CN113493743A - 一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种沙漠蛋白核小球藻异养‑稀释‑光诱导培养方法。本发明将异养方式与自养方式的结合方式,大大提高沙漠蛋白核小球藻的生物量和蛋白质含量,达到高效生产大量高蛋白质含量的沙漠蛋白核小球藻的目的,不仅可在短时间内获得较高浓度的藻细胞生物量,还可诱导蛋白核小球藻内蛋白质、叶绿素等物质的积累,改善蛋白核小球藻品质,提高蛋白核小球藻的综合利用价值。此外,该方法具有操作简便、实用性强、易实现连续生产等特点,非常有利于大规模的推广和应用,以快速高效地获得大量的高含量蛋白质的沙漠蛋白核小球藻藻粉,为高品质沙漠蛋白核小球藻藻粉的生产提供技术支撑,满足工业生产的需求。
Description
技术领域
本发明涉及微藻养殖技术领域,具体为一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法。
背景技术
小球藻(chlorella sp.)是一种普生性单细胞绿藻,属于绿藻门,绿藻纲,卵囊藻科,小球藻属。我国常见的小球藻种类有蛋白核小球藻、椭圆小球藻、普通小球藻等。小球藻富含蛋白质、不饱和脂肪酸(亚油酸、亚麻酸、DHA、EPA等)、类胡萝卜素、虾青素和多种维生素,广泛应用于功能食品、饲料、化妆品和医药等领域。
现有的蛋白核小球藻藻粉生产方法主要包括开放式自养培养、密闭式异养培养、混合培养。开放式自养培养,易污染,光照、温度等培养条件易受天气影响,藻细胞浓度低,采收成本较高,密闭式异养培养一般利用葡萄糖作为碳源,采用高耗能的硝态氮如硝酸钠作为氮源,虽能够获得较为理想的藻细胞浓度,但由于培养过程一直处于黑暗条件下,后期收获的藻粉蛋白质和叶绿素等含量都较低,使得藻细胞的品质和多种生物活性功能明显不足,且培养过程中多用盐酸调节pH值,容易对发酵设备造成一定程度的损害。
塔克拉玛干沙漠绿藻作为极端环境微藻,在几十万年的进化中,其生物学特性、生理生化组分等与绿藻存在一定差异。培养条件和培养技术较为缺乏,为了解决,沙漠蛋白核小球藻自养培养生产周期长,生物量低,异养培养藻粉蛋白含量低等问题,本发明提供了一种适合沙漠蛋白核小球藻异养—稀释—光诱导培养方法,实现在短时间内获得较高品质的沙漠蛋白核小球藻。
发明内容
鉴于现有技术中所存在的问题,本发明公开了一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法,包括步骤如下:
步骤一、藻种活化:从藻种资源库取出平板划线的蛋白核小球藻,在无菌工作台中挑取单个藻株,划线于固体培养基中,置于光照培养箱中培养,培养温度28℃,光照5000lux培养15天,得到活化藻种;
步骤二、一级种子液制备:从活化藻种中挑取3-5环藻种,接种到装有50mL培养基的100mL三角瓶中,在温度28℃、光照5000lux,50r/min的振荡培养箱中培养至对数生长期108个/mL,得到一级种子液;
步骤三、二级种子液制备:将一级种子液以10%(v/v)接种量接种于装有200mL培养基的500mL三角瓶中,在温度28℃、光照5000lux,50r/min的振荡培养箱中培养48~72小时,得到二级种子液;
步骤四、三级种子液制备:将二级种子液以10%(v/v)接种量接种于装有500mL培养基的1000mL三角瓶中,在温度28℃、光照5000lux,50r/min的振荡培养箱中培养48~72小时,得到三级种子液;
步骤五、异养培养:将三级种子液作为发酵培养的种子液,按照15%的接种量接种于发酵罐中培养,发酵罐培养温度为28℃,溶氧为25%,pH为7,发酵罐转速50r/min,培养72小时后,每天取料2000mL,补充新鲜培养液2000mL,保持半连续培养体系的稳定;
步骤六、稀释-光诱导培养:在步骤五的培养过程中,每隔24小时,取样检测发酵液中蛋白核小球藻的细胞干重,初始藻细胞浓度为干重状态2.12-4.24g/L,当连续两天检测生物量无显著差异时,停止培养,藻细胞浓度为干重状态150-200g/L;将发酵罐中培养液稀释,转入60L柱状光生物反应器中连续培养,培养条件为28℃,光照10000lux,空气通气量为1L/min,每天取样检测,连续2天检测中,蛋白质含量无显著差异时,培养结束。
作为本发明的一种优选方案,步骤一至步骤四中使用的培养基均为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基。
作为本发明的一种优选方案,步骤五中使用的培养基和添加培养基均以葡萄糖浓度为20g/L的Basal培养基为基础培养基,以葡萄糖为碳源。
作为本发明的一种优选方案,步骤五中利用50%醋酸和2mol/L氢氧化钠调节发酵罐中培养液的pH。
作为本发明的一种优选方案,步骤六中稀释发酵罐中培养液所用培养基为Basal培养基。
