CN102643750B - 亚心形扁藻培养基配方及三级培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种亚心形扁藻培养基及其三级培养方法，配方如下：硝酸钠100mg，磷酸二氢钾45mg，碳酸氢钠800mg，柠檬酸铁0.2mg，人尿2ml，改良f/2维生素溶液1ml，消毒海水1000ml。所述改良f/2维生素溶液配制方法为：维生素B12，0.5mg；维生素B1，100mg；维生素H，0.5mg；纯水定容至1000ml。实验结果表明，使用优化培养基并采用三级培养亚心形扁藻具有生长速度快、产量高、成本低、易于操作、不易污染的优点。
Description
技术领域
本发明属于海洋微藻养殖域，尤其涉及一种亚心形扁藻培养基配方及三级培养方法。
背景技术
目前，海洋微藻种类繁多、生长速度快、适应性强、易于培养。微藻含有某些特异的高附加值生物活性成分，因此被广泛应用于食品工业、水产养殖、医药美容、废水处理和生物能源等领域，有重要经济价值。亚心型扁藻是研究和应用最广泛的微藻之一。
亚心型扁藻为一种海产单细胞浮游藻类，适应性强，上浮性好，生长繁殖迅速，能够合成高浓度的多不饱和脂肪酸PuFA，常作为鱼、虾、贝类幼体的开口饵料及饵料动物的饵料。
目前，亚心形扁藻规模化培养存在的主要问题是藻细胞生长缓慢、倍增时间长。合适的培养基是实现亚心形扁藻高密度培养的重要因素之一。以前使用的扁藻培养基没有加入碳酸氢钠，但我的实验表明，亚心形扁藻除了能利用空气中游离的CO2，还能有效地利用培养液中的HCO3 -作为碳源。添加碳酸氢钠不仅缩短了亚心形扁藻的倍增时间，而且延长了亚心形扁藻的生长时间。大量实验表明：添加0.8g/L的碳酸氢钠能大大提高生长速度。另外，传统的培养基磷酸二氢钾添加量为5-10mg/L，我的实验表明，将磷酸二氢钾添加量提高到45mg/L，亚心形扁藻的产量能提高47％。
总之，使用优化培养基并采用三级培养亚心形扁藻方法具有生长速度快、产量高、成本低的优势。
发明内容
为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种亚心形扁藻培养基配方及三级培养方法，具体技术方案如下：
一种亚心形扁藻培养基，配方如下：硝酸钠100mg，磷酸二氢钾45mg，碳酸氢钠800mg，柠檬酸铁0.2mg，人尿2ml，改良f/2维生素溶液1ml，消毒海水1000ml。所述改良f/2维生素溶液配制方法为：维生素B12，0.5mg；维生素B1，100mg；维生素H，0.5mg；纯水定容至1000ml。
应用本发明所提供的培养基对亚心形扁藻进行三级培养，包括如下步骤：1)一级培养，即用3000-20000ml玻璃瓶培养。一般接种密度为2×104-5×104cell/ml。消毒瓶中加入上述营养盐，用酒精棉擦拭瓶口，用消毒的滤纸封口，摇匀后，置于光线充足处。最佳光照强度5000-8000lx，室温24～26℃，每小时摇动一次；5-6天细胞密度达到4×105-8×105cell/ml即可转入二级培养；2)二级培养，即用3m3玻璃钢水槽或塑料薄膜袋封闭式充气一次性培养。培养用水为煮过的水或消毒水。接种量1∶10～1∶20。接种后，玻璃钢水槽用消毒的塑料布遮盖，24小时连续充气，日光灯照射。每天视藻液的颜色、浓度、生长情况补充培养用水，经5～6天即可转到三级生产性培养；3)三级培养，即用8m3玻璃钢水槽或水泥池封闭或开放式充气一次性培养。培养用水经次氯酸钠或漂白粉处理消毒，培养方法与二级培养基本相同，接种量据情掌握，但不宜低于1∶50。充气量达到藻液翻腾，一般经6天培养，藻细胞密度达到4×105-10×105cell/ml时，即可用于投喂青蛤的D型幼虫、日本对虾的蚤状幼体等。
进一步的，所述的亚心形扁藻培养基的三级培养方法，其特征在于包括如下步骤：
1)一级培养，即用3000-20000ml玻璃瓶培养；一般接种密度为2×104～5×104cell/ml；消毒瓶中加入上述营养盐，用酒精棉擦拭瓶口，用消毒的滤纸封口，摇匀后，置于光线充足处；最佳光照强度2000-4000lx，室温18～25℃，光暗比L∶D＝12h∶12h～14h∶10h，盐度4～58每小时摇动一次；5-6天细胞密度达到4×105-8×105cell/ml即可转入二级培养。
