CN105420176A - 一种具有高co2耐受性和固定率的微藻选育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微藻培育技术领域，涉及一种具有高CO2耐受性和固定率的微藻选育方法，具体包括以下步骤：样品的采集与预培养—模拟烟气驯化培养—平板分离—较纯种群的采集—获得纯种群—纯种保存—培养特性测定—高强度驯化培养—基因诱变育种—传代稳定性测定—基因克隆和测序—藻株的碳含量测定—目标株的培养特性测定—确定优选目标株，所培育出的菌株具有最大条件下的CO2耐受性；整体方法原理科学，步骤清晰，易于操作，条件可控。

Description

一种具有高CO2耐受性和固定率的微藻选育方法
技术领域：
本发明属于微藻培育技术领域，涉及一种微藻的选育培育方法，特别是一种具有高CO2耐受性和固定率的微藻选育方法，能够培养选育出高CO2耐受性和固定率的微藻。
背景技术：
自工业革命以来，人类向大气中排入的二氧化碳等吸热性强的温室气体逐年增加，大气的温室效应也随之增强，其引发的一系列问题已引起了全世界各国的关注。如何在现有的燃料和能源结构条件下，采取经济有效的方法控制CO2的排放，是研究者多年来重点研究的课题；根据众多科学家的研究经验和申请人近几年的研究成果分析，微生物法是一种行之有效的减排法，但是这其中所需的氢化细菌培养需要通入氢气，实际工程应用中技术复杂性较高，且微藻耐高温性差，通常当CO2浓度大于5％时生长就会受到抑制，固碳效率也较低。因此选育出一种或几种合适的微生物不仅能实现对高浓度CO2高效减排以突破生物法的技术瓶颈，而且所获得的生物质还可通过质能转化开发出新能源，以减少对化石燃料的需求同时也减少了因化石燃料燃烧而引起的CO2的排放。
查阅国内外典型研究成果发现，大部分微生物研究或是因为最适CO2浓度和最高耐受浓度较低、或是因为低固定率等原因都未取得满意的结果；例如虽然刘玉环等人研究的Scenedesmusdimorphus最适CO2浓度和最高耐受浓度较高，但其在最佳浓度时的固定率仅达0.99g/(L·d)；黄和等人研究的“一株小球藻及其应用”(专利号为ZL201019026021.X)，其分离的小球藻M209256最高CO2耐受浓度仅为24.5％(v/v)，最佳CO2固定浓度为5％(v/v)，15天最佳生物量为2.23g/L，按通常的小球藻的含碳量50％计算，最佳CO2固定率为4.088g/L(折合0.273g/(L·d))，在CO2浓度为24.5％(v/v)时CO2固定率为2.05g/L(折合0.137g/(L·d))；刘君寒等人研究的“一株小球藻及其培养方法和应用”(专利号为ZL201110145547.7)，该方法重点是获得具有多功能的小球藻，其中所涉及的小球藻M4653最高CO2耐受浓度为30％(v/v)，优选在5％(v/v)CO2时油脂含量为33.5％和产量1.51g/L，在20％时仅为24.7％和0.79g/L，显然该小球藻不适宜在高CO2浓度环境下生存，且该方法中也未对小球藻的适宜CO2浓度和最佳CO2固定情况进行阐述；李福利等人研究的“一株栅藻及其培养方法和应用”(专利号ZL201110144545.6)，该方法中仅仅阐述了栅藻M4653可用于空气(30％(v/v)CO2环境)，研究重点在于含氨氮等废水的净化及其油脂含量，但对CO2固定及去除情况未有提及，并且最佳生物质生长量出现在5％(v/v)CO2和最佳蛋白量出现在3％(v/v)CO2时，可以理解为最高CO2耐受浓度为30％(v/v)，最佳固定浓度仅为5％(v/v)；因此需要研究设计一种新的具有较高CO2耐受浓度和固定浓度的微藻，本发明的申请人于2012年2月13日申请的专利号为ZL201210030297.8中公开了一株具有高CO2耐受性和固定率的微藻，并在说明书中给出了该株微藻的选育过程；但是该专利技术虽然公开了具有高CO2耐受性和固定率的微藻的选育试验过程，但是其涉及的选育步骤过于简单，各种偶然因素过多，成功选育出稳定性较高的藻株几率较低；因此本发明设计出一种能够选育出具有高CO2耐受性和固定率的微藻的方法，以便于产量化生产培育出具有高CO2耐受性和固定率的微藻，实现对烟道气等高浓度复杂环境下CO2的有效固定，对解决温室效应问题具有良好的应用价值和实际效益。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，设计一种专门用于选育高CO2耐受性和固定率微藻的方法，以实现高CO2耐受性和固定率的微藻的量化选育培养。
