CN116024093A - 一种盐藻培养过程中光供给的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于海洋微藻培养技术领域，具体涉及一种盐藻培养过程中光供给的方法及应用。在盐藻培养周期过程中按渐变形式（正弦光）持续对藻种进行光照输出，使藻种实现快速分裂繁殖，实现生物量快速积累。本发明通过使用连续的正弦光进行盐藻细胞高密度培养，以促进其高效利用光能进行CO₂固定，降低细胞损伤，实现快速分裂繁殖，达到生物量快速积累的目的；本发明的方法具有高效、节能、简单、成本低等优点，为盐藻的高效培养提供依据，具有重要经济价值。

Description

一种盐藻培养过程中光供给的方法及应用

技术领域

本发明属于海洋微藻培养技术领域，具体涉及一种盐藻培养过程中光供给的方法及应用。

背景技术

微藻生物资源因具有光合效率高、富含多种高值代谢产物、可集约化高密度培养等优势，成为重要的生物资源，服务于食品、医药、能源、环境等领域。通过高密度培养实现微藻生物量的采收是进行下游开发和利用的前提。目前，已经实现工业化生产的经济微藻包括盐藻、雨生红球藻等，其生产工艺一般采用两步法：第一步在最优化的培养条件（主要包括适宜的光照、温度、营养等）下，实现细胞生物量的快速积累；第二步将积累了足够生物量的微藻转入逆境条件（强光照、寡营养、高盐度等）下，进行次级代谢产物（例如β-胡萝卜素、虾青素等）的快速诱导，采收后进行下游加工。

因此，微藻细胞生物量的快速和高效积累是微藻规模化养殖的重要环节，只有确保足够的生物量，才能为后续的高值代谢产物的诱导提供物质基础。正因如此，诸多研究围绕生物量的快速积累展开。要从根本上突破微藻细胞生物量的增加，必须基于生物积累的机理进行相关条件优化。微藻细胞生物量的积累依赖于细胞光合作用固碳过程。其光合固碳的关键酶——Rubisco，也是世界上含量最多的蛋白质，催化了光合作用中CO₂固定的关键步骤，是光合作用效率的限制生物酶。Rubisco可进行双向反应：既可以与CO₂结合，发生羧化反应，进行CO₂的固定，合成有机物；亦可以同O₂结合，发生加氧反应，消耗有机物，降低了光合作用固定CO₂的效率。据Singh等人发表在Current microbiology上的研究，表明该过程可导致30%生物量的损失，成为了光合作用重要限制因素之一。为提高光合作用效率，微藻利用碳浓缩机制（CCM）提高Rubisco周围CO₂浓度，以促进羧化反应的发生。但是CCM的效率因物种和培养条件的不同而受限制。

盐藻作为生产天然β-胡萝卜素的重要微藻，其生产过程使用较高盐度的培养基；由于高盐碱环境中，溶解性CO₂浓度较低，培养液中的碳酸盐多以CO₃ ^-和HCO₃ ^-形式存在，导致可用于光合作用的CO₂浓度较低。针对此，可通过向溶液中额外添加碳酸氢钠（如专利CN201810283248.1所述）、通入空气（如专利CN202210496090.2中所述）或者CO₂（如专利CN202110715799.2所述）以克服这一瓶颈，但是上述操作均会增加生产成本。需通过其它形式以低成本提高CO₂浓度并维持相对较低的O₂浓度，进而促进盐藻Rubisco酶进行固定CO₂的羧化反应，实现生物量的快速积累。

同时，光合作用进行必须依赖光照。在人工高密度培养盐藻过程中，为提高生产效率，需要额外补给光照，在光照阶段多以恒定强度的光照补给。例如，“一种杜氏盐藻的优化培养方法”（CN201910750711.3）描述了在盐藻生物量积累阶段使用光照与黑暗交替形式补给光照，时长比值范围是光照：黑暗=3～5:1；“一种杜氏盐藻的连续培育方法”（CN202010240030.5），则采用恒定的光照：黑暗=1:1进行培养。这些已知技术多采用恒定强度的光照。基于光合作用的基本原理，盐藻在光照阶段接受光照，从培养液吸收CO₂，同时放出O₂；导致培养液中CO₂浓度逐渐降低，O₂逐渐升高；同时，持续间断的恒定光照，在光照阶段光强超出细胞所能吸收的能量，则会引起光合膜蛋白的光氧化损伤，而在黑暗阶段没有光照，细胞无法进行光合作用，进而最终导致光合效率的降低。

