CN102703326A - 一株高co2耐受性和固定率的微藻及其选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微藻生物技术领域,特别涉及一种高CO2耐受性和固定率的微藻及其选育方法。该藻命名为Chlorella sp.Y-1,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,CGMCC No.5429。其特点:从自然环境分离得到出发株,经高CO2浓度条件强化培养、基因克隆、诱变育种等操作后,目标株的碳含量增至56.981%,最佳固定浓度达20%(v/v),固定率高达5.762g/(L.d),最高耐受浓度为100%(v/v),对一系列物理化学培养条件有较好的适应性,传代稳定性良好,总体性能好于目前同类研究成果。发明的目的是解决高浓度CO2生物固定技术的瓶颈问题,培育一种能高效固定高浓度CO2的高效生物,实现烟道气等高浓度复杂环境下CO2的有效固定,同时产生出有益的生物质。
Description
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域,具体涉及一株高CO2耐受性和固定率的微藻及其选育方法。
背景技术
近百年来,全球气温明显升高,已经对许多地区的自然生态系统产生了负面影响,甚至导致不可修复性的破坏。随着升温幅度的增加,遭受破坏的生态系统的数目和地理范围也在不断地增加。大量研究表明,全球升温以及由此引发的不良后果主要缘于人类活动排放的CO2等温室气体的温室效应。CO2一直是人类活动排放的主要温室气体,因此,CO2也就不可避免地成为当前温室气体减排控制的重点。
我国是世界上的人口大国、能源生产和消费大国,每年由化石燃料燃烧排放的温室气体的量一直居高不下。2006年底,科技部联合中国气象局、中国科学院等部门发布的《气候变化国家评估报告》指出,在过去的100年里,我国气温升高了0.6℃,东北最近50年升高了1.1℃,据估测,在未来100年,还可能增加2℃~4℃。现在过去100年增温1℃左右就灾害频繁,未来将会怎样?因此,面对我国气候变化的严峻形势、面对全球环境的新要求,在对所排放烟气中的SO2和NOX等大气污染物进行处理的同时,也必须对CO2的排放加以控制,以承担我国对全球环境变化的责任。
如何在现有的燃料和能源结构条件下,采取经济有效的方法控制CO2的排放,是发明者近几年一直致力研究的课题。根据前人的研究经验和本人近几年成果分析,微生物法是一种行之有效的减排法。但是,氢化细菌培养需通入氢气,在实际工程应用中增加了技术的复杂性;微藻耐高温性差,通常当CO2浓度大于5%时生长就会受到抑制,固碳效率较低。因此选育能高效固定高浓度CO2的微藻对该技术的发展至关重要。选育合适的微生物不仅可实现对高浓度CO2高效减排,解决生物法的技术瓶颈,所获得的生物质还可通过质能转化开发新能源,减少对化石燃料的需求,进一步减少因化石燃料燃烧而引起的CO2的排放,同时又创造了经济效益。选育合适的微生物,使得生物固定技术与其它减排技术相比,具有占地少、成本低、效益显著、运作简便等特点。本发明所培育高效微生物可以耐高温、实现对高浓度CO2的有效固定,同时,生产的生物质可以作为新能源代替化石燃料,或者用来生产饲料、肥料和绿色食品等。因此,该发明是一项非常重要的绿色环保、高效节能型项目。
国内外典型研究成果见表1。这些研究或因最适CO2浓度和最高耐受浓度低、或因为低固定率等原因都未取得满意的结果。如刘玉环等人研究的Scenedesmus dimorphus最适CO2浓度和最高耐受浓度较高,但在最佳浓度时的固定率仅达0.99g/(L·d)。