为了实现上述目的，本发明涉及的具有高CO2耐受性和固定率的微藻选育方法具体包括以下步骤：
(1)样品的采集与预培养：
采集土壤、池塘、自然河流、排污塘、电厂水塘中的水样作为试验样品，培养前将上述各水样在光学生物显微镜下进行观察，分别记录所含微藻的种类；在反应器6中按1：3的容量比例加入所取样品及已灭菌的BBM培养基，将微藻混合试样接种到该培养基里，在光照培养箱中进行培养，控制培养条件为：25℃±2℃，光照强度25000Lux，光暗比12：12,培养液初始pH值为6；预培养3周待明显变绿后，按上述步骤继续进行扩大培养，培养方法同上；
(2)模拟烟气驯化培养
将预培养后的微藻试样装入新的反应器6内进行驯化培养，将配制的含有体积比为CO215％、N283％和O22％的模拟烟气通入反应器中，控制气流速度大于60mL/min，光照强度为11000Lux，光照周期为10h：14h，驯化培养4天；取驯化后的藻液接种到新的反应器6的培养基中，依照上述方法反复驯化培养三次得高密度藻液，然后采用平板分离法进行微藻分离试验；
(3)平板分离
将上述高密度藻液接种在平板上，控制温度21℃-25℃，光照强度25000Lux，光照周期12:12，培养6-8天并观察藻落生长情况；待单藻落形成时，挑取部分藻落在显微镜下观察，选取较多同一种属的进行分离和采集；
(4)获得纯种群并进行保存
将步骤(3)反复多次进行多代培养，直至单菌落特征一致，且显微镜下观察为唯一种属时确定为纯菌落藻种而进行保存；将纯菌落藻种接种于斜面培养基中，放置于恒温培养箱中控温4℃保存，1-2个月转接一次，直至长出清晰藻落；
(5)培养特性测定
按体积比1:9取对数生长期藻液接种到新的反应器6内已灭菌的BBM培养基中，设置不同温度、气体流速、光照条件和培养基初始pH值一系列培养条件进行寻优试验以得出最佳培养条件；
(6)高强度驯化培养
按体积比1:9取对数生长期藻液接种到新的反应器6内已灭菌的MBM培养基中，分别在CO2浓度为3％、5％、10％、15％、20％、30％、60％和80％及普通空气条件下培养6天时间，观察微藻的生长情况，考察并记录微藻对高浓度CO2的耐受性，以筛选获得耐受性相对高的菌株；
(7)基因诱变育种
根据致死率为70-80％有利于正向突变的原则，通过预实验确定适合的诱变剂量后进行紫外线诱变选育；选择诱变剂量为紫外线照射30min，处理OD680nm分别为0.020、0.031、0.035、0.046、0.055和0.088的藻液，并根据细胞致死率确定初始藻细胞浓度；上述不同取值下OD680nm的每个诱变试验做3个平行样后取其平均值，诱变后预培养同步骤(1)的预培养过程，然后按照步骤(3)和(4)筛选出单株优良藻株；
(8)传代稳定性测定
将筛选得到的单株优良藻株分别接种入新的反应器6内新鲜培养液中连续培养四代，并对第四代藻株测其生长曲线与第一代藻株比较，得到稳定突变株后再进行下个步骤，否则重复步骤(7)和(8)直至得到稳定突变株；
(9)基因克隆和测序
①菌液与质粒
将得到的生长稳定的稳定突变株制成菌液，以大肠杆菌和PMG为质粒载体；
②缓冲液及试剂
TAE：40mMTris-acetate,10mMEDTA，
EB：1gEB溶于100ml蒸馏水中，放于棕色瓶中避光保存，
试剂：植物基因组DNA提取试剂盒PlantGenomicDNAKit，普
通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TIANgelMidiPurificationKit；
③藻细胞DNA的提取
取15ml对数生长期的菌株，在4300g下离心15min后转接到离心管在-20℃条件下冻结；取出离心管在室温条件下溶解，在12000rmp离心30s，对沉底的组织进行物理破碎；将65℃预热的700μl缓冲液GP1转入离心管中迅速颠倒混匀后，放在65℃水浴中20min，该过程中多次颠倒摇晃以混合样品；加入700μl氯仿充分混匀，在12000rmp下离心5min；将所得上层水相转入新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2充分混匀；将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