因此，通过改变光供给的形式，可提高盐藻细胞生物量，如Yimei Xi等人发表的题为“Effects of different light regimes on Dunaliella salinagrowth andβ-caroteneaccumulation”（Algal Research 52 (2020) 102111）的论文，描述了一种模拟自然界光的形式，使得盐藻细胞提高了光能利用效率，实现了10-55%生物量的提高，但是该方案仍然为光照和黑暗交替的形式，会引起黑暗阶段盐藻生物量的损失。Yanan Xu等人发表的题为“The influence of photoperiod and light intensity on the growth andphotosynthesis of Dunaliella salina(Chlorophyta) CCAP 19/30”（Plant Physiologyand Biochemistry 106 (2016) 305-315）的论文，表明，简单地延长恒定光的照射时间，并不能增加盐藻细胞生物量，且恒定的强光照会引起细胞损伤。

因此，急需提供一种实现盐藻细胞生物量的高效积累，同时降低培养成本的培养方式。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在缺点，提供一种实现盐藻细胞生物量的高效积累，同时降低培养成本的盐藻培养过程中光供给的方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种盐藻培养过程中光供给的方法，在盐藻培养周期过程中按渐变形式（正弦光）持续对藻种进行光照输出，使盐藻实现快速分裂繁殖，实现生物量快速积累。

所述渐变形式持续的光照输出强度按下述公式，

 y=E₀+E₁×|sin(π/T)×x|

 其中，y为时间x时的光强；E₀为基础光强；E₁为正弦光的最大值；T为正弦光1个循环周期的时间长度。

所述x为：培养时间（单位：分钟），依据单个盐藻培养周期，即从接种至收获之间的时间确定，按照与生产周期等长的时间确定；

 E₀为：初始接种盐藻为最佳活性时的基础光强（单位：μmol photons m^-2s^-1），依据初始接种密度确定；

 E₁为：正弦光最大峰值（单位：μmol photons m^-2s^-1），依据培养液最终采收时所需要浓度OD₆₈₀确定；

 T为：一个光周期的时间长度（单位：分钟），其依据培养液溶氧DO确定。

所述E₀的范围是2-20μmol photons m^-2 s^-1；E₁的范围是200-2000μmol photons m^-2 s^-1；x的范围是4320分钟（即最短3天）-14400分钟（即最长10天）；T的范围是1分钟-1440分钟（即一个光周期长度可从5分钟至1天）。

所述培养体系初始OD₆₈₀为0.02-0.1时，T不超过5分钟；培养体系初始OD₆₈₀ 为0.1-0.2范围内时，T为5-20分钟。

具体为

 （1）活化：将单克隆无菌盐藻的藻落转入无菌的DM培养液中；在细胞培养瓶中进行细胞活化，活化过程为：温度25℃，光照200μmol photons m^-2s^-1条件下静止放置48h，使用显微镜检测细胞95%以上变为游动后活化结束；

 （2）接种：测量活化后藻液OD₆₈₀，依据活化后藻液体积和DM培养液目标的体积，按照接种后OD₆₈₀为0.02-0.2范围计算体积，将活化后盐藻液转至无菌的DM培养液中，将培养液转入平板式光生物反应器；

 （3）在盐藻培养周期过程中按渐变形式持续对藻种进行光照输出，设定光照强度条件：按下述公式如下：

 y=E₀+E₁×|sin(π/T)×x|

 其中，y为时间x时的光强；E₀为基础光强；E₁为正弦光的最大峰值；T为1个正弦光循环周期的时间长度；

 （4）通气条件：培养过程中通入无菌过滤空气，CO₂的体积比为0.04%至5%；

 （5）温度条件：培养条件温度为恒温25±1℃；

 （6）按照上述步骤（3）、（4）和（5）的条件对转入至平板式光生物反应器中培养3天-10天。

一种所述方法的应用，其特征在于：所述方法在提高盐藻细胞生物量中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

 1. 本发明通过将传统间断光照，更改为持续光照，可实现了盐藻细胞持续接受光照，避免了传统的间断式光照方式中细胞在黑暗条件下只进行呼吸作用，实现了细胞持续固定CO₂和持续分裂；

 2. 与传统间断光照相比，使用持续正弦光，取消了黑暗阶段，也就使得黑暗阶段细胞呼吸作用对有机物的消耗减为0，提高了生物质总积累效率；

 3. 本发明通过将恒定光照改进为渐变的正弦光照，可降低盐藻细胞在持续、恒定光培养过程中的逐渐升高的溶解性O₂引起的光呼吸损伤，最终实现细胞生物量的提高；

 4. 本发明削弱了盐藻细胞在高盐溶液中低CO₂浓度对光合作用和生物量积累的限制，充分利用了Rubisco酶固定CO₂的特性，依据初始接种密度调整基础光强；利用持续正弦光，降低溶解性O₂、提高培养液中的溶解性CO₂，最终在不增加能耗的前提下，实现盐藻生物量的增加；