黄和等人的“一株小球藻及其应用”(201019026021.X),分离的小球藻M209256最高CO2耐受浓度仅为24.5%(v/v),最佳CO2固定浓度为5%(v/v),15天最佳生物量为2.23g/L,按通常的小球藻的含碳量50%计算,最佳CO2固定率为4.088g/L,折合0.273g/(L·d),在CO2浓度为24.5%(v/v)时CO2固定率为2.05g/L,折合0.137g/(L·d);刘君寒等人的“一株小球藻及其培养方法和应用”(201110145547.7),该方法重点获得具有多功能的小球藻,方法述及的小球藻M4653最高CO2耐受浓度为30%(v/v),优选在5%(v/v)CO2时油脂含量为33.5%和产量1.51g/L,在20%时仅为24.7%和0.79g/L,显然该藻不适宜高CO2浓度环境生存,且方法中也未对该藻的适宜CO2浓度和最佳CO2固定情况进行阐述。李福利等人的“一株栅藻及其培养方法和应用”(201110144545.6),方法仅述及栅藻M4653可用于空气-30%(v/v)CO2环境,研究重点在于含氨氮等废水的净化及其油脂含量,对CO2固定及去除情况未提及,且最佳生物质生长量出现在5%(v/v)CO2时、最佳蛋白量出现在3%(v/v)CO2时,可以理解为最高CO2耐受浓度为30%(v/v),最佳固定浓度仅为5%(v/v)。
表1国内外典型的研究成果
发明申请人曾于2004年分离出一株微藻,适宜CO2浓度为10%(v/v),最高固定率达2.034g/(L·d)(发表于Energy conversion and management,2005,11),本发明是申请者在总结前面研究经验基础上,进一步分离和培育出的具有更高的CO2耐受性和固定率的目标微藻。
发明内容
本发明的目的是解决高浓度CO2生物固定技术的瓶颈问题,培育一种高效固定高浓度CO2的生物,实现烟道气等高浓度复杂环境下CO2的有效固定,同时产生出有益的生物质。
本发明的技术方案为:一株具有高CO2耐受性和高固定率的微藻,其分类命名:Chlorella sp.Y-1,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期2011年11月14日,保藏编号CGMCC No.5429。
微藻的选育方法,该方法包括如下步骤:
(1)出发株的筛选驯化和分离纯化:
预培养采用BBM培养基,培养时间为3周,控制培养条件为:25℃±2℃,光照强度25000Lux,光暗比12∶12;
CO2驯化采用MBM培养基,利用CO2混合气驯化预培养后的试样,气流体流速1L/min、光照强度25000Lux,25℃±2℃,光暗周期比为12h∶12h,驯化培养10d,CO2混合气浓度(v/v,%,单位下同)依次为:0.035%,3%、5%和10%、15%,反复驯化4次;
对驯化之后的藻液采用平板划线分离,直至获得纯藻种,作为出发株B-1,出发株B-1的碳含量为50.726%,最佳生长浓度15%(v/v),固定率高达2.409g/(L·d),最高耐受浓度为60%(v/v),适宜的培养条件范围为在温度为25℃-30℃、初始pH为5.0-6.0、15000-25000Lux的光照、气体流速为0.8-1.01L/min;
(2)目标株构建:
出发株强化培养:对出发株B-1采取渐变CO2浓度连续试验强化培养,试验条件、步骤同出发株的驯化阶段;各培养周期C02浓度(v/v,%)依次增加至:5%、10%、15%、20%、30%、50%、60%、80%和100%,各培养6天时间;
基因诱变育种:诱变条件为诱变剂量致死率为70-80%、最佳诱变藻液浓度为2.5×106~3.6×106个/mL、诱变剂量为20W紫外灯、照射距离为25cm、辐射时间是30min;诱变后的藻液在25℃、转速141r/min、MBM培养基、30%CO2(v/v)的气体、25000Lux光照、光暗周期比12h∶12h条件下预培养6天,按照10%的接种量每隔5d转接一次,转接三次;驯化阶段采用BBM培养基,其他条件不变,筛选出单株优良藻株,为突变株;
基因克隆:以突变株和出发株为对象,大肠杆菌(感受态细胞Top10)和PMG为质粒载体,按照《分子克隆实验指南》配置常用缓冲液及试剂,按照植物基因组DNA提取试剂盒操作提取藻株DNA,从基因库中获得小球藻属的rbcL基因序列,引物设计采用Clustal X 1.8软件进行分析;PCR反应体系的反应循环条件为94℃预变性7min、94℃变性1min、42℃复性1min、72℃延伸1min、35个循环、反应最后72℃延伸7min;取2μL