CN104312923A - 盐藻的收集与保种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种盐藻的收集与保种方法，属水产养殖领域。盐藻收集传统上采用离心法获得，该法易打碎细胞，胞液外流，造成损失，设备昂贵且运行费用高。本发明提供的利用甲壳素、聚丙烯酰胺和小苏打作凝絮剂来凝聚藻细胞方法，操作简便，费用少，设备简单且对细胞没有伤害，细胞获得率高，没有污染，效益高。盐藻保种传统上采用低温、低光照液体保存法，操作麻烦，费时费力，保种时间短，易污染，死亡率高，技术要求高，易失败。本发明公开的低温冰冻保种法，保种时间长，操作方便，不易污染且花钱少，冰冻时添加了冷冻保护剂，细胞成活率从原来的21％提高到92％，经济效益高，具有推广价值。

Description

盐藻的收集与保种方法

技术领域

本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种盐藻的收集与保种方法。

背景技术

盐藻Dunaliella salina是一种单细胞真核藻类，属绿藻门、绿藻纲、杜氏藻目、杜氏藻科、杜氏藻属，是迄今为止发现的最耐盐真核生物之一，属高盐逆境生物，适应性强，繁殖快，自然生活环境多为盐池、盐湖等高盐水域，特殊的环境造就了独特的生长机制。藻体卵圆、椭圆或梨形，长18-28μm，宽9.5-14μm，因没有纤维质细胞壁，外形在不同盐度、光照、温度等环境下变化较大，蛋白核及淀粉粒也随环境不同。细胞前部一般凹陷，在凹陷处生出两条等长鞭毛，比细胞长约1/3；体内有一杯状色素体，主要是叶绿素和类胡萝卜素(以β-胡萝卜素为主)。早期细胞呈草绿色，条件不良时产生β-胡萝卜素，藻体呈红色。其独特的颜色会把湖水染成红色，在西非塞内加尔首都以北35公里的瑞特巴湖，因盐藻作用，湖水呈粉红色，获得“玫瑰湖”外号。盐藻属光合自养生物，富含β-胡萝卜素，最高可达干重14％，远高于其它动植物，是β-胡萝卜素最好的天然产源，具有很大开发价值。盐藻含有70多种人体所需物质和微量元素，比例与人体的体液、细胞浆液相吻合，能改善身体机能，保护DNA，增强免疫力。用现代科技手段从盐藻中提取、浓缩、精制而成的多种营养成分称为“盐藻素”，中国中医科学院的研究和临床试验表明，盐藻素对调节血压、降低血脂、降血糖、糖尿病有显著预防和辅助治疗作用；盐藻素中富含的类胡萝卜素直接抑制癌细胞生长，可有效治疗化学致癌剂诱发的肿瘤，减轻化疗、放疗的疼痛和不适症状并可降低癌症转移和复发机率；盐藻素对酒精肝和脂肪肝有明显改善作用；盐藻中类胡萝卜素能保持、修复上皮组织，尤其对胃部常见病胃溃疡、胃炎和萎缩性溃疡及上呼吸道炎症和口腔溃疡均有很好弥合作用；盐藻素能明显提高机体免疫力，防治白内障，改善视力，对夜盲症、干眼病也有较好治疗效果。

盐藻收集传统上采用离心机来离心藻液，最后得到牙膏状的藻泥。该方法优点是没有污染和杂质，获得率较高，但缺点是由于离心力作用，易打碎细胞，胞液外流，造成损失，更大的缺点是离心设备昂贵，即使一台每小时处理0.5立方米藻液的离心设备也需要120万元，而且运行费用高，即离心所用电费太高，占整个微藻培养工艺流程支出的80％以上，严重限制着盐藻养殖业的发展。为了解决这个难题，我发明了一种利用黄泥巴和小苏打来凝聚藻细胞的方法，该法不仅操作简便，费用少，设备简陋而且对细胞没有伤害，简单易行，没有污染，效益高，可规模化生产。