2)二级培养，即用3m3玻璃钢水槽或塑料薄膜袋封闭式充气一次性培养；培养用水为煮过的水或消毒水；接种量1∶10～1∶20。接种后，玻璃钢水槽用消毒的塑料布遮盖，24小时连续充气，日光灯照射；每天视藻液的颜色、浓度、生长情况补充培养用水，经5～6天即可转到三级生产性培养；
3)三级培养，即用8m3玻璃钢水槽或水泥池封闭或开放式充气一次性培养。培养用水经次氯酸钠或漂白粉处理消毒，培养方法与二级培养基本相同，接种量据情掌握，但不宜低于1∶50；充气量达到藻液翻腾，一般经6天培养，藻细胞密度达到4×105-10×105cell/ml时，即可用于投喂青蛤的D型幼虫、日本对虾的蚤状幼体。
有益效果：
实验结果表明，使用优化培养基并采用三级培养亚心形扁藻具有生长速度快、产量高、成本低、易于操作、不易污染的优点。
具体实施方式
培养基配制方法
1柠檬酸铁较难溶解，可加少量自来水在火炉上微热至80-90℃，并不断搅拌至全部融化；
2加营养盐的过程中需不断搅水，而且各种营养盐按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；
3各种营养盐可先配成浓度较高的母液，再依次添加；
4三级培养各阶段营养盐配方和浓度相同。
一种亚心形扁藻培养基，其特征在于该亚心形扁藻培养基配方如下：硝酸钠100mg，磷酸二氢钾45mg，碳酸氢钠800mg，柠檬酸铁0.2mg，人尿2ml，改良f/2维生素溶液1ml，消毒海水1000ml。所述改良f/2维生素溶液配制方法为：维生素B12，0.5mg；维生素B1，100mg；维生素H，0.5mg；纯水定容至1000ml。
亚心形扁藻三级培养方法
1一级培养
培养容器为3000ml-20000ml玻璃瓶。在消毒培养用水中加入上述营养盐。选择生命力旺盛、无污染的藻液进行接种培养。将藻种上清液缓慢倒入玻璃瓶中，一般接种密度为2×104cell/ml。最后用酒精棉擦拭瓶口，用消毒的滤纸封口，摇匀后，置于光线充足处。最佳光照强度5000-8000lx，室温24～26℃，每小时摇动一次，5-6天细胞密度达到4×105-8×105cell/ml即可转入二级培养。
2二级培养
培养容器为3m3玻璃钢水槽、塑料薄膜袋封闭式充气一次性培养。培养用水为煮过的水或消毒水。扩种时，将藻液倒入容器中，用泵将水打入藻液中，加入相应营养盐。接种量1∶10～1∶20。接种后，玻璃钢水槽用消毒的塑料布遮盖，24小时连续充气，日光灯照射，最佳光照强度5000-8000lx，每天视藻液的颜色、浓度、生长情况添加营养盐和消毒培养用水。经5～6天即可转入三级生产性培养。
3三级培养
培养容器为8m3玻璃钢水槽、水泥池封闭式或开放式充气一次性培养。培养用水经次氯酸钠或漂白粉处理消毒。培养方法与二级培养基本相同。接种量据情掌握，但不宜低于1∶50。充气量达到藻液翻腾，一般经6天培养，藻细胞密度达到4×105-10×105cell/ml时，即可用于投喂青蛤的D型幼虫、锯缘青蟹的Z幼体和南美白对虾、日本对虾的蚤状幼体等。
进一步的，所述的亚心形扁藻培养基的三级培养方法，其特征在于包括如下步骤：
1)一级培养，即用3000-20000ml玻璃瓶培养；一般接种密度为2×104～5×104cell/ml；消毒瓶中加入上述营养盐，用酒精棉擦拭瓶口，用消毒的滤纸封口，摇匀后，置于光线充足处；最佳光照强度2000-4000lx，室温18～25℃，光暗比L∶D＝12h∶12h～14h∶10h，盐度4～58每小时摇动一次；5-6天细胞密度达到4×105-8×105cell/ml即可转入二级培养。
2)二级培养，即用3m3玻璃钢水槽或塑料薄膜袋封闭式充气一次性培养；培养用水为煮过的水或消毒水；接种量1∶10～1∶20。接种后，玻璃钢水槽用消毒的塑料布遮盖，24小时连续充气，日光灯照射；每天视藻液的颜色、浓度、生长情况补充培养用水，经5～6天即可转到三级生产性培养；
3)三级培养，即用8m3玻璃钢水槽或水泥池封闭或开放式充气一次性培养。培养用水经次氯酸钠或漂白粉处理消毒，培养方法与二级培养基本相同，接种量据情掌握，但不宜低于1∶50；充气量达到藻液翻腾，一般经6天培养，藻细胞密度达到4×105-10×105cell/ml时，即可用于投喂青蛤的D型幼虫、日本对虾的蚤状幼体。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (2)