PCR产物用于电泳检测,普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒切胶回收DNA片段;按pBS-T连接试剂盒进行PCR产物连接,30℃反应2h后,全部转化50μL TOP10感受态细胞中,冰上放置30min,42℃水浴热激90s,迅速转入冰浴2min,加入200μL LB液体培养基,37℃,220rmp震荡培养45min,取200μL上述转化培养物涂至含有Amp(50μg/ml)的LB平板上,待所有液体被吸收后,37℃倒置培养14h左右,出现单菌落时取出平板,挑取单克隆抗体进行检测、保种和测序;PCR法检测阳性克隆条件为94℃预变性7min,94℃变性1min,42℃复性1min,72℃延伸1min,35个循环,反应最后72℃延伸7min;采用pBS-T载体测序通用引物测序;
(3)藻株的含碳量、培养特性测定及优选目标株:
含碳量采用全自动分析仪检测,色谱条件为:载气压力80KPa,吹扫流速80ml/min,氧化体积20ml,氧气分压35KPa,采样延迟10s,运行时间360s,前级燃烧室温度920℃,炉温115℃;以半胱氨酸为标准品,样品以20mg计,仪器的检出限:N%:0.008%,C%:0.005%;
培养特性测定条件及过程:在初始pH 6.6、25℃、光照25000Lux、1.0L/min的培养条件下,控制CO2含量分别为0.035%、5%、10%、20%、25%、30%、60%、和100%,确定CO2最佳固定浓度和最高耐受性;采用正交试验,设置20℃、25℃、30℃、35℃等四个温度梯度,5000、15000、25000、35000和50000Lux五个光照梯度,pH5、pH6、pH7、pH8四个初始pH梯度,0.7、0.8、1.0、1.1、1.2、1.50L/min六个气体流速梯度,分别以NH4Cl、NaNO3和NaNO2为氮源,藻液初始吸光浓度约在0.1左右,确定适宜的温度、初始pH、光照、气流速度及氮源条件;
优选目标株:优选目标株的碳含量增至56.981%;在初始pH 6、25℃、光照25000Lux、气体流速1.1L/min、2g/L的NaNO3为氮源时获得最佳CO2固定浓度20%,CO2固定率高达5.762g/(L·d),最高耐受浓度为100%(v/v);对环境均具有较强适应性,包括10%-35%CO2浓度、20℃-30℃、15000-35000Lux的光照、初始pH5.0-6.5、气体流速0.8-1.10L/min、以硝酸钠为氮源的浓度在0.25-2g/L时长势良好。
本发明的特点及有益效果:本发明以具有较高CO2浓度的自然环境水样为基础,对原始水样进行了一系列的分离驯化操作,得到具有较高CO2耐受性和固定率的出发株B-1。在此基础上,采用强化培养、基因工程等技术进一步提高出发株的含碳量,提高出发株的B-1耐受性和固定力,得到目标株Y-1。
该发明有效解决了CO2生物固定技术的瓶颈问题。(1)目标株具有高CO2耐受性和固定力,在20%(v/v)CO2时具有最好的生长,固定率高达5.762g/(L·d),最高CO2耐受浓度高达100%(v/v)。从综合角度考虑,这个结果远好于国内外目前的研究(国内外目前的典型研究成果见表1)。有效解决了一般微藻在较高CO2浓度条件无法存活、生长受到抑制或固定力低等问题;(2)目标株对一系列物理化学培养条件具有很好的适应性,只需简单的脱硫除尘处理就可以直接用于烟气等复杂环境的高浓度CO2的高效固定,大大减少了技术的复杂性,降低系统运行成本。(3)目标株的高生长量获得的生物质可以进行新能源开发,同时它高的含氮量性质决定其又可以用于食品、饲料加工。所以本发明不仅具有很好的社会环境效益,还具有很好的经济前景。
附图说明
图1.试验装置图
图2.CO2浓度为15%(v/v)时15种微藻的生长曲线
其中,CT1-5为某温泉池塘中分离的5种藻,HL1-3为某河流,HB1为某河流电厂段DT1-6为某稻田土壤样
图3.B-1藻的光学显微镜和电子显微镜(×10000)照片
图4.藻细胞密度与干重的标准曲线图
图5.出发株和突变株rbcL基因序列扩增产物电泳图
其中,M-marker;1,chlorella sp.;2,mutant B-1;3,mutant B-2;4,mutant-B-3;5,contrast.