关于盐藻保种方法，传统上采用低温、低光照液体保存法，也就是在低温、低光照条件下，降低藻细胞新陈代谢和活动性，每隔15-25天更换一次培养液。该法操作麻烦，费时费力，保种时间短，易污染，细胞死亡率高，技术要求高，弄不好易导致保种失败。为了克服这个缺点，我发明了一种低温冰冻保种法，不仅保种时间长，操作方便，不易污染，而且花钱少，冰冻时添加了甘油、二甲亚砜等冷冻保护剂，细胞成活率从原来的21％提高到92％，经济效益高，具有推广价值。

发明内容

为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种盐藻的收集与保种方法，方法如下：

一种盐藻的收集与保种方法，步骤如下：

将培养完毕的盐藻液，按1升藻液加入100毫克甲壳素和50毫克聚丙烯酰胺的量加入甲壳素和聚丙烯酰胺，搅拌30分钟，再按1升藻液加入80毫克小苏打(即碳酸氢钠)的量加入小苏打，再搅拌30分钟，后将藻液置于黑暗中静置、沉淀24小时，可见底部有牙膏状沉淀物，即为目的产物藻泥，弃去上清液可得；因上清液中还有少量盐藻细胞，将上清液搅拌20分钟，再沉淀24小时，再取牙膏状沉淀物即可；

盐藻保种用的培养液，配方如下：

硝酸铵4毫克，磷酸二氢钠7毫克，脯氨酸2毫克，丙酮酸盐5毫克，柠檬酸钾2毫克，甘氨酸甜菜碱12毫克，谷氨酸钠4毫克，乙酸钠4毫克，甘露醇6毫克，葡萄糖9毫克，人尿1.5毫升，甘油3毫克，二甲亚砜0.5毫克，链霉素0.1毫克，煮沸冷却后的海水1000毫升；

用一个150毫升的三角烧瓶，装入上述培养液100毫升，取生长旺盛、无污染的盐藻接种至密度达到每毫升40万个细胞，塑料薄膜封口，在光照培养箱中培养72小时，温度24℃，光照强度4500lux，然后用报纸包裹三角烧瓶，转入4℃冰箱，放置12小时，再转入0℃冰箱，放置12小时，转入-10℃冰箱，放置12小时，最后转入-16℃冰箱，长期黑暗放置保种，最多可保种24个月，后取出解冻，按-16℃、-10℃、0℃、4℃、24℃依次放置12小时的顺序依次逐渐解冻和升温，后加入50毫升新鲜培养液，细胞可在48小时后恢复活力，依靠鞭毛自由游动。

有益结果：

盐藻收集传统上采用离心机离心藻液获得，该方法优点是离心彻底，藻细胞采集率较高且没有污染和杂质，但缺点明显：由于离心力作用，易打碎细胞，胞液外流，造成损失，更大的缺点是离心设备昂贵，即使一台每小时处理0.5立方米藻液的离心设备也需要120万元，而且运行费用高，即离心机工作时所用的电费太高，占整个微藻培养工艺流程支出的80％以上，严重限制着盐藻养殖业的发展。为了解决这个难题，我发明了一种利用黄泥巴和小苏打作凝絮剂来凝聚藻细胞的方法，该方法不仅操作简便，费用少，设备简陋而且对细胞没有伤害，简单易行，细胞获得率高，没有污染，效益高，可规模化生产。关于盐藻细胞的保种方法，传统上采用低温、低光照液体保存法，也就是在较低温度、较低光照条件下培养细胞，降低藻细胞新陈代谢和活动性，每隔15-25天更换一次培养液。该法操作麻烦，费时费力，保种时间短，容易污染，细胞死亡率高，技术要求高，易失败。为了克服这个缺点，我发明了一种低温冰冻保种法，不仅保种时间长达24个月，操作方便，不易污染，而且花钱少，冰冻时添加了甘油、二甲亚砜等冷冻保护剂，细胞成活率从原来的21％提高到92％，经济效益高，具有推广价值。

附图说明

图1为显微镜下观察到的积累β-胡萝卜素后的盐藻(不经染色处理，鞭毛难以看清)；

图2为盐藻形态结构图；

其中附图标记为：1红色眼点，2蛋白核，3色素体，4鞭毛。

具体实施方式

一种盐藻的收集与保种方法，步骤如下：

将培养完毕的盐藻液，按1升藻液加入100毫克甲壳素和50毫克聚丙烯酰胺的量加入甲壳素和聚丙烯酰胺，搅拌30分钟，再按1升藻液加入80毫克小苏打(即碳酸氢钠)的量加入小苏打，再搅拌30分钟，后将藻液置于黑暗中静置、沉淀24小时，可见底部有牙膏状沉淀物，即为目的产物藻泥，弃去上清液可得；因上清液中还有少量盐藻细胞，将上清液搅拌20分钟，再沉淀24小时，再取牙膏状沉淀物即可；