rmp下离心30s后弃掉废液；向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rmp下离心30s后倒掉废液，将吸附柱CB3中放入收集管中；向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12000rmp下离心30s后倒掉废液，将吸附柱CB3中放入收集管中；向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rmp下离心30s后倒掉废液；将吸附柱CB3中放回收集管中，12000rmp下离心2min后倒掉废液；将吸附柱CB3置于室温放置，以彻底晾干残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入新的干净离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μlpH值在7.0-8.5之间的水，室温放置2-5min，12000rmp离心2min，将溶液收集到离心管中；将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rmp离心2min得DNA产物，将DNA产物保存在-20℃，以防DNA降解；
④引物设计
从Genebank中获得菌株的rbcL基因序列，引物设计采用ClustalX1.8软件进行分析。按以下原则进行筛选：引物要与模板序列紧密互补，引物间要避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物特异性要高以避免错误引发，引物Tm值在55-65℃、GC含量在40-60％，引物的3’端避免使用碱基T，3’端避免出现3个以上的连续相同碱基，不要在3’端或是离3’端太近的位置形成二聚体；选择最保守的区域得到引物；
⑤PCR反应体系和反应条件
PCR反应体系为：25μl的2×PCRTaqMix，两个1μl的50mMPrimer，2μl的模板DNA；用ddH2O将总体系补足到50μl；
反应循环条件：94℃预变性7min，94℃变性1min，42℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环，反应最后72℃延伸7min；
1ml的2×PCRTaqMix中含有：100nMkcl、20nMTris-HCL、3nMMgcl2、400ΜmdNTP混合物、0.1U/μlTaqDNA聚合酶、溴酚蓝和其他增强剂与稳定剂；
取2μlPCP产物用于电泳检测，检测是否有明显的目的条带，然后切胶回收目的片段；
⑥普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒
试剂盒组成：平衡液BL，溶胶液PN，漂洗液PW，洗脱缓冲液EB，吸附柱CA2，收集管；
⑦PCR产物连接pBS-T连接试剂盒
连接反应体系为：1μl的pBS-T载体，1μl的10×T4DNALigationBuffer，1μl的T4DNALigation，5μl的目的PCR片段，用ddH2O将总体系补足到10μl；
30℃反应2h后，全量转化至50μlTOP10感受态细胞中；
⑧连接产物的转化
将连接反应液10μl全部转化至50μlTOP10感受态细胞中，轻轻混匀置于冰上放置30min；将收集管置于42℃水浴中热激90s，迅速转入冰浴中2min；加入200μlLB液体培养基，37℃、220rmp震荡培养45min；取200μl上述转化培养物涂至含有Amp的LB平板上，待所有液体被吸收后，37℃倒置培养14h左右，待出现明显而又未相互重叠的单菌落时取出平板；
⑨挑取单克隆抗体
每个试样挑取20个克隆单体放入离心管中，向离心管中加800μl含有AMP的LB培养液，再置于37℃恒温摇床上220rmp培养3h，然后取少量菌液用于PCR检测，其他用于保种和测序；
⑩PCR法检测阳性克隆
阳性克隆检测的PCR反应体系为：25μl的2×PCRTaqMix，两个1μl的50mMPrimer，2μl的菌液，用ddH2O将总体系补足到50μl；
反应循环条件：94℃预变性7min，94℃变性1min，42℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环，反应最后72℃延伸7min；将在1.2kbp出现条带的菌液用于测序和保种，采用pBS-T载体测序通用引物测序；