图6.NJ法构建的分子树
图7.碳含量标准曲线
其中、1、CO2钢瓶;2、阀门;3、转子流量计;4、空气泵;5、滤菌膜;6、缓冲瓶;7、 电源;8、加热棒;9、曝气头;10、气体收集烧杯;11、荧光灯
具体实施方式
第一阶段:出发株的筛选驯化及分离纯化
试验装置如附图1所示。试验样品依次为:某稻田土壤样品(含水率≥90%),某温泉池塘水样,某温泉自然河流水样,某温泉排污塘水样,某发电厂附近水潭水样和某电厂段水样。
样品预培养阶段:
BBM培养基,其组成如表2所示,pH6.6左右。将配置好的母液单独灭菌,于4℃保存。使用时,按母液顺序依次加入到蒸馏水中,混合均匀后定容到刻度。
表2BBM培养基的组成
取少量各取样源水样、土壤样品溶解于水中,取上清液。300ml三角瓶中按1∶3的比例加入所取样品于BBM培养基,控制培养条件为:25℃±2℃,光照强度25000Lux,光暗比12∶12,预培养3周。待明显变绿后,按上述步骤继续进行扩大培养。
通CO2筛选驯化、分离纯化阶段:
MBM培养基组成如表3,pH 6.0左右,保存与配置的方法同BBM培养基一样。
表3MBM培养基的组成(单位:mg/L)
将50mL藻液加入到450mL的MBM培养基中,利用不同浓度的CO2混合气驯化培养预培养 后的试样,气流流速为1L/min。采用荧光灯为光源,光照强度约为25000Lux,25℃±2℃,光暗周期比为12h∶12h,驯化培养10d。反复驯化4次。CO2浓度(v/v,%,下同)依次为:0.035%,3%、5%和10%、15%。对驯化之后的藻液采用平板划线分离至获得纯藻种。试验经预培养、驯化和分离,共获得了15种微藻。
控制CO2浓度为15%,比较分离出的15种微藻对高浓度CO2的耐受性,培养条件同驯化阶段。15种微藻10天的生长曲线如图2所示。
取50ml对数期藻液接种到已灭菌的450mL MBM培养基中,在CO2浓度分别为0.035%、5%、10%、15%。20%、30%、60%、80%和100%条件下培养10天时间,考察15种微藻对高浓度CO2的耐受性。在15%CO2时,编号DT-5呈现出最好的生长状态,5天后生长率为2.97倍/天,十天之后,吸光度值为1.42,是初始值的56.8倍,能耐受60%的CO2。在温度为25℃-30℃、初始pH 5.0-6.0、气体流速0.8-1.01L/min、15000-25000Lux的光照范围内,生长稳定。在15%CO2、25℃、pH 6.0、气体流速1L/min时,增长速率最高,CO2固定率达到2.409g/(L·d)。
DT-5在固体平板培养基上生长很好,藻落呈墨绿色,表面湿润光滑,致密性好。光学显微镜下观察为球状,单细胞,一个叶绿体,细胞微小,直径2-3μm。光学显微镜和电子显微镜(×10000)照片如图3所示。查阅淡水藻类分类学书籍,初步认定为小球藻属,将其命名为B-1藻。
第二阶段:目标株的构建
(一)高强度驯化培养
对出发株B-1采取渐变CO2浓度连续试验强化培养,试验条件及装置同前面的驯化阶段。各培养周期CO2浓度依次增加至:5%、10%、15%、20%、30%、50%、60%、80%和100%,培养周期6天,分离筛选出长势最好的藻株,编号BB-1。
(二)基因诱变
藻株生长量的测定方法:
采用吸收法和干重法,建立细胞干重和藻液吸光度A的对应关系,标准曲线图如图4。
诱变预实验确定诱变条件:
根据有利于正向突变的原则,选取诱变剂量致死率为70-80%。取对数生长期的藻液5mL置于直径为9cm的培养皿内,用紫外灯(20W、照射距离25cm进行0、5、10、15、20、25、30、35min不同时间的照射),选择诱变剂量为紫外线照射30min。处理OD680nm分别为0.020、0.031、0.035、0.046、0.055、0.088的藻液,根据细胞致死率确定初始藻细胞浓度。每个试验都做3个平行样,取其平均值。
确定藻液浓度大概在2.5×106~3.6×106个/m L为最佳诱变浓度,诱变剂量为20W紫外 灯,照射距离为25cm,辐射时间是30min,对BB-1进行诱变。
诱变后预培养:
将诱变后的藻液转移到500ml锥形瓶中,置于25℃的恒温水浴摇床中,转速141r/min,遮光12h。将藻液转接入400mL MBM培养基中,通入30%CO2,光照25000Lux,光暗周期比为12h∶12h,藻液变绿后,按照10%的接种量转接,继续培养,以后每隔5d转接一次。
诱变后筛选:
取转接后生长稳定的藻液稀释后,涂于BBM平板培养基上,恒温光照培养10天后形成单个藻落。挑取深绿色单个藻落接种于含有30mL BBM培养基的试管中,在光照培养箱中培养6天后,选取吸光度较高的藻株,接种于1000mL锥形瓶中,在光强为25000Lux,温度为25℃,光暗周期比为12h∶12h时通入30%CO2进行培养,筛选出优良藻株。
5天培养后诱变的三组生长情况明显由于出发株,尤其是第一组。对第一组进行分离筛选,获取生长最好的单株突变株。通入30%CO2,25℃,初始pH6.6,光照25000lux条件下,编号YB-1、YB-4和YB-13的生长明显优于出发株。经过5天的培养,最终浓度分别达到9.7×107个/m L、10.12×107个/m L和10.01×107个/m L。