作为本发明的一种优选方案,步骤六中结束培养后得到的蛋白核小球藻中蛋白质含量为40%-55%。
本发明的有益效果:本发明提供的沙漠蛋白核小球藻异养—稀释—光诱导的培养方法,异养方式与自养方式的结合方式,大大提高沙漠蛋白核小球藻的生物量和蛋白质含量,达到高效生产大量高蛋白质含量的沙漠蛋白核小球藻的目的,不仅可在短时间内获得较高浓度的藻细胞生物量,还可诱导蛋白核小球藻内蛋白质、叶绿素等物质的积累,改善蛋白核小球藻品质,提高蛋白核小球藻的综合利用价值。此外,该方法具有操作简便、实用性强、易实现连续生产等特点,非常有利于大规模的推广和应用,以快速高效地获得大量的高含量蛋白质的沙漠蛋白核小球藻藻粉,为高品质沙漠蛋白核小球藻藻粉的生产提供技术支撑,满足工业生产的需求。
附图说明
图1为本发明所采用的分离纯化的蛋白核小球藻图片;
图2为异养和异养—光诱导沙漠蛋白核小球藻蛋白质含量图;
图3位不同稀释倍数光诱导沙漠蛋白核小球藻的叶绿素含量图;
图4位不同稀释倍数光诱导沙漠蛋白核小球藻蛋白含量含量图。
具体实施方式
实施例1
本发明的一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法,采用的技术方案是,包括步骤如下:
步骤一、藻种活化:从藻种资源库取出平板划线的蛋白核小球藻,在无菌工作台中挑取单个藻株,划线于固体培养基中,置于光照培养箱中培养,培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基,培养温度28℃,光照5000lux培养15天,得到活化藻种;
步骤二、一级种子液制备:从活化藻种中挑取3环藻种,接种到装有50mL培养基的100mL三角瓶中,培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基,在温度28℃、光照5000lux,50r/min的振荡培养箱中培养至对数生长期108个/mL,得到一级种子液;
步骤三、二级种子液制备:将一级种子液以10%(v/v)接种量接种于装有200mL培养基的500mL三角瓶中,培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基,在温度28℃、光照5000lux,50r/min的振荡培养箱中培养48小时,得到二级种子液;
步骤四、三级种子液制备:将二级种子液以10%(v/v)接种量接种于装有500mL培养基的1000mL三角瓶中,培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基,在温度28℃、光照5000lux,50r/min的振荡培养箱中培养48小时,得到三级种子液;
步骤五、异养培养:将三级种子液作为发酵培养的种子液,按照15%的接种量接种于发酵罐中培养,发酵罐中的培养基和添加培养基均以葡萄糖浓度为20g/L的Basal培养基为基础培养基,以葡萄糖为碳源,发酵罐培养温度为28℃,溶氧为25%,pH为7,发酵罐转速50r/min,培养72小时后,每天取料2000mL,补充新鲜培养液2000mL,利用50%醋酸和2mol/L氢氧化钠调节发酵罐中培养液的pH,保持半连续培养体系的稳定;
步骤六、稀释-光诱导培养:在步骤五的培养过程中,每隔24小时,取样检测发酵液中蛋白核小球藻的细胞干重,初始藻细胞浓度为干重状态2.12g/L,当连续两天检测生物量无显著差异时,停止培养,藻细胞浓度为干重状态150g/L;将发酵罐中加入Basal培养基对培养液进行稀释,转入60L柱状光生物反应器中连续培养,培养条件为28℃,光照10000lux,空气通气量为1L/min,每天取样检测,连续2天检测中,蛋白质含量无显著差异时,培养结束;结束培养后得到的蛋白核小球藻中蛋白质含量为40%-55%。
实施例2
本发明的一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法,采用的技术方案是,包括步骤如下:
步骤一、藻种活化:从藻种资源库取出平板划线的蛋白核小球藻,在无菌工作台中挑取单个藻株,划线于固体培养基中,置于光照培养箱中培养,培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基,培养温度28℃,光照5000lux培养15天,得到活化藻种;
步骤二、一级种子液制备:从活化藻种中挑取5环藻种,接种到装有50mL培养基的100mL三角瓶中,培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基,在温度28℃、光照5000lux,50r/min的振荡培养箱中培养至对数生长期108个/mL,得到一级种子液;
步骤三、二级种子液制备:将一级种子液以10%(v/v)接种量接种于装有200mL培养基的500mL三角瓶中,培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基,在温度28℃、光照5000lux,50r/min的振荡培养箱中培养60小时,得到二级种子液;