(10)藻株的碳含量测定
采用全自动元素分析仪分别对原始水样中的藻株和得到的稳定突变株的碳含量进行测定对比；
(11)目标株的培养特性测定
采用正交试验方式，在微藻选育装置中确定出适合目标株的最高耐CO2的浓度、最适宜的培养温度、气体流速、光照条件、初始pH值和N源一系列培养条件，从而得到最终优选的目标株，实现具有高CO2耐受性和固定率微藻的选育。
进一步的，本发明中涉及的微藻选育装置主体结构包括CO2钢瓶、空气泵、CO2分析仪、水浴加热器、纤维膜组件、反应器、光源、三通阀、气体流量计、配气器、Ⅰ号管道、Ⅱ号管道和Ⅲ号管道，CO2钢瓶的瓶口处设置有Ⅰ号管道用于输送CO2气体，空气泵上连接有Ⅱ号管道用于输送空气，Ⅱ号管道通过三通阀与Ⅰ号管道连通，Ⅰ号管道上连通设置有配气器用于配制来自CO2钢瓶和空气泵的气体以形成富含CO2的气体；配气器下端连通的Ⅰ号管道通过三通阀分别与CO2分析仪和Ⅲ号管道连通，CO2分析仪用于测定CO2的体积浓度，Ⅲ号管道与反应器密封对接连通用于传送配气器配制后的气体；Ⅰ号管道和Ⅱ号管道上均设置有气体流量计用于控制气流速度，Ⅲ号管道内部设置有无菌滤膜和纤维膜组件用于过滤通入的气体，反应器固定放置于水浴加热器中进行恒温水浴加热，反应器的上方固定设置有配有光照度计的光源以提供稳定的光照强度，从而实现微藻的选育培养。
本发明与现有技术相比，详细公开了选育培养具有高CO2耐受性和固定率微藻的培养过程和方法，并科学设计了选育方法中涉及的驯化培养、定点诱变和基因重组等主要操作步骤以及所使用的微藻选育装置，所培育出的菌株具有最大条件下的CO2耐受性；整体方法原理科学，步骤清晰，易于操作，条件可控。
附图说明：
图1为本发明涉及的选育高CO2耐受性和固定率微藻的方法流程示意框图。
图2为本发明中选育方法所使用的微藻选育装置的结构原理示意图。
图3为本发明涉及的微藻选育装置中纤维膜组件的内部结构原理示意图。
具体实施方式：
下面通过实施例并结合附图对本发明做进一步描述，但本发明并不仅限于以下实施方式。
实施例1：
本实施例涉及的高CO2耐受性和固定率微藻的选育方法具体包括以下步骤：
(1)样品的采集与预培养：
试验样品为：福建稻田土壤样品(含水率≧90％)，青岛温泉镇某池塘水样，青岛温泉镇某自然河流水样，青岛温泉镇排污塘水样，青岛发电厂附近的水潭水样和青岛海泊河电厂段水样；
培养前将上述各水样在光学生物显微镜(LEICA，上海)下进行观察，分别记录所含微藻的种类；在300ml容量的反应器6中按1：3的比例加入所取样品及已灭菌的BBM培养基，将约1g湿重的微藻混合试样接种到该培养基里，在光照培养箱(SPX-250B,上海跃进医疗器械厂)中进行培养，控制培养条件为：25℃±2℃，光照强度25000Lux，光暗比12：12,培养液初始pH值为6；预培养3周待明显变绿后，按上述步骤继续进行扩大培养，将50ml水样加入到150毫升已灭菌的BBM培养基中，培养方法同上；
(2)模拟烟气驯化培养
将预培养后的微藻试样装入新的反应器6内进行驯化培养，将配气器10中配制的成分和含量分别为CO215(％，v/v)、N283(％，v/v)和O22(％，v/v)的模拟烟气，通过三通阀8和Ⅲ号管道13通入反应器6中，通过气体流量计9控制气流速度大于60mL/min，光源7选用白炽灯控制光照强度为11000Lux，光照周期为10：14(h)，驯化培养4天；取驯化后的藻液1mL接种到新的反应器6的培养基中，依照上述方法反复驯化培养三次得高密度藻液，然后采用平板分离法进行微藻分离试验；
(3)平板分离
将上述高密度藻液接种在平板上，控制温度21℃-25℃，光照强度25000Lux，光照周期12:12，培养6-8天并观察藻落生长情况；
(4)较纯种群的采集
待步骤(3)中单藻落形成时，挑取部分藻落在显微镜下观察，选取较多同一种属的进行分离和采集；
(5)获得纯种群
将步骤(3)和(4)反复多次进行多代培养，直至单菌落特征一致，且显微镜下观察为唯一种属时确定为纯菌落藻种而进行保存；
(6)纯种保存
将纯菌落藻种接种于斜面培养基中，放置于恒温培养箱中控温4℃保存，1-2个月转接一次，直至长出清晰藻落；
(7)培养特性测定
