CN114540155B - 藻种培养系统及藻种传代培养方法 - Google Patents

藻种培养系统及藻种传代培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种藻种培养系统及藻种传代培养方法，属于微藻生物技术领域，能够解决现有的海洋藻类培养系统无法实现海洋藻类生长环境的精准模拟和藻类长期稳定传代的技术问题。该藻种培养系统包括：CO2光照培养箱和传代培养装置，其中，传代培养装置为微藻传代培养装置或大藻传代培养装置；微藻传代培养装置或大藻传代培养装置进一步包括：预处理槽、传代槽、供气装置、搅拌装置以及光源等部件。本发明能够应用于海洋藻类稳定传代培养方面。

Description

藻种培养系统及藻种传代培养方法
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，尤其涉及一种藻种培养系统及藻种传代培养方法。
背景技术
海洋覆盖着地球表面积的71%，海洋藻类是海洋中最主要的初级生产者，通过光合作用将无机碳（CO2）转化为有机碳，其生物量及群落结构的变化在全球碳循环乃至气候变化中有重要的作用。因此，探讨海洋浮游植物生态长期变化及其与环境和气候变化的关系，有助于我们了解过去、分析现在和预判未来气候变化对海洋生物生态的影响。
基于上述内容，如何精准模拟海洋藻类的生长环境，并且实现海洋藻类的稳定传代培养，是对其开展后续研究的重要基石，但是目前，海洋藻类的培养系统及培养方法多为单因素调控，在运行过程中常出现设备稳定性不足、控制精度无法满足实验要求的问题，既不能满足多气候变化因素长期耦合模拟的需求，也无法实现海洋藻类的长期稳定传代培养。
由此可见，如何研发出一套体系完整、设备运行稳定、模拟精确度高且能够实现海洋藻类稳定传代培养的培养系统及方法是解决上述问题的关键。
发明内容
本发明针对现有技术中海洋藻类的培养系统运行过程中存在设备稳定性不足、控制精度无法满足实验要求，从而无法实现海洋藻类生长环境的精准模拟和藻类长期稳定传代的技术问题，提出一种藻种培养系统及藻种传代培养方法，具有体系完整、运行稳定、模拟生长环境精确度高且能够实现海洋藻类长期稳定传代培养等特点。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
藻种培养系统，包括CO2光照培养箱和安装于所述CO2光照培养箱内部的传代培养装置，所述传代培养装置为微藻传代培养装置或大藻传代培养装置；
其中，所述微藻传代培养装置或大藻传代培养装置包括：
预处理槽，包括第一槽体及盖设于所述第一槽体顶部的第一顶盖，所述第一顶盖上设有充气口，且第一槽体内部设有潜水泵，其出水口连接输送管路的一端，
传代槽，设置于所述预处理槽一侧，包括第二槽体和盖设于所述第二槽体顶部的第二顶盖，所述第二槽体侧壁和第二顶盖上分别设有进水口和充气口，所述输送管路的另一端通过第二槽体侧壁上的进水口连通所述传代槽，
供气装置，分别通过第一顶盖和第二顶盖上的充气口向预处理槽和传代槽中均匀通入二氧化碳气体，
搅拌装置，设置于所述第二槽体内部，用于将传代槽中的藻体充分混匀，以防藻体沉降，及
光源，设置于所述传代槽上方。
作为优选，所述微藻传代培养装置中的搅拌装置进一步包括：
搅拌扇叶，设置于所述第二槽体内的底部位置处，用于将传代槽中的藻体充分混匀，及
马达，经马达轴连接所述搅拌扇叶。
所述大藻传代培养装置中的搅拌装置进一步包括：
造浪泵，设置于所述第二槽体内的底部位置处，
转轴，设置于所述第二槽体内的底部位置处，及
马达，经马达轴连接所述转轴。
作为优选，所述供气装置进一步包括：
输气管路，一端连接供气泵，
充气石，连接所述输气管路的另一端，并放置于所述第一槽体内部，用于向预处理槽和传代槽中均匀通入二氧化碳气体，及
气体过滤膜，设置于靠近供气泵一端的输气管路上，用于过滤二氧化碳气体中的杂质。
作为优选，所述传代槽底部还设置有底座，所述第二槽体靠近底部位置处设有出水口,所述光源为LED白光灯。
作为优选，在所述大藻传代培养装置中，第二槽体上的出水口上还设置有隔藻网。
本发明还提供了一种藻种传代培养方法，该方法采用上述任一优选技术方案所述的藻种培养系统进行藻种传代培养，其中，所述藻种包含微藻和大藻。
作为优选，所述微藻的传代培养方法包括以下步骤：
取保存于平板中的微藻藻种，在超净工作台中，通过挑取单斑的方式接入液体培养基中；
待所述液体培养基中的微藻细胞培养至对数期后，将其接入微藻传代培养装置中的传代槽进行传代培养，传代槽中装有新鲜液体培养基，接种密度为1×103-1×104个/mL;
根据实验要求设定温度、光照强度、光照周期以及二氧化碳浓度条件，培养过程中根据微藻细胞浓度变化更换新鲜液体培养基，以保证微藻细胞浓度不超过1×105个/mL。
作为优选，所述大藻的传代培养方法包括以下步骤：
选取生长状态良好的大藻藻体，去除污泥并用无菌水去除大藻藻体表面杂藻附着物；
使用无菌水冲洗去除杂藻附着物的大藻藻体，将其放入封口瓶中进行促熟培养；
待藻体释放孢子后，收集孢子将其接入大藻传代培养装置中的传代槽中传代培养，传代槽中装有新鲜培养基，培养密度为1-4g鲜重/L;
根据实验要求设定温度、光照强度、光照周期以及二氧化碳浓度条件，培养过程中根据藻种密度更换新鲜液体培养基，直至将孢子培养成大藻。
作为优选，所述更换新鲜液体培养基具体为：
对新鲜液体培养基进行污染检测，以保证无菌培养条件；
将污染检测合格的新鲜液体培养基添加至预处理槽中，并保持二氧化碳通入；
当预处理槽中新鲜液体培养基的二氧化碳浓度、温度与传代槽中的液体培养基二氧化碳浓度、温度保持一致后，再经由输送管路将其输送至所述传代槽中。
作为优选，所述大藻包括但不限于浒苔、石莼、萱藻或水云；
用于传代培养的大藻选取标准为：具有明显的世代交替，成熟期藻体最大长度＜50cm。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明提出的藻种培养系统包括CO2光照培养箱和安装于CO2光照培养箱内部的传代培养装置，该培养系统即可实现微藻的长期稳定传代培养，又能实现大藻的长期稳定传代培养；
2、本发明提出的藻种培养系统及藻种传代培养方法，其中，微藻传代培养装置和大藻传代培养装置均包括预处理槽和传代槽，预处理槽能够保证进入传代槽的新鲜培养基在温度、酸化程度等方面与传代槽保持一致，避免传代过程出现大的环境波动，从而保证藻种传代培养稳定有序进行；
3、本发明提出的藻种培养系统及藻种传代培养方法，其中，微藻传代培养装置中的搅拌扇叶搅拌充分将微藻混匀，避免充气搅拌造成的局部微藻沉降，而且搅拌扇叶周期性改变转动方向，避免藻细胞在底部形成环状沉淀；此外，充气口和搅拌扇叶共同作用，保证微藻在传代槽中均匀分布，保证传代槽中水体温度、营养盐浓度等均匀分布；
4、本发明提出的藻种培养系统及藻种传代培养方法，其中，大藻传代培养装置内置造浪泵，能够周期性改变喷水方向，防止藻体缠绕成团，造成局部藻体密度过大，引起藻体死亡；同时，充气口和内置造浪泵共同作用，保证大藻在传代槽中均匀分布，保证传代槽中水体温度、营养盐浓度等均匀分布。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的藻种培养系统的整体结构示意图；
图2为本发明实施例所提供的微藻传代培养装置的结构示意图；
图3为本发明实施例所提供的大藻传代培养装置的结构示意图。
以上各图中：
1、CO2光照培养箱；2、传代培养装置；3、显示屏；4、观察窗；5、预处理槽；6、传代槽；7、输气管路；8、充气石；9、光源；10、底座；11、灯板支架；12、气体过滤膜；13、搅拌扇叶；14、造浪泵；15、转轴；
51、第一槽体；52、第一顶盖；53、充气口；54、潜水泵；55、输送管路；
61、第二槽体；62、第二顶盖；63、进水口；64、出水口；65、隔藻网。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种藻种培养系统，包括CO2光照培养箱1和安装于CO2光照培养箱1内部的传代培养装置2，传代培养装置2为微藻传代培养装置或大藻传代培养装置；
其中，微藻传代培养装置或大藻传代培养装置包括：
预处理槽5，包括第一槽体51及盖设于第一槽体51顶部的第一顶盖52，第一顶盖52上设有充气口53，且第一槽体51内部设有潜水泵54，其出水口64连接输送管路55的一端，
传代槽6，设置于预处理槽5一侧，包括第二槽体61和盖设于第二槽体61顶部的第二顶盖62，第二槽体61侧壁和第二顶盖62上分别设有进水口63和充气口53，输送管路55的另一端通过第二槽体61侧壁上的进水口63连通传代槽6，
供气装置，分别通过第一顶盖52和第二顶盖62上的充气口53向预处理槽5和传代槽6中均匀通入二氧化碳气体，
搅拌装置，设置于第二槽体61内部，用于将传代槽6中的藻体充分混匀，以防藻体沉降，及
光源9，设置于传代槽6上方。
在一优选实施例中，微藻传代培养装置中的搅拌装置进一步包括：
搅拌扇叶13，设置于第二槽体61内的底部位置处，用于将传代槽6中的藻体充分混匀，及
马达（图中未示出），经马达轴连接搅拌扇叶13；
大藻传代培养装置中的搅拌装置进一步包括：
造浪泵14，设置于第二槽体61内的底部位置处，
转轴15，设置于第二槽体61内的底部位置处，及
马达（图中未示出），经马达轴连接转轴15。
在一优选实施例中，供气装置进一步包括：
输气管路7，一端连接供气泵，
充气石8，连接输气管路7的另一端，并放置于第一槽体51内部，用于向预处理槽5和传代槽6中均匀通入二氧化碳气体，及
气体过滤膜12，设置于靠近供气泵一端的输气管路7上，用于过滤二氧化碳气体中的杂质。
在一优选实施例中，传代槽6底部还设置有底座10，第二槽体61靠近底部位置处设有出水口64,光源9为LED白光灯。
在一优选实施例中，在大藻传代培养装置中，第二槽体61上的出水口64上还设置有隔藻网65。
本发明实施例还提供了一种藻种传代培养方法，该培养方法采用上述任一优选实施例所述的藻种培养系统进行藻种传代培养，其中，所述藻种包含微藻和大藻。
在一优选实施例中，微藻的传代培养方法包括以下步骤：
S1、取保存于平板中的微藻藻种，在超净工作台中，通过挑取单斑的方式接入液体培养基中；
S2、待所述液体培养基中的微藻细胞培养至对数期后，将其接入微藻传代培养装置中的传代槽6进行传代培养，传代槽6中装有新鲜液体培养基，接种密度为1×103-1×104个/mL;
S3、根据实验要求设定温度、光照强度、光照周期以及二氧化碳浓度条件，培养过程中根据微藻细胞浓度变化更换新鲜液体培养基，以保证微藻细胞浓度不超过1×105个/mL。
在上述S3步骤中，并未对温度、光照强度、光照周期以及二氧化碳浓度进行明确限定的原因在于：该传代培养方法适用于多种微藻，不同微藻的培养条件不同，且根据实验要求的不同上述培养条件也不相同，因此，本领域技术人员在应用上述培养方法时可根据微藻类型、实验要求对培养条件进行选择即可。
在一优选实施例中，大藻的传代培养方法包括以下步骤：
S1、选取生长状态良好的大藻藻体，去除污泥并用无菌水去除大藻藻体表面杂藻附着物；
S2、使用无菌水冲洗去除杂藻附着物的大藻藻体，将其放入封口瓶中进行促熟培养；
S3、待藻体释放孢子后，收集孢子将其接入大藻传代培养装置中的传代槽6中传代培养，传代槽6中装有新鲜培养基，培养密度为1-4g鲜重/L;
S4、根据实验要求设定温度、光照强度、光照周期以及二氧化碳浓度条件，培养过程中根据藻种密度更换新鲜液体培养基，直至将孢子培养成大藻。
在上述S4步骤中，并未对温度、光照强度、光照周期以及二氧化碳浓度进行明确限定的原因在于：该传代培养方法适用于多种大藻（包括但不限于浒苔、石莼、萱藻或水云等），不同大藻的培养条件不同，且根据实验要求的不同上述培养条件也不相同，因此，本领域技术人员在应用上述培养方法时可根据大藻类型、实验要求对培养条件进行选择即可。
在一优选实施例中，更换新鲜液体培养基具体为：
对新鲜液体培养基进行污染检测，以保证无菌培养条件；
将污染检测合格的新鲜液体培养基添加至预处理槽5中，并保持二氧化碳通入；
当预处理槽5中新鲜液体培养基的二氧化碳浓度、温度与传代槽6中的液体培养基二氧化碳浓度、温度保持一致后，再经由输送管路55将其输送至传代槽6中。
在一优选实施例中，大藻包括但不限于浒苔、石莼、萱藻或水云；
用于传代培养的大藻选取标准为：具有明显的世代交替，成熟期藻体最大长度＜50cm，且成体体积不宜过大。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的藻种培养系统及藻种传代培养方法，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1
本实施例提供了一种微藻的传代培养方法，具体为：
（1）取保存于平板中的冰藻藻种，在超净工作台中，通过挑取单斑的方式接入液体培养基中；
（2）待液体培养基中的微藻细胞培养至对数期后，将其接入微藻传代培养装置中的传代槽6进行传代培养，传代槽6中装有新鲜液体培养基，接种密度为1×103-1×104个/mL;
（3）根据实验要求设定温度20℃、光照强度100μmol photons∙m-2∙s-1、光照周期12:12h，二氧化碳浓度分别为280ppm、400ppm、700ppm、1000ppm、1500ppm、2000ppm，培养过程中根据微藻细胞浓度变化更换新鲜液体培养基，以保证微藻细胞浓度不超过1×105个/mL，具体传代数据如下：
表1 冰藻藻种传代数据
由上表所示数据可知，利用本发明实施例1所提供的传代方法能够实现微藻的稳定传代，例如，当二氧化碳浓度为1500ppm和2000ppm时，五年传代数分别高达229代和231代。
其中，更换新鲜液体培养基包括以下步骤：
对新鲜液体培养基进行污染检测，以保证无菌培养条件；
将污染检测合格的新鲜液体培养基添加至预处理槽5中，并保持二氧化碳通入；
当预处理槽5中新鲜液体培养基的二氧化碳浓度与传代槽6中的液体培养基二氧化碳浓度保持一致后，再经由输送管路55将其输送至传代槽6中。
实施例2
本实施例提供了一种大藻的传代培养方法，具体为：
（1）选取生长状态良好的浒苔（Ulva prolifera），去除污泥并用无菌水去除大藻藻体表面杂藻附着物；
（2）使用无菌水冲洗去除杂藻附着物的浒苔藻体，将其放入封口瓶中进行促熟培养；
（3）待藻体释放孢子后，收集孢子将其接入大藻传代培养装置中的传代槽6中传代培养，传代槽中装有新鲜培养基，培养密度为1-4g鲜重/L;
（4）根据实验要求设定温度20℃、光照强度100μmol photons∙m-2∙s-1、光照周期12:12h，二氧化碳浓度分别为400ppm、700ppm、1000ppm、1500ppm、2000ppm，培养过程中根据藻种密度更换新鲜液体培养基，直至将孢子培养成大藻并进行传代，其中，每次传代周期约为4周，共计传代13代；
其中，对新鲜液体培养基进行污染检测，以保证无菌培养条件；
将污染检测合格的新鲜液体培养基添加至预处理槽5中，并保持二氧化碳通入；
当预处理槽5中新鲜液体培养基的二氧化碳浓度与传代槽6中的液体培养基二氧化碳浓度保持一致后，再经由输送管路55将其输送至传代槽6中。
对比例1
本对比例提供了一种传统微藻传代培养方法，采用的是半连续式充气培养，具体是指采用二氧化碳光照培养箱对微藻进行传代培养，同时向其中通入二氧化碳气体，在培养过程中根据微藻细胞浓度变化更换新鲜液体培养基每次更换量均为一半的新鲜液体培养基。
该培养方法的主要缺陷为：（1）充气过程中藻体容易沉淀聚团造成堆积死亡；（2）每次更换培养基均需要开口操作，增加了污染风险，而且更换新鲜培养基时，离心收集藻细胞对藻细胞造成破坏；（3）酸化时间短，需频繁更换培养基。（4）藻体密度过低，不能满足成分测定、物质提取等实验需求。
对比例2
本对比例提供了一种传统大藻传代培养方法，该方法是将大藻释放的孢子收集起来后接入新鲜液体培养基中，置于二氧化碳光照培养箱中同时向其中通入二氧化碳气体，进行传代培养。
该培养方法的主要缺陷为：充气量不稳定，过低的充气量不能保证藻体的生物量，充气量过大容易造成藻体聚团，局部环境恶化导致死亡。

Claims (4)

1.藻种传代培养方法，其特征在于，采用藻种培养系统进行藻种传代培养，所述藻种为微藻或大藻，其中：
所述藻种培养系统包括CO2光照培养箱和安装于所述CO2光照培养箱内部的传代培养装置，所述传代培养装置为微藻传代培养装置或大藻传代培养装置；
所述微藻传代培养装置或大藻传代培养装置包括：
预处理槽，包括第一槽体及盖设于所述第一槽体顶部的第一顶盖，所述第一顶盖上设有充气口，且第一槽体内部设有潜水泵，其出水口连接输送管路的一端，
传代槽，设置于所述预处理槽一侧，包括第二槽体和盖设于所述第二槽体顶部的第二顶盖，所述第二槽体侧壁和第二顶盖上分别设有进水口和充气口，所述输送管路的另一端通过第二槽体侧壁上的进水口连通所述传代槽，
供气装置，分别通过第一顶盖和第二顶盖上的充气口向预处理槽和传代槽中均匀通入二氧化碳气体，
搅拌装置，设置于所述第二槽体内部，用于将传代槽中的藻体充分混匀，以防藻体沉降，及
光源，设置于所述传代槽上方；
所述微藻传代培养装置中的搅拌装置进一步包括：
搅拌扇叶，设置于所述第二槽体内的底部位置处，用于将传代槽中的藻体充分混匀，及
马达，经马达轴连接所述搅拌扇叶；
所述大藻传代培养装置中的搅拌装置进一步包括：
造浪泵，设置于所述第二槽体内的底部位置处，
转轴，设置于所述第二槽体内的底部位置处，及
马达，经马达轴连接所述转轴；
所述供气装置进一步包括：
输气管路，一端连接供气泵，
充气石，连接所述输气管路的另一端，并放置于所述第一槽体和第二槽体内部，用于向预处理槽和传代槽中均匀通入二氧化碳气体，及
气体过滤膜，设置于靠近供气泵一端的输气管路上，用于过滤二氧化碳气体中的杂质；
所述微藻的传代培养方法包括以下步骤：
取保存于平板中的微藻藻种，在超净工作台中，通过挑取单斑的方式接入液体培养基中；
待所述液体培养基中的微藻细胞培养至对数期后，将其接入微藻传代培养装置中的传代槽进行传代培养，传代槽中装有新鲜液体培养基，接种密度为1×103-1×104个/mL;
根据实验要求设定温度、光照强度、光照周期以及二氧化碳浓度条件，培养过程中根据微藻细胞浓度变化更换新鲜液体培养基，以保证微藻细胞浓度不超过1×105个/mL；或
所述大藻的传代培养方法包括以下步骤：
选取生长状态良好的大藻藻体，去除污泥并用无菌水去除大藻藻体表面杂藻附着物；
使用无菌水冲洗去除杂藻附着物的大藻藻体，将其放入封口瓶中进行促熟培养；
待藻体释放孢子后，收集孢子将其接入大藻传代培养装置中的传代槽中传代培养，传代槽中装有新鲜培养基，培养密度为1-4g鲜重/L;
根据实验要求设定温度、光照强度、光照周期以及二氧化碳浓度条件，培养过程中根据藻种密度更换新鲜液体培养基，直至将孢子培养成大藻；
所述微藻的传代培养方法或大藻的传代培养方法中，更换新鲜液体培养基具体为：
对新鲜液体培养基进行污染检测，以保证无菌培养条件；
将污染检测合格的新鲜液体培养基添加至预处理槽中，并保持二氧化碳通入；
当预处理槽中新鲜液体培养基的二氧化碳浓度、温度与传代槽中的液体培养基二氧化碳浓度、温度保持一致后，再经由输送管路将其输送至所述传代槽中。
2.根据权利要求1所述的藻种传代培养方法，其特征在于，所述大藻包括浒苔、石莼、萱藻或水云；
用于传代培养的大藻选取标准为：具有明显的世代交替，成熟期藻体最大长度＜50cm。
3.根据权利要求1所述的藻种传代培养方法，其特征在于，所述传代槽底部还设置有底座，所述第二槽体靠近底部位置处设有出水口,所述光源为LED白光灯。
4.根据权利要求3所述的藻种传代培养方法，其特征在于，在所述大藻传代培养装置中，第二槽体上的出水口上还设置有隔藻网。
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