步骤四、三级种子液制备:将二级种子液以10%(v/v)接种量接种于装有500mL培养基的1000mL三角瓶中,培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基,在温度28℃、光照5000lux,50r/min的振荡培养箱中培养60小时,得到三级种子液;
步骤五、异养培养:将三级种子液作为发酵培养的种子液,按照15%的接种量接种于发酵罐中培养,发酵罐中的培养基和添加培养基均以葡萄糖浓度为20g/L的Basal培养基为基础培养基,以葡萄糖为碳源,发酵罐培养温度为28℃,溶氧为25%,pH为7,发酵罐转速50r/min,培养72小时后,每天取料2000mL,补充新鲜培养液2000mL,利用50%醋酸和2mol/L氢氧化钠调节发酵罐中培养液的pH,保持半连续培养体系的稳定;
步骤六、稀释-光诱导培养:在步骤五的培养过程中,每隔24小时,取样检测发酵液中蛋白核小球藻的细胞干重,初始藻细胞浓度为干重状态3.21g/L,当连续两天检测生物量无显著差异时,停止培养,藻细胞浓度为干重状态170g/L;将发酵罐中加入Basal培养基对培养液进行稀释,转入60L柱状光生物反应器中连续培养,培养条件为28℃,光照10000lux,空气通气量为1L/min,每天取样检测,连续2天检测中,蛋白质含量无显著差异时,培养结束;结束培养后得到的蛋白核小球藻中蛋白质含量为40%-55%。
实施例3
本发明的一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法,采用的技术方案是,包括步骤如下:
步骤一、藻种活化:从藻种资源库取出平板划线的蛋白核小球藻,在无菌工作台中挑取单个藻株,划线于固体培养基中,置于光照培养箱中培养,培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基,培养温度28℃,光照5000lux培养15天,得到活化藻种;
步骤二、一级种子液制备:从活化藻种中挑取5环藻种,接种到装有50mL培养基的100mL三角瓶中,培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基,在温度28℃、光照5000lux,50r/min的振荡培养箱中培养至对数生长期108个/mL,得到一级种子液;
步骤三、二级种子液制备:将一级种子液以10%(v/v)接种量接种于装有200mL培养基的500mL三角瓶中,培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基,在温度28℃、光照5000lux,50r/min的振荡培养箱中培养72小时,得到二级种子液;
步骤四、三级种子液制备:将二级种子液以10%(v/v)接种量接种于装有500mL培养基的1000mL三角瓶中,培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基,在温度28℃、光照5000lux,50r/min的振荡培养箱中培养72小时,得到三级种子液;
步骤五、异养培养:将三级种子液作为发酵培养的种子液,按照15%的接种量接种于发酵罐中培养,发酵罐中的培养基和添加培养基均以葡萄糖浓度为20g/L的Basal培养基为基础培养基,以葡萄糖为碳源,发酵罐培养温度为28℃,溶氧为25%,pH为7,发酵罐转速50r/min,培养72小时后,每天取料2000mL,补充新鲜培养液2000mL,利用50%醋酸和2mol/L氢氧化钠调节发酵罐中培养液的pH,保持半连续培养体系的稳定;
步骤六、稀释-光诱导培养:在步骤五的培养过程中,每隔24小时,取样检测发酵液中蛋白核小球藻的细胞干重,初始藻细胞浓度为干重状态4.24g/L,当连续两天检测生物量无显著差异时,停止培养,藻细胞浓度为干重状态200g/L;将发酵罐中加入Basal培养基对培养液进行稀释,转入60L柱状光生物反应器中连续培养,培养条件为28℃,光照10000lux,空气通气量为1L/min,每天取样检测,连续2天检测中,蛋白质含量无显著差异时,培养结束;结束培养后得到的蛋白核小球藻中蛋白质含量为40%-55%。
Basal固体培养基主要成分及终浓度为:
培养基成分 | 终浓度mg/L | 培养基成分 | 终浓度mg/L |
NaNO<sub>3</sub> | 1250 | FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 49.8 |
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 1250 | ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 88.2 |