取50ml对数生长期藻液接种到新的反应器6内已灭菌的BBM培养基中，设置不同温度、气体流速、光照条件和培养基初始pH值一系列培养条件进行寻优试验以得出最佳培养条件；
(8)高强度驯化培养
取50ml对数生长期藻液接种到新的反应器6内已灭菌的450mlMBM培养基中，分别在CO2浓度为3％、5％、10％、15％、20％、30％、60％和80％及普通空气条件下培养6天时间，观察微藻的生长情况，考察并记录微藻对高浓度CO2的耐受性，以筛选获得耐受性相对高的菌株；
(9)基因诱变育种
根据致死率为70-80％有利于正向突变的原则，通过预实验确定适合的诱变剂量后进行紫外线诱变选育；选择诱变剂量为紫外线照射30min，处理OD680nm分别为0.020、0.031、0.035、0.046、0.055和0.088的藻液，并根据细胞致死率确定初始藻细胞浓度；上述不同取值下OD680nm的每个诱变试验做3个平行样后取其平均值，诱变后预培养同步骤(1)的预培养过程，然后按照步骤(3)、(4)、(5)筛选出单株优良藻株；
(10)传代稳定性测定
将筛选得到的单株优良藻株分别接种入新的反应器6内新鲜培养液中连续培养四代，并对第四代藻株测其生长曲线与第一代藻株比较，得到稳定突变株后再进行下个步骤，否则重复步骤(9)和(10)直至得到稳定突变株；
(11)基因克隆和测序
①菌液与质粒
将得到的生长稳定的稳定突变株制成菌液，以大肠杆菌(感受态细胞Top10)和PMG为质粒载体；
②缓冲液及试剂
TAE：40mMTris-acetate,10mMEDTA，
EB：1gEB溶于100ml蒸馏水中，放于棕色瓶中避光保存，
试剂：植物基因组DNA提取试剂盒PlantGenomicDNAKit，普
通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TIANgelMidiPurificationKit；
③藻细胞DNA的提取
取15ml对数生长期的菌株，在4300g下离心15min后转接到离心管在-20℃条件下冻结；取出离心管在室温条件下溶解，在12000rmp离心30s，对沉底的组织进行物理破碎；将65℃预热的700μl缓冲液GP1转入离心管中迅速颠倒混匀后，放在65℃水浴中20min，该过程中多次颠倒摇晃以混合样品；加入700μl氯仿充分混匀，在12000rmp下离心5min；将所得上层水相转入新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2充分混匀；将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rmp下离心30s后弃掉废液；向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前加入无水乙醇)，12000rmp下离心30s后倒掉废液，将吸附柱CB3中放入收集管中；向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前加入污水乙醇)，12000rmp下离心30s后倒掉废液，将吸附柱CB3中放入收集管中；向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rmp下离心30s后倒掉废液；将吸附柱CB3中放回收集管中，12000rmp下离心2min后倒掉废液；将吸附柱CB3置于室温放置，以彻底晾干残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入新的干净离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl水(pH值在7.0-8.5之间)，室温放置2-5min，12000rmp离心2min，将溶液收集到离心管中；将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rmp离心2min得DNA产物，将DNA产物保存在-20℃，以防DNA降解；
④引物设计
从Genebank中获得菌株的rbcL基因序列，引物设计采用ClustalX1.8软件进行分析。按以下原则进行筛选：引物要与模板序列紧密互补，引物间要避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物特异性要高以避免错误引发，引物Tm值在55-65℃、GC含量在40-60％，引物的3’端避免使用碱基T，3’端避免出现3个以上的连续相同碱基，不要在3’端或是离3’端太近的位置形成二聚体；选择最保守的区域得到引物。