突变株的传代稳定性测定:
将突变株分别接入新鲜BBM培养液中连续培养四代,比较第四代藻株与第一代的生长曲线。第一代以YB-1的第一代为代表,YB-1、YB-4和YB-13第四代与YB-1第一代生长曲线相比没有明显变化,突变株传代稳定性较好。
(三)基因克隆及测序
以突变株YB-1、YB-4、YB-13和出发株B-1为对象,大肠杆菌(感受态细胞Top10)和PMG质粒载体。
常用缓冲液及试剂均按照《分子克隆实验指南》进行配置。TAE:40mM Tris-acetate,10mM EDTA。EB:1gEB溶于100ml蒸馏水中,放于棕色瓶避光保存。试剂:植物基因组DNA提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit),普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANgel Midi PurificationKit)。LB培养基(g/100ml):胰蛋白胨,1;酵母提取物,0.5;Nacl,1;琼脂,1.5;pH7.0。
藻细胞DNA的提取:
按照植物基因组DNA提取试剂盒操作步骤提取小球藻DNA。电泳检测。取15m L对数生长期的微藻,在4300rmp下离心15分钟收集藻体,转接到1.5m L离心管中,-20℃冻结;取出离心管在室温溶解,12000rmp离心30s,将沉底的组织进行物理破碎;将65℃预热的700μL缓冲液GP1转入离心管(实验前加入巯基乙醇,使其最终浓度为0.1%),迅速颠倒混 匀,放在65℃水浴20分钟,同时数次颠倒离心管以混合样品;加入700μL氯仿,充分混匀,12000rmp离心5分钟;小心地将上层水相转入新的离心管中,加入700μL缓冲液GP2,充分混匀;将混合液转入吸附柱CB3中,12000rmp离心30秒,弃掉废液;加入500μL缓冲液GD(使用前加入无水乙醇),12000rmp离心30秒,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中;向CB3中加入700μL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇),12000rmp离心30秒,倒掉废液;将CB3放回收集管,向CB3中加入500μl漂洗液PW,12000rmp离心30秒,倒掉废液;将CB3放回收集管,12000rmp离心2分钟,倒掉废液;将CB3置于室温数分钟至晾干吸附材料中残余的漂洗液;将CB3转入干净的离心管,向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL专用水(pH值在7.0-8.5之间),室温放置2-5分钟,12000rmp离心2分钟,将溶液收集到离心管中;为了增加DNA的得率,将上一步离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中,室温放置2分钟,12000rmp离心2分钟。将DNA产物保存在-20℃,以防DNA降解。
引物设计:
从基因库中获得小球藻属的rbcL基因序列,引物设计采用Clustal X 1.8软件进行分析。按以下原则进行筛选:引物要与模板序列紧密互补;引物间要避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物特异性要高,避免错误引发;引物Tm值在55-65℃,GC含量在40-60%;引物的3’端避免使用碱基T;3’端避免出现3个以上的连续相同碱基,尽量不要在3’端或是离3’端太近的位置形成二聚体。选择最保守的区域,得到一对引物:
Primer1:5’CGTTCCGTATGACTCCTC3’
Primer2:5’CCAAACTTCACACGCTGC3’
PCR反应体系和反应条件:反应体系如表4,反应循环条件为94℃预变性7min、94℃变性1min、42℃复性1min、72℃延伸1min、35个循环、反应最后72℃延伸7min。1mL2×PCRTaqMix含有:100nM kCl、20nM Tris-HCl、3nM MgCl2、400nM dNTP混合物、0.1U/μL TaqDNA聚合酶、溴酚蓝和其他增强剂与稳定剂。取2μL PCR产物用于电泳检测,检测是否有明显的目的条带,然后切胶回收目的片段。
表4PCR反应体系
普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段:
回收试剂盒组成:平衡液BL,溶胶液PN,漂洗液PW,洗脱缓冲液EB,吸附柱CA2,收集管。
用小刀将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下,尽量切除多余部分,放入干净的离心管中,称取重量;向吸附柱(吸附柱CA2放入收集管中)中加入500μL平衡液BL,12000rmp离心1min,倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管中;向胶块中加入3倍体积溶胶液(如凝胶重0.1g,其体积可视为100μL)。50℃水浴十分钟,期间不断温和地上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解;将所得溶液加入吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中),室温放置2min,12000rmp离心1min,倒掉废液,将吸附柱CA2放入收集管中;向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW,静置2-5min,12000rmp离心1min,倒掉废液,将吸附柱CA2放入收集管中;向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW,12000rmp离心1min,倒掉收集管中的废液;将吸附柱CA2放回收集管;12000rmp离心2min,出尽漂洗液,于室温放置数分钟,彻底晾干;将吸附柱CA2放入干净的离心管中,向吸附膜中间悬空滴加适量DNA保存专用水,室温放置2min,12000rmp离心2min收集DNA溶液;为了提高DNA回收量,可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中,重复步骤8。
PCR产物连接(pBS-T连接试剂盒):
表5连接反应体系
30℃反应2h后,全部转化TOP10感受态细胞(50μL)中。
连接产物的转化:
将连接反应液10μL全部转化至50μL TOP10感受态细胞中,轻轻混匀置于冰上30min后,置于42℃水浴热激90s,迅速转入冰浴2min。加入200μL LB液体培养基,37℃,220rmp震荡培养45min。取200μL上述转化培养物涂至含有Amp(50μg/ml)的LB平板上,待所有液体被吸收后,37℃倒置培养14h左右,待出现单菌落时取出平板。
挑取单克隆抗体:
挑取白色单菌落,每个样挑取20个克隆单体放入离心管中。向离心管中加800μL含有AMP的LB培养液。将离心管放置37℃恒温摇床上,220rmp培养3h,取少量菌液用于PCR检测,其他用于保种和测序。
PCR法检测阳性克隆:
表6阳性克隆检测的PCR反应体系
反应循环条件:94℃预变性7min,94℃变性1min,42℃复性1min,72℃延伸1min,35个循环,反应最后72℃延伸7min。
将在1.2kbp出现条带的菌液用于测序和保种,采用pBS-T载体测序通用引物测序。
如图5所示为出发株B-1(7#)和突变株YB-1、YB-4和YB-13rbcL基因PCR扩增产物的电泳结果,获得了单一条带大约1.2kb,扩增的B-1(7#)的rbcL基因序列长度为1204bp。
将测得的序列在基因数据库中做BLAST,结果发现出发株小球藻与Chlorella sp.IFRPD1018有最大相似性,其BLASTn值为2080,表7为Chlorella sp.的rbcL基因序列BLAST结果。
表7 Chlorella sp.的rbcL基因序列BLAST结果
表8 16株小球藻rbcL序列的遗传距离
注:表中序号所代表的小球藻及其GeneBank登录号:A、Chlorella vulgaris strain NIES-227(AB260909),B、Chlorella vulgaris strain CCAP 254/5(EF589154),C、Chlorella vulgaris (AB001684),D、’Chlorella’ellipsoidea strain CCAP 211/33(EF589156),E、’Chlorella’ellipsoidea strain Ce(EU038287),F、Chlorella sp.IFRPD 1014(AB260910),G、Chlorella sp.IFRPD 1018(AB260911),H、’Chlorella’luteoviridis strain UTEX 21(EF113428),I、Auxenochlorella protothecoides strain F-2(EU038285),J、Chlorella pyrenoidosa strain F-5(EU038282),K、Chlorellapyrenoidosa strain F-9(EU038283),L、Chlorella pyrenoidosa SUN CHLORELLA(AB240145),M、Chlorella sorokiniana strain UTEX 246(EF113429),N、’Chlorella’saccharophila(AM260446),0、Chlorella vulgaris strain SAG 211-11b(AF499684),P、Chlorella sp.