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 1000 | MnCl<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O | 14.2 |
EDTA | 500 | Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O | 11.92 |
H<sub>3</sub>BO<sub>4</sub> | 114.2 | CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O | 15.7 |
CaCl<sub>2</sub>·H2O | 111 | Co(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O | 4.9 |
本文中未详细说明的部件为现有技术。
上述虽然对本发明的具体实施例作了详细说明,但是本发明并不限于上述实施例,在本领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化,而不具备创造性劳动的修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (6)
1.一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法,其特征在于:包括步骤如下:
步骤一、藻种活化:从藻种资源库取出平板划线的蛋白核小球藻,在无菌工作台中挑取单个藻株,划线于固体培养基中,置于光照培养箱中培养,培养温度28℃,光照5000lux培养15天,得到活化藻种;
步骤二、一级种子液制备:从活化藻种中挑取3-5环藻种,接种到装有50mL培养基的100mL三角瓶中,在温度28℃、光照5000lux,50r/min的振荡培养箱中培养至对数生长期108个/mL,得到一级种子液;
步骤三、二级种子液制备:将一级种子液以10%(v/v)接种量接种于装有200mL培养基的500mL三角瓶中,在温度28℃、光照5000lux,50r/min的振荡培养箱中培养48~72小时,得到二级种子液;
步骤四、三级种子液制备:将二级种子液以10%(v/v)接种量接种于装有500mL培养基的1000mL三角瓶中,在温度28℃、光照5000lux,50r/min的振荡培养箱中培养48~72小时,得到三级种子液;
步骤五、异养培养:将三级种子液作为发酵培养的种子液,按照15%的接种量接种于发酵罐中培养,发酵罐培养温度为28℃,溶氧为25%,pH为7,发酵罐转速50r/min,培养72小时后,每天取料2000mL,补充新鲜培养液2000mL,保持半连续培养体系的稳定;
步骤六、稀释-光诱导培养:在步骤五的培养过程中,每隔24小时,取样检测发酵液中蛋白核小球藻的细胞干重,初始藻细胞浓度为干重状态2.12-4.24g/L,当连续两天检测生物量无显著差异时,停止培养,藻细胞浓度为干重状态150-200g/L;将发酵罐中培养液稀释,转入60L柱状光生物反应器中连续培养,培养条件为28℃,光照10000lux,空气通气量为1L/min,每天取样检测,连续2天检测中,蛋白质含量无显著差异时,培养结束。
2.根据权利要求1所述的一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法,其特征在于:步骤一至步骤四中使用的培养基均为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基。
3.根据权利要求1所述的一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法,其特征在于:步骤五中使用的培养基和添加培养基均以葡萄糖浓度为20g/L的Basal培养基为基础培养基,以葡萄糖为碳源。
4.根据权利要求1所述的一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法,其特征在于:步骤五中利用50%醋酸和2mol/L氢氧化钠调节发酵罐中培养液的pH。
5.根据权利要求1所述的一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法,其特征在于:步骤六中稀释发酵罐中培养液所用培养基为Basal培养基。
6.根据权利要求1所述的一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法,其特征在于:步骤六中结束培养后得到的蛋白核小球藻中蛋白质含量为40%-55%。
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