1.一种亚心形扁藻培养基的三级培养方法，其特征在于包括如下步骤：
配置一种亚心形扁藻培养基，该亚心形扁藻培养基配方如下：硝酸钠100mg，磷酸二氢钾45mg，碳酸氢钠800mg，柠檬酸铁0.2mg，人尿2ml，改良f/2维生素溶液1ml，消毒海水1000ml；所述改良f/2维生素溶液配制方法为：维生素B12，0.5mg；维生素B1，100mg；维生素H，0.5mg；纯水定容至1000ml；
其中培养基配制步骤为：
a)柠檬酸铁较难溶解，加少量自来水在火炉上微热至80-90℃，并不断搅拌至全部融化；
b)加营养盐的过程中需不断搅水，而且各种营养盐按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；
c)各种营养盐先配成浓度较高的母液，再依次添加；
d)三级培养各阶段营养盐配方和浓度相同；
1)一级培养，即用3000-20000ml玻璃瓶培养；一般接种密度为2×104～5×104cell/ml；消毒瓶中加入上述亚心形扁藻培养基，选择生命力旺盛、无污染的藻液进行接种培养，将藻种上清液缓慢倒入玻璃瓶装中；用酒精棉擦拭瓶口，用消毒的滤纸封口，摇匀后，置于光线充足处；最佳光照强度5000-8000lx，室温24～26℃，每小时摇动一次；5-6天细胞密度达到4×105-8×105cell/ml即可转入二级培养；
2)二级培养，即用3m3玻璃钢水槽或塑料薄膜袋封闭式充气一次性培养；培养用水为煮过的水或消毒水；接种量1∶10～1∶20；接种后，玻璃钢水槽用消毒的塑料布遮盖，24小时连续充气，日光灯照射；每天视藻液的颜色、浓度、生长情况补充培养用水，经5～6天即可转到三级生产性培养；
3)三级培养，即用8m3玻璃钢水槽或水泥池封闭或开放式充气一次性培养。培养用水经次氯酸钠或漂白粉处理消毒，培养方法与二级培养基本相同，接种量据情掌握，但不宜低于1∶50；充气量达到藻液翻腾，一般经6天培养，藻细胞密度达到4×105-10×105cell/ml时，即可用于投喂青蛤的D型幼虫、日本对虾的蚤状幼体。
2.如权利要求1所述的亚心形扁藻培养基的三级培养方法，其特征在于包括如下步骤：配置一种亚心形扁藻培养基，该亚心形扁藻培养基配方如下：硝酸钠100mg，磷酸二氢钾45mg，碳酸氢钠800mg，柠檬酸铁0.2mg，人尿2ml，改良f/2维生素溶液1ml，消毒海水1000ml；所述改良f/2维生素溶液配制方法为：维生素B12，0.5mg；维生素B1，100mg；维生素H，0.5mg；纯水定容至1000ml；
其中培养基配制步骤为：
a)柠檬酸铁较难溶解，加少量自来水在火炉上微热至80-90℃，并不断搅拌至全部融化；
b)加营养盐的过程中需不断搅水，而且各种营养盐按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；
c)各种营养盐先配成浓度较高的母液，再依次添加；
d)三级培养各阶段营养盐配方和浓度相同；
1)一级培养，即用3000-20000ml玻璃瓶培养；一般接种密度为2×104～5×104cell/ml；消毒瓶中加入上述营养盐，亚心形扁藻培养基，选择生命力旺盛、无污染的藻液进行接种培养，将藻种上清液缓慢倒入玻璃瓶装中；用酒精棉擦拭瓶口，用消毒的滤纸封口，摇匀后，置于光线充足处；最佳光照强度2000-40001x，室温18～25℃，光暗比L∶D＝12h∶12h～14h∶10h，盐度4～58每小时摇动一次；5-6天细胞密度达到4×105-8×105cell/ml即可转入二级培养；
2)二级培养，即用3m3玻璃钢水槽或塑料薄膜袋封闭式充气一次性培养；培养用水为煮过的水或消毒水；接种量1∶10～1∶20；接种后，玻璃钢水槽用消毒的塑料布遮盖，24小时连续充气，日光灯照射；每天视藻液的颜色、浓度、生长情况补充培养用水，经5～6天即可转到三级生产性培养；
3)三级培养，即用8m3玻璃钢水槽或水泥池封闭或开放式充气一次性培养。培养用水经次氯酸钠或漂白粉处理消毒，培养方法与二级培养基本相同，接种量据情掌握，但不宜低于1∶50；充气量达到藻液翻腾，一般经6天培养，藻细胞密度达到4×105-10×105cell/ml时，即可用于投喂青蛤的D型幼虫、日本对虾的蚤状幼体。
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