盐藻保种用的培养液，配方如下：

硝酸铵4毫克，磷酸二氢钠7毫克，脯氨酸2毫克，丙酮酸盐5毫克，柠檬酸钾2毫克，甘氨酸甜菜碱12毫克，谷氨酸钠4毫克，乙酸钠4毫克，甘露醇6毫克，葡萄糖9毫克，人尿1.5毫升，甘油3毫克，二甲亚砜0.5毫克，链霉素0.1毫克，煮沸冷却后的海水1000毫升；

用一个150毫升的三角烧瓶，装入上述培养液100毫升，取生长旺盛、无污染的盐藻接种至密度达到每毫升40万个细胞，塑料薄膜封口，在光照培养箱中培养72小时，温度24℃，光照强度4500lux，然后用报纸包裹三角烧瓶，转入4℃冰箱，放置12小时，再转入0℃冰箱，放置12小时，转入-10℃冰箱，放置12小时，最后转入-16℃冰箱，长期黑暗放置保种，最多可保种24个月，后取出解冻，按-16℃、-10℃、0℃、4℃、24℃依次放置12小时的顺序依次逐渐解冻和升温，后加入50毫升新鲜培养液，细胞可在48小时后恢复活力，依靠鞭毛自由游动。

在冷冻保种过程中，至少要制作10个样品瓶，以免因瓶子打碎或其它意外原因导致保种失败。

冷冻保种过程中，根据需要，可用冰柜和冷库代替冰箱。

人尿制备方法：取人尿1000毫升，烧瓶煮沸15分钟后，冷却、沉淀24小时，弃沉渣，取上清液，装入棕色磨口塞试剂瓶，密封，置于4℃冰箱保存，备用。

盐藻保种用的培养液配方中各种营养盐要按配方中提供的顺序依次加入，同时不断搅拌，以免发生化学反应。

所用化学药品纯度均需化学纯级别。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (1)

1.一种盐藻的收集与保种方法，其特征在于步骤如下：

将培养完毕的盐藻液，按1升藻液加入100毫克甲壳素和50毫克聚丙烯酰胺的量加入甲壳素和聚丙烯酰胺，搅拌30分钟，再按1升藻液加入80毫克小苏打(即碳酸氢钠)的量加入小苏打，再搅拌30分钟，后将藻液置于黑暗中静置、沉淀24小时，可见底部有牙膏状沉淀物，即为目的产物藻泥，弃去上清液可得；因上清液中还有少量盐藻细胞，将上清液搅拌20分钟，再沉淀24小时，再取牙膏状沉淀物即可；

盐藻保种用的培养液，配方如下：

硝酸铵4毫克，磷酸二氢钠7毫克，脯氨酸2毫克，丙酮酸盐5毫克，柠檬酸钾2毫克，甘氨酸甜菜碱12毫克，谷氨酸钠4毫克，乙酸钠4毫克，甘露醇6毫克，葡萄糖9毫克，人尿1.5毫升，甘油3毫克，二甲亚砜0.5毫克，链霉素0.1毫克，煮沸冷却后的海水1000毫升；

用一个150毫升的三角烧瓶，装入上述培养液100毫升，取生长旺盛、无污染的盐藻接种至密度达到每毫升40万个细胞，塑料薄膜封口，在光照培养箱中培养72小时，温度24℃，光照强度4500lux，然后用报纸包裹三角烧瓶，转入4℃冰箱，放置12小时，再转入0℃冰箱，放置12小时，转入-10℃冰箱，放置12小时，最后转入-16℃冰箱，长期黑暗放置保种，最多可保种24个月，后取出解冻，按-16℃、-10℃、0℃、4℃、24℃依次放置12小时的顺序依次逐渐解冻和升温，后加入50毫升新鲜培养液，细胞可在48小时后恢复活力，依靠鞭毛自由游动。