表8反映了16株小球藻的rbcL序列间遗传距离。其中这15种小球藻(不包括chlorella sp.)分属于8个不同的种。根据rbcL序列计算它们的遗传距离在0.0000~0.2414。种间的遗传距离最大为0.0383,rbcL在种间和种内的保守性较好,chlorella sp.和Chlorella sp.IFRPD 1018的遗传距离最小为0.0301。
根据小球藻和一个外群Chlamydomonas pulsa tilla(衣藻属),采用NJ法构建分子系统树如图6。由系统树上分析可知,chlorella sp.与Chlorella sp.IFRPD 1014、Chlorella sp. IFRPD 1018聚为一族,原始小球藻Auxenochlorella protothecoides strain F-2和蛋白核小球藻的亲缘关系比较近。
本实验所选育的藻株和Chlorella sp.IFRPD 1018种间关系最近,遗传距离、NJ系统树分析和BLASTn结果一致,Chlorella.sp和Chlorella sp.IFRPD 1018有可能是种内关系,最终确定藻株和Chlorella sp.IFRPD 1018亲缘关系最近。
第三阶段:藻株的碳含量、培养特性测定及优选目标株
将前面构建得到的藻株作为初选目标株,对应编号仍为YB-1、YB-4、YB-13,其他同前。
藻株的碳含量比较:
采用全自动元素分析仪分析出发株和初选目标株的碳含量。元素分析仪的色谱条件:载气压力80KPa,吹扫流速80ml/min,氧化体积20ml,氧气分压35KPa,采样延迟10s,运行时间360s,前级燃烧室温度920℃,炉温115℃。以半胱氨酸为标准品,样品以20mg计,仪器的检出限:N%:0.008%,C%:0.005%。标准曲线的绘制:以外表定量法,分别称取一定量的半胱氨酸进行分析得到N、C含量的标准曲线。
碳含量标准曲线见图7,分析处理好的样品得结果如表9。
表9出发株和初选目标株藻细胞的碳氮、硫含量
三株初选目标株的碳含量都高于出发株,比出发株高出约6个百分点。
藻株CO2的耐受性及固定力比较:
设置0.035%、5%、10%、20%、25%、30%、60%、和100%等CO2浓度梯度,考察藻株对CO2耐受性。其他培养条件为初始pH值为6.6、温度25℃、光照25000Lux、1.0L/min。
出发株和初选目标株在通入10%CO2时,最终的细胞密度相差不大,但是初选目标株在通入20%CO2时,YB-1、YB-4和YB-13最终密度分别达到4.47×108个/ml、4.85×108个/ml和4.68×108个/ml,均高于出发株B-1的1.3×108个/ml。说明三株初选株CO2耐高浓度性要好于出发株。当通入CO2为20%时,初选株YB-1、YB-4和YB-13的CO2固定速率分别达到5.591g/L·d、5.654g/(L·d)和5.619g/(L·d),高于出发株的1.98g/(L·d),出发株在通入15%CO2时最大固碳速率2.409g/(L·d)。在通入100%CO2时,初选目标株仍有一定的生长。
其他培养条件测试:
采用正交试验,考察温度、光照、培养液初始pH、氮源等条件。设置20℃、25℃、30℃、35℃四个温度梯度,5000Lux、15000Lux、25000Lux、35000Lux和50000Lux五个光照梯度,pH5、pH6、pH7、pH8四个初始pH梯度,0.7、0.8、1.0、1.1、1.2、1.50L/min六个气体流速梯度,取对数生长期的藻液,藻液初始吸光浓度约在0.1左右,确定适宜的CO2浓度、温度、初始pH及光照等培养条件。
三株初选株对一系列复杂环境均具有较强适应性,包括10%-35%CO2浓度、20-30℃的温度、15000-35000Lux的光照、初始pH值5-7、气体流速0.8-1.10L/min。最高CO2耐受性达100%。在通入20%CO2,初始pH 6、25℃、光照25000Lux、气体流速1.1L/min的条件下生长最快,5天培养后YB-1、YB-4和YB-13的固碳速率分别是5.632g/(L·d)、5.704g/(L·d)和5.665g/(L·d)。YB-4的固碳速率最高。
在最优培养条件下,分别以NH4Cl、NaNO3和NaNO2为氮源,考察氮源对YB-4固碳效果的影响。NH4Cl对YB-4有抑制作用,浓度大于150mg/l的NaNO2能“杀死”YB-4,最适合的氮源为NaNO3。以硝酸钠为氮源的浓度在0.25-2g/L时,长势良好,在NaNO3浓度为2g/l时,YB-4取得最大固碳速率5.762g/(L·d)。
根据前面的研究结果,确定初选目标株YB-4为最终优选目标藻株,命名为Chlorella sp.Y-1。
Claims (2)
1.一株具有高CO2耐受性和高固定率的微藻,其分类命名:Chlorella sp.Y-1,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期2011年11月14日,保藏编号CGMCC No.5429。
2.权利要求1所述的微藻的选育方法,该方法包括如下步骤:
(1)出发株的筛选驯化和分离纯化:
预培养采用BBM培养基,培养时间为3周,控制培养条件为:25℃±2℃,光照强度25000Lux,光暗比12∶12;
CO2驯化采用MBM培养基,利用CO2混合气驯化预培养后的试样,气流体流速1L/min、光照强度25000Lux,25℃±2℃,光暗周期比为12h∶12h,驯化培养10d,CO2混合气浓度(v/v,%,单位下同)依次为:0.035%,3%、5%和10%、15%,反复驯化4次;
对驯化之后的藻液采用平板划线分离,直至获得纯藻种,作为出发株B-1,出发株B-1的碳含量为50.726%,最佳生长浓度15%(v/v),固定率高达2.409g/(L·d),最高耐受浓度为60%(v/v),适宜的培养条件范围为在温度为25℃-30℃、初始pH为5.0-6.0、15000-25000Lux的光照、气体流速为0.8-1.01L/min;
(2)目标株构建:
出发株强化培养:对出发株B-1采取渐变CO2浓度连续试验强化培养,试验条件、步骤同出发株的驯化阶段;各培养周期CO2浓度(v/v,%)依次增加至:5%、10%、15%、20%、30%、50%、60%、80%和100%,各培养6天时间;
基因诱变育种:诱变条件为诱变剂量致死率为70-80%、最佳诱变藻液浓度为2.5×106~3.6×106个/mL、诱变剂量为20W紫外灯、照射距离为25cm、辐射时间是30min;诱变后的藻液在25℃、转速141r/min、MBM培养基、30%CO2(v/v)的气体、25000Lux光照、光暗周期比12h∶12h条件下预培养6天,按照10%的接种量每隔5d转接一次,转接三次;驯化阶段采用BBM培养基,其他条件不变,筛选出单株优良藻株,为突变株;
基因克隆:以突变株和出发株为对象,大肠杆菌(感受态细胞Top10)和PMG为质粒载体,按照《分子克隆实验指南》配置常用缓冲液及试剂,按照植物基因组DNA提取试剂盒操作提取藻株DNA,从基因库中获得小球藻属的rbcL基因序列,引物设计采用Clustal X 1.8软件进行分析;PCR反应体系的反应循环条件为94℃预变性7min、94℃变性1min、42℃复性1min、72℃延伸1min、35个循环、反应最后72℃延伸7min;取2μL PCR产物用于电泳检测,普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒切胶回收DNA片段;按pBS-T连接试剂盒进行PCR产物连接,30℃反应2h后,全部转化50μL TOP10感受态细胞中,冰上放置30min,42℃水浴热激90s,迅速转入冰浴2min,加入200μL LB液体培养基,37℃,220rmp震荡培养45min,取200μL上述转化培养物涂至含有Amp(50μg/ml)的LB平板上,待所有液体被吸收后,37℃倒置培养14h左右,出现单菌落时取出平板,挑取单克隆抗体进行检测、保种和测序;PCR法检测阳性克隆条件为94℃预变性7min,94℃变性1min,42℃复性1min,72℃延伸1min,35个循环,反应最后72℃延伸7min;采用pBS-T载体测序通用引物测序;
(3)藻株的含碳量、培养特性测定及优选目标株:
含碳量采用全自动分析仪检测,色谱条件为:载气压力80KPa,吹扫流速80ml/min,氧化体积20ml,氧气分压35KPa,采样延迟10s,运行时间360s,前级燃烧室温度920℃,炉温115℃;以半胱氨酸为标准品,样品以20mg计,仪器的检出限:N%:0.008%,C%:0.005%;
培养特性测定条件及过程:在初始pH 6.6、25℃、光照25000Lux、1.0L/min的培养条件下,控制CO2含量分别为0.035%、5%、10%、20%、25%、30%、60%、和100%,确定CO2最佳固定浓度和最高耐受性;采用正交试验,设置20℃、25℃、30℃、35℃等四个温度梯度,5000、15000、25000、35000和50000Lux五个光照梯度,pH5、H6、pH7、pH8四个初始pH梯度,0.7、0.8、1.0、1.1、1.2、1.50L/min六个气体流速梯度,分别以NH4Cl、NaNO3和NaNO2为氮源,藻液初始吸光浓度约在0.1左右,确定适宜的温度、初始pH、光照、气流速度及氮源条件;
优选目标株:优选目标株的碳含量增至56.981%;在初始pH 6、25℃、光照25000Lux、气体流速1.1L/min、2g/L的NaNO3为氮源时获得最佳CO2固定浓度20%,CO2固定率高达5.762g/(L·d),最高耐受浓度为100%(v/v);对环境均具有较强适应性,包括10%-35%CO2浓度、20℃-30℃、15000-35000Lux的光照、初始pH5.0-6.5、气体流速0.8-1.10L/min、以硝酸钠为氮源的浓度在0.25-2g/L时长势良好。
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