⑤PCR反应体系和反应条件
表1PCR反应体系
反应循环条件：94℃预变性7min，94℃变性1min，42℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环，反应最后72℃延伸7min；
1ml的2×PCRTaqMix中含有：100nMkcl、20nMTris-HCL、3nMMgcl2、400ΜmdNTP混合物、0.1U/μlTaqDNA聚合酶、溴酚蓝和其他增强剂与稳定剂。
取2μlPCP产物用于电泳检测，检测是否有明显的目的条带，然后切胶回收目的片段；
⑥普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒
试剂盒组成：平衡液BL，溶胶液PN，漂洗液PW，洗脱缓冲液EB，吸附柱CA2，收集管；
⑦PCR产物连接(pBS-T连接试剂盒)
表2连接反应体系
30℃反应2h后，全量转化至TOP10感受态细胞(50μl)中；
⑧连接产物的转化
将连接反应液10μl全部转化至50μlTOP10感受态细胞中，轻轻混匀置于冰上放置30min；将收集管置于42℃水浴中热激90s，迅速转入冰浴中2min；加入200μlLB液体培养基，37℃、220rmp震荡培养45min；取200μl上述转化培养物涂至含有Amp(50μg/ml)的LB平板上，待所有液体被吸收后，37℃倒置培养14h左右，待出现明显而又未相互重叠的单菌落时取出平板；
⑨挑取单克隆抗体
每个试样挑取20个克隆单体放入离心管中，向离心管中加800μl含有AMP的LB培养液，再置于37℃恒温摇床上220rmp培养3h，然后取少量菌液用于PCR检测，其他用于保种和测序；
⑩PCR法检测阳性克隆
表3阳性克隆检测的PCR反应体系
反应循环条件：94℃预变性7min，94℃变性1min，42℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环，反应最后72℃延伸7min；将在1.2kbp出现条带的菌液用于测序和保种，采用pBS-T载体测序通用引物测序；
(12)藻株的碳含量测定
采用全自动元素分析仪分别对原始水样中的藻株和得到的稳定突变株的碳含量进行测定对比；
(13)目标株的培养特性测定
采用正交试验方式，在实施例1的微藻选育装置中确定出适合目标株的最高耐CO2的浓度、最适宜的培养温度、气体流速、光照条件、初始pH值和N源一系列培养条件，从而得到最终优选的目标株，实现具有高CO2耐受性和固定率微藻的选育。
经测定分析，本实施例中培育出的目标株具有高CO2耐受性和固定力，在20％(v/v)CO2时具有最好的生长，固定率高达5.762g/(L·d)，最高CO2耐受浓度高达100％(v/v；)其分类命名:Chlorellasp.Y-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年11月14日，保藏编号CGMCCNo.5429。
实施例2：
本实施例中具有高CO2耐受性和固定率的微藻选育方法具体在微藻选育装置中进行选育培养，所述微藻选育装置主体结构包括CO2钢瓶1、空气泵2、CO2分析仪3、水浴加热器4、纤维膜组件5、反应器6、光源7、三通阀8、气体流量计9、配气器10、Ⅰ号管道11、Ⅱ号管道12和Ⅲ号管道13，CO2钢瓶1的瓶口处设置有Ⅰ号管道11用于输送CO2气体，空气泵2上连接有Ⅱ号管道12用于输送空气，Ⅱ号管道12通过三通阀8与Ⅰ号管道11连通，Ⅰ号管道11上连通设置有配气器10用于配制来自CO2钢瓶1和空气泵的气体以形成富含CO2的气体；配气器10下端连通的Ⅰ号管道11通过三通阀8分别与CO2分析仪3和Ⅲ号管道13连通，CO2分析仪3用于测定CO2的体积浓度，Ⅲ号管道13与反应器6密封对接连通用于传送配气器10配制后的气体；Ⅰ号管道11和Ⅱ号管道12上均设置有气体流量计9用于控制气流速度，Ⅲ号管道13内部设置有无菌滤膜和纤维膜组件5用于过滤通入的气体，反应器6固定放置于水浴加热器4中进行恒温水浴加热，反应器6的上方固定设置有配有光照度计的光源7以提供稳定的光照强度，从而实现微藻的选育培养。
