CN104277976A - 盐生杜氏藻提纯和驯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种盐生杜氏藻提纯和驯化方法，属水产养殖领域。微藻提纯传统上常用微吸管分离法，该法易找到特定的种类，设备也较简单，但操作难度较大，往往需要几次至十几次才能成功，且仅适于分离个体较大藻类。本发明提供的盐生杜氏藻的液枪提纯法，原理是：将藻液稀释到每100微升藻液恰好含有1个盐生杜氏藻细胞，后用液枪吸取100微升藻液到装有已经配好的培养基的试管中，放在光照培养箱中培养45-60天后，用显微镜检查试管中藻液，如试管藻液中只含有盐生杜氏藻一种细胞，说明分离成功，抛弃那些有杂藻或原生动物的试管。本法操作简便，省时省力，设备简单，成功率高，易于推广。

Description

盐生杜氏藻提纯和驯化方法

技术领域

本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种盐生杜氏藻提纯和驯化方法。

背景技术

盐生杜氏藻Dunaliella salina是一种生活在内陆盐湖的双鞭毛单细胞真核生物，可耐高盐度(20-300‰)。杜氏藻在胁迫条件下可大量积累β-胡萝卜素，最高可达干重的14％，为自然界所有生物之首，因此早在1966年，Massyuk就提出可大规模培养杜氏藻生产β-胡萝卜素，另外杜氏藻含有的甘油可达干重的40％，具有生产甘油的潜在前途。β-胡萝卜素有猝灭人体自由基、延缓衰老、抑制肿瘤转化及抗癌等生物活性功能，受到广泛瞩目。临床试验表明，盐生杜氏藻提取的盐藻素对调节血压、降低血脂、降血糖、糖尿病、酒精肝、脂肪肝、胃溃疡、胃炎、白内障、夜盲症、干眼病有较好疗效且可明显提高机体免疫力。盐生杜氏藻还是一种良好的水产动物饲料，美国、澳大利亚、以色列、日本等很早就开始了杜氏藻研究并逐步进入规模化养殖，我国拥有漫长的海岸线和众多内陆盐湖，具有开展盐生杜氏藻生产优越的自然条件。

在盐生杜氏藻培养过程中，常出现这样一个难题：随着培养时间的延长，藻液中逐渐滋生了很多细菌、原生动物、杂藻等，且数量越来越多，严重影响了藻类的继续繁殖和生长，抑制了藻类产量的提高，需要对藻种进行提纯。微藻提纯传统上最常用的是微吸管分离法，其原理是：在无菌操作条件下，用极细的微吸管，在显微镜下把目标藻样从一个小水体转移到另一个试管，采用同样的方法反复操作，直到镜检水滴中只有目标单种为止。具体方法是：在微吸管的顶端套一条长约8cm的医用乳胶管，分离操作时，用手指压紧乳胶管以控制吸取动作。将分离的水样置于载玻片上，在显微镜下把微吸管口对准要分离的藻细胞，放松手指，藻细胞被吸入微吸管；接着把吸出的水滴放在另一载玻片上，显微镜检查水滴中是否只吸到藻细胞，如此反复操作，直至达到单种分离的目的，然后把分离出的藻细胞冲入预先装有培养液的试管内，放在适宜的光照和温度下培养，试管有藻色后镜检，培养为单种的试管，其它不合格的弃掉。该法易找到特定的种类，所用设备也较简单，但操作技术难度较大，吸取一个单细胞往往需要几次至十几次才能成功，且仅适于分离螺旋藻、骨条藻等个体较大或丝状藻类，较小藻类用此法则比较困难。

微藻提纯除微吸管分离法外，还有水滴分离法、固体培养基分离法、喷雾法、划线法等，这几种方法或多或少存在着操作繁琐麻烦、工作量大、目的性差、难度系数高、仪器复杂、设备昂贵等缺点。为了克服传统技术的不足，本发明提供了一种盐生杜氏藻的液枪提纯法，其原理是：将混有杂藻或原生动物的藻液稀释到每100微升藻液恰好含有1个盐生杜氏藻细胞的程度，然后用液枪吸取100微升藻液到装有已经配好的培养基的试管中，将试管放在光照培养箱中培养45-60天后，用显微镜检查试管中的藻液，如果试管藻液中只含有盐生杜氏藻一种细胞，说明分离成功，抛弃那些有杂藻或原生动物的试管。本法操作简便，省时省力，设备简单，成功率高，易于推广，花钱少，效益高。

发明内容

为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种盐生杜氏藻的液枪提纯法，方法如下：

步骤1：培养液的配制：硝酸铵60毫克，尿素24毫克，磷酸二氢钾16毫克，碳酸氢钠300毫克，柠檬酸铁3毫克，海泥浸出液1毫升，f/2微量元素溶液1毫升，f/2维生素溶液1毫升，煮沸冷却后的海水1000毫升；

步骤2：取消毒过且带螺旋盖的试管100只，分别装入上述培养液10毫升，盖上螺旋盖，插入试管架，备用；

步骤3：取一1500毫升消毒过的三角烧瓶，装入步骤1所述培养液100毫升，用液枪转移2微升密度为每毫升50万个细胞、带有杂藻的藻液，摇匀，备用；

步骤4：用液枪吸取100微升步骤3的藻液加入到步骤2中的试管中，盖好螺旋盖，轻轻摇匀，放在光照强度4000lux，温度25℃的光照培养箱中培养，每天轻轻摇动3次，45-60天后可见培养液呈淡草绿色，用显微镜逐一检查，如果藻液中只有盐生杜氏藻而没有杂藻或原生动物，即可将试管中的藻液转移到100毫升的三角烧瓶中，再加入50毫升步骤1所述的培养液，继续培养7天，提纯完毕。

另外，盐生杜氏藻原产地是盐度为350‰的内陆盐湖即饱和卤水，经过驯化以后可以在盐度为30‰的普通海水中生长、发育和繁殖，具体驯化方法是：取一个消毒过的500毫升的的三角烧瓶，加入100毫升饱和卤水培养的藻液，补充20毫升步骤1所述的培养液，加入0.5毫克α-萘乙酸，再用液枪加入3微升丙二醇，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，放在光照4000lux，温度为25℃的光照培养箱中培养，12小时后，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，在同一光照培养箱中培养，12小时后，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，在光照培养箱中继续培养，如此反复，加入30次也就是300毫升蒸馏水，此时用显微镜检查，可见盐生杜氏藻生长正常，游泳活泼，驯化完毕。

有益结果

微藻提纯传统上最常用的是微吸管分离法，其原理是：在无菌操作条件下，用极细的微吸管，在显微镜下把目标藻样从一个小水体转移到另一个试管，采用同样的方法反复操作，直到镜检水滴中只有目标单种为止。该法特点是易找到特定的种类，所用设备也较简单，但操作技术难度较大，吸取一个单细胞往往需要几次至十几次才能成功，且仅适于分离个体较大或丝状藻类，如螺旋藻、骨条藻等，较小藻类用此法比较困难。微藻提纯除微吸管分离法外，还有水滴分离法、固体培养基分离方法、喷雾法、划线法等，这几种方法或多或少存在着工作较繁琐、工作量大、目的性较差、难度系数高、操作麻烦、仪器复杂、设备昂贵等缺点。为了克服传统技术的不足，本发明提供了一种盐生杜氏藻的液枪提纯法。本法操作简便，省时省力，设备简单，成功率高，易于推广，花钱少，效益高。

附图说明

图1为盐生杜氏藻液枪提纯法具体操作步骤；

图2为盐生杜氏藻驯化方法具体操作步骤。

具体实施方式

一种盐生杜氏藻的液枪提纯方法，步骤如下：

步骤1，培养液的配制：硝酸铵60毫克，尿素24毫克，磷酸二氢钾16毫克，碳酸氢钠300毫克，柠檬酸铁3毫克，海泥浸出液1毫升，f/2微量元素溶液1毫升，f/2维生素溶液1毫升，煮沸冷却后的海水1000毫升；步骤2，取消毒过且带螺旋盖的试管100只，分别装入上述培养液10毫升，盖上螺旋盖，插入试管架，备用；步骤3，取一1500毫升消毒过的三角烧瓶，装入步骤1所述培养液100毫升，用液枪转移2微升密度为每毫升50万个细胞、带有杂藻的藻液，摇匀，备用；步骤4，用液枪吸取100微升步骤3的藻液加入到步骤2中的试管中，盖好螺旋盖，轻轻摇匀，放在光照强度4000lux，温度25℃的光照培养箱中培养，每天轻轻摇动3次，45-60天后可见培养液呈淡草绿色，用显微镜逐一检查，如果藻液中只有盐生杜氏藻而没有杂藻或原生动物，即可将试管中的藻液转移到100毫升的三角烧瓶中，再加入50毫升步骤1所述的培养液，继续培养7天，提纯完毕。

所述的一种盐生杜氏藻的液枪提纯方法得到的盐生杜氏藻的驯化方法，步骤如下：

盐生杜氏藻原产地是盐度为350‰的内陆盐湖即饱和卤水，经过驯化以后能在盐度为30‰的普通海水中生长、发育和繁殖，具体驯化方法是：取一个消毒过的500毫升的的三角烧瓶，加入100毫升饱和卤水培养的藻液，补充20毫升步骤1所述的培养液，加入0.5毫克α-萘乙酸，再用液枪加入3微升丙二醇，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，放在光照4000lux，温度为25℃的光照培养箱中培养，12小时后，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，在同一光照培养箱中培养，12小时后，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，在光照培养箱中继续培养，如此反复，加入30次也就是300毫升蒸馏水，此时用显微镜检查，可见盐生杜氏藻生长正常，游泳活泼，驯化完毕。

步骤1中f/2微量元素溶液配方：ZnSO₄·4H₂O 23毫克，MnCl₂·4H₂O 178毫克，CuSO₄·5H₂O10毫克，FeC₆H₅O₇·5H₂O 3.9克，Na₂MoO₄·2H₂O 7.3毫克，CoCl₂·6H₂O 12毫克，Na₂EDTA 4.35克，蒸馏水1000毫升；

步骤1中f/2维生素溶液配方：维生素B₁₂ 0.5毫克，维生素B₁ 100毫克，维生素H0.5毫克，蒸馏水1000毫升；

步骤1中海泥浸出液制备方法：取比较肥沃又不於黑的海泥，以1份泥加2份淡水，充分搅拌均匀，静置2分钟，取上层泥浆于铝锅中，按每1000毫升泥浆加1克NaOH的量加入NaOH，煮沸25分钟。煮时需不断搅拌均匀，煮后静置、冷却24小时取上清液备用；

步骤1中的柠檬酸铁(FeC₆H₅O₇·5H₂O)较难溶解，可加少量自来水在火炉上微热至80-90℃，并不断搅拌至全部融化；

步骤1、2、3、4中所有操作均需在超净工作台上进行，以达无菌操作目的；

步骤1中所用化学药品均需分析纯级别。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种盐生杜氏藻的液枪提纯方法，其特征在于步骤如下：

步骤1，培养液的配制：硝酸铵60毫克，尿素24毫克，磷酸二氢钾16毫克，碳酸氢钠300毫克，柠檬酸铁3毫克，海泥浸出液1毫升，f/2微量元素溶液1毫升，f/2维生素溶液1毫升，煮沸冷却后的海水1000毫升；步骤2，取消毒过且带螺旋盖的试管100只，分别装入上述培养液10毫升，盖上螺旋盖，插入试管架，备用；步骤3，取一1500毫升消毒过的三角烧瓶，装入步骤1所述培养液100毫升，用液枪转移2微升密度为每毫升50万个细胞、带有杂藻的藻液，摇匀，备用；步骤4，用液枪吸取100微升步骤3的藻液加入到步骤2中的试管中，盖好螺旋盖，轻轻摇匀，放在光照强度4000lux，温度25℃的光照培养箱中培养，每天轻轻摇动3次，45-60天后可见培养液呈淡草绿色，用显微镜逐一检查，如果藻液中只有盐生杜氏藻而没有杂藻或原生动物，即可将试管中的藻液转移到100毫升的三角烧瓶中，再加入50毫升步骤1所述的培养液，继续培养7天，提纯完毕。

2.如权利要求1所述的一种盐生杜氏藻的液枪提纯方法得到的盐生杜氏藻的驯化方法，其特征在于步骤如下：

盐生杜氏藻原产地是盐度为350％的内陆盐湖即饱和卤水，经过驯化以后能在盐度为30‰的普通海水中生长、发育和繁殖，具体驯化方法是：取一个消毒过的500毫升的的三角烧瓶，加入100毫升饱和卤水培养的藻液，补充20毫升步骤1所述的培养液，加入0.5毫克α-萘乙酸，再用液枪加入3微升丙二醇，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，放在光照40001ux，温度为25℃的光照培养箱中培养，12小时后，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，在同一光照培养箱中培养，12小时后，再加入10毫升蒸馏水，摇匀，在光照培养箱中继续培养，如此反复，加入30次也就是300毫升蒸馏水，此时用显微镜检查，可见盐生杜氏藻生长正常，游泳活泼，驯化完毕。