 5. 本发明在不降低细胞总照度的前提下，可避免光源长期处于高功率状态下，实现光源寿命的延长；

 6. 本发明通过使用连续的正弦光进行盐藻细胞高密度培养，以促进其高效利用光能进行CO₂固定，降低细胞损伤，实现快速分裂繁殖，达到生物量快速积累的目的；本发明的方法具有高效、节能、简单、成本低等优点，为盐藻的高效培养提供依据，具有重要经济价值。

附图说明

图1为本发明实施例提供的采用传统间断恒定光方式输出光的模式图。

图2为本发明实施例提供的采用持续正弦光方式输出光的模式图。

图3为本发明实施例1所采用的光周期T为5分钟的持续正弦光输出图。

图4为本发明实施例1中对照所采用的间断恒定光的输出图。

图5为本发明实施例1中对照所采用的间断恒定光培养条件下培养液CO₂和O₂变化效果图。

图6为本发明实施例1所采用的持续正弦光培养条件下培养液CO₂和O₂变化效果图。

图7为本发明实施例1中对照所采用的间断恒定光培养条件下盐藻生长OD₆₈₀和Qy变化效果图。

图8为本发明实施例1中持续正弦光下盐藻生长OD₆₈₀和Qy变化效果图。

图9为本发明实施例2所采用的光周期T为20分钟的持续正弦光输出图。

图10为本发明实施例2所采用的持续正弦光培养条件下培养液CO₂和O₂变化效果图。

图11为本发明实施例2中持续正炫光下盐藻生长OD₆₈₀和Qy变化效果图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细描述，但是本发明并不局限于下述实施方式。

本发明基于盐藻生物学特点及Rubisco酶固定CO₂的基本原理，开展的盐藻的生长、光合活性等一系列研究内容。以下举例详细描述本发明，本发明并不限定于如下实施例。

与传统形式的间断、恒定的光供给形式（如附图1所示）相比，通过使用基于细胞初始密度的、可调节光周期的、持续正弦光供给形式，实现光照逐渐增强，达到顶峰后再逐渐降低，完成一个周期（如附图2所示）。这一光照供给形式，降低了细胞长期暴露在恒定的强光照条件下，减少了光能的浪费；降低光照期间溶解性O₂的峰值，减少了对细胞的氧化损伤；由于取消了黑暗阶段，避免了黑暗阶段细胞呼吸作用导致溶解性O₂快速降低带来的潜在藻细胞缺氧损害。此外，光源在低功率和高功率之间缓慢循环，避免了其长时间处于高亮度引起的高负荷下，可延长光源的寿命，可降低生产成本。

实施例1

（1）在超净台挑取盐藻单克隆1个，转入10 mL无菌的DM培养液，在透明细胞培养瓶中进行活化；光照强度为200μmol photons m^-2 s^-1下进行细胞活化后，再将藻液转入100 mL无菌的DM培养液。

（2）接种：将100 mL活化的盐藻藻液转入平板式光生物反应器，调整添加培养液体积至最终OD₆₈₀为0.1。

（3）培养过程中光输出的设定，根据正弦光公式y=E₀+E₁×|sin(π/T)×x|，同时，根据E₀=OD₆₈₀×10，设定E₀=1μmol photons m^-2 s^-1，E₁=600μmol photons m^-2 s^-1，T=5分钟，即5分钟为一个正弦光的光周期（光输出如图3所示）；

 另外，当设定E₀=600μmol photons m^-2 s^-1，E₁=0，光照周期为12小时，黑暗周期为12小时，即光照：黑暗=1:1，模拟了自然界的白天与黑夜环境，为传统间断光照形式（光输出如图4所示），作为对照。

（4）通气条件：培养过程中通入体积比为1%浓度CO₂的空气。

（5）温度条件：培养条件温度为恒温25±1℃。

（6）培养7天并进行生长与活性监测：分别使用溶解性CO₂和O₂探头在线监测培养液，每30分钟记录一次数据。恒定间断光下，培养液中溶解性O₂浓度最高达到47%（图5），持续正弦光下O₂浓度没有超过40%（图6）；恒定间断光下，培养液中溶解性CO₂浓度在光照期快速下降（最低为0.4μM），难以供应细胞生长，但是在黑暗期又快速上升，呈现了CO₂的浪费（图5）；相对应的，持续正弦光下CO₂浓度均高于0.7μM（图6）。培养过程中取10mL细胞用于OD₆₈₀和光合活性的监测。检测第3天时，传统间断恒定光下盐藻细胞OD₆₈₀=0.62（图7），持续正弦光下细胞OD₆₈₀=0.82（图8），相比间断恒定光增加了32%；第6天OD₆₈₀达到最大值，为1.57（图8），第7天相比间断的恒定光供给方式生物量增加了4.8%。与Yimei Xi等人发表的题为“Effects of different light regimes on Dunaliella salinagrowth andβ-caroteneaccumulation”（Algal Research 52 (2020) 102111）的论文中所描述的使用2000μmolphotons m^-2 s^-1光强相比，本发明使用了600μmol photons m^-2 s^-1，显著降低了光强，将黑暗阶段的生物量损失从4.15%降低为0。

实施例2

（1）在超净台挑取盐藻单克隆，转入10 mL无菌的DM培养液，在透明细胞培养瓶中进行活化；光照强度为200μmol photons m^-2 s^-1，细胞活化后藻液转入100 mL无菌的DM培养液。

（2）接种：将100mL活化的盐藻藻转入平板式光生物反应器，调整添加培养液体积至最终OD₆₈₀为0.2。

（3）培养过程中光输出的设定，根据正弦光公式y=E₀+E₁×|sin(π/T)×x|，同时，根据E₀=OD₆₈₀×10，设定E₀=2μmol photons m^-2 s^-1；E₁=600μmol photons m^-2 s^-1，T=20分钟，即20分钟为一个正弦光的光周期（光输出模式如图9所示）。

（4）通气条件：培养过程中通入体积比为1%浓度CO₂的空气。

（5）温度条件：恒温25±1℃。

（6）培养7天并进行生长与活性监测：分别使用溶解性CO₂和O₂探头在线监测培养液，每30分钟记录一次数据。光周期为20分钟的持续正弦光下，培养液溶解性O₂浓度没有超过40%（图10）；CO₂浓度没有出现快速下降和上升，而是呈现为缓慢下降（最低为0.4μM），说明CO₂被盐藻细胞固定转化以供应细胞生长（图10）。培养过程中取10mL细胞用于OD₆₈₀和光合活性的监测。检测第3天细胞OD₆₈₀=0.99（图11），相比传统间断恒定光（图7）在第3天的生物量增加了37.5%；光合量子产率Qy=0.21；第7天OD₆₈₀达到最大值，为1.87，相比间断的恒定光供给方式生物量增加了约21.4%，且因为没有黑暗阶段，实现了黑暗阶段生物量损失为0。

Claims (6)

1.一种盐藻培养过程中光供给的方法，其特征在于：在盐藻培养周期过程中按渐变形式持续对藻种进行光照输出，使藻种实现快速分裂繁殖，实现生物量快速积累。

2.按权利要求1所述的盐藻培养过程中光供给的方法，其特征在于：所述渐变形式持续的光照输出强度按下述公式，

y=E₀ +E₁×|sin(π/T)×x|

其中，x为培养时间；y为时间x时的光强；E₀为基础光强；E₁为渐变形式的最大峰值；T为渐变形式循环1个周期的时间长度。

3.按权利要求2所述的盐藻培养过程中光供给的方法，其特征在于：所述E₀的范围是2-20μmol photons m^-2 s^-1；E₁的范围是200-2000μmol photons m^-2 s^-1；x的范围是4320分钟-14400分钟；T的范围是1分钟-1440分钟。

4.按权利要求3所述的盐藻培养过程中光供给的方法，其特征在于：培养体系初始OD₆₈₀为0.02-0.1范围内时，T不超过5分钟；培养体系初始OD₆₈₀为0.1-0.2范围内时，T为5-20分钟。

5.按权利要求1-3任一项所述的盐藻培养过程中光供给的方法，其特征在于：

（1）活化：将单克隆无菌盐藻的藻落转入无菌的DM培养液中；在细胞培养瓶中进行细胞活化；

（2）接种：测量活化后藻液OD₆₈₀，依据活化后藻液体积和培养目标体积，按照接种后OD₆₈₀为0.02-0.2范围计算体积，将活化后盐藻液转至无菌的DM培养液中，再将培养液转入平板式光生物反应器；

（3）在盐藻培养周期过程中按渐变形式持续对藻种进行光照输出，按下述公式设定光照强度条件：y=E₀ +E₁×|sin(π/T)×x|；

（4）通气条件：培养过程中通入无菌过滤空气，CO₂的体积比为0.04%至5%；

（5）温度条件：培养条件温度为恒温25±1℃；

（6）按照上述步骤（3）、（4）和（5）的条件对转入至平板式光生物反应器中培养3天-10天。

6.一种按权利要求1所述方法的应用，其特征在于：如权利要求1所述方法在培养盐藻细胞提高其生物量中的应用。

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