本实施例中涉及的反应器6为内装有培养基的有机玻璃瓶优选三角瓶，其侧面均匀涂制有白色涂料以防止侧面光影响，控制反应器6的上层和两侧光照面积总和为反应器6自身表面积的6-10％；涉及的纤维膜组件5为中空框架结构的组件(具体如图3所示)，其带有入口和出口并设计成有助于产生内部紊流的形式，所使用的纤维膜为四聚丙烯制成的多孔中空纤维，纤维的内外直径分别为0.330mm和0.630mm，孔径为0.2μm，表面孔隙率为69％。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此；任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种具有高CO2耐受性和固定率的微藻选育方法，其特征在于具体包括以下步骤：
(1)样品的采集与预培养：
采集土壤、池塘、自然河流、排污塘、电厂水塘中的水样作为试验样品，培养前将上述各水样在光学生物显微镜下进行观察，分别记录所含微藻的种类；在反应器6中按1：3的容量比例加入所取样品及已灭菌的BBM培养基，将微藻混合试样接种到该培养基里，在光照培养箱中进行培养，控制培养条件为：25℃±2℃，光照强度25000Lux，光暗比12：12,培养液初始pH值为6；预培养3周待明显变绿后，按上述步骤继续进行扩大培养，培养方法同上；
(2)模拟烟气驯化培养
将预培养后的微藻试样装入新的反应器6内进行驯化培养，将配制的含有体积比为CO215％、N283％和O22％的模拟烟气通入反应器中，控制气流速度大于60mL/min，光照强度为11000Lux，光照周期为10h：14h，驯化培养4天；取驯化后的藻液接种到新的反应器6的培养基中，依照上述方法反复驯化培养三次得高密度藻液，然后采用平板分离法进行微藻分离试验；
(3)平板分离
将上述高密度藻液接种在平板上，控制温度21℃-25℃，光照强度25000Lux，光照周期12:12，培养6-8天并观察藻落生长情况；待单藻落形成时，挑取部分藻落在显微镜下观察，选取较多同一种属的进行分离和采集；
(4)获得纯种群并进行保存
将步骤(3)反复多次进行多代培养，直至单菌落特征一致，且显微镜下观察为唯一种属时确定为纯菌落藻种而进行保存；将纯菌落藻种接种于斜面培养基中，放置于恒温培养箱中控温4℃保存，1-2个月转接一次，直至长出清晰藻落；
(5)培养特性测定
按体积比1:9取对数生长期藻液接种到新的反应器6内已灭菌的BBM培养基中，设置不同温度、气体流速、光照条件和培养基初始pH值一系列培养条件进行寻优试验以得出最佳培养条件；
(6)高强度驯化培养
按体积比1:9取对数生长期藻液接种到新的反应器6内已灭菌的MBM培养基中，分别在CO2浓度为3％、5％、10％、15％、20％、30％、60％和80％及普通空气条件下培养6天时间，观察微藻的生长情况，考察并记录微藻对高浓度CO2的耐受性，以筛选获得耐受性相对高的菌株；
(7)基因诱变育种
根据致死率为70-80％有利于正向突变的原则，通过预实验确定适合的诱变剂量后进行紫外线诱变选育；选择诱变剂量为紫外线照射30min，处理OD680nm分别为0.020、0.031、0.035、0.046、0.055和0.088的藻液，并根据细胞致死率确定初始藻细胞浓度；上述不同取值下OD680nm的每个诱变试验做3个平行样后取其平均值，诱变后预培养同步骤(1)的预培养过程，然后按照步骤(3)和(4)筛选出单株优良藻株；
(8)传代稳定性测定
将筛选得到的单株优良藻株分别接种入新的反应器6内新鲜培养液中连续培养四代，并对第四代藻株测其生长曲线与第一代藻株比较，得到稳定突变株后再进行下个步骤，否则重复步骤(7)和(8)直至得到稳定突变株；
(9)基因克隆和测序
①菌液与质粒
将得到的生长稳定的稳定突变株制成菌液，以大肠杆菌和PMG为质粒载体；
②缓冲液及试剂
TAE：40mMTris-acetate,10mMEDTA，
EB：1gEB溶于100ml蒸馏水中，放于棕色瓶中避光保存，
试剂：植物基因组DNA提取试剂盒PlantGenomicDNAKit，普
通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TIANgelMidiPurificationKit；
③藻细胞DNA的提取
取15ml对数生长期的菌株，在4300g下离心15min后转接到离心管在-20℃条件下冻结；取出离心管在室温条件下溶解，在12000rmