达到90×10⁴cell/ml转入下一阶段培养。

4.一种杜氏盐藻光发酵培养液配方及其快速培养方法，其特征是，二、三级培养工艺流程如下：a投放培养液2/3于半透明塑料水塔内；b培养按照藻种接种密度为2.0~4.0×10⁴cell/ml进行接种；c控制光照强度，3000~5000lx；d 温度控制在24~27℃；e期间培养液循环流动培养；f5~7天即可达800~900×10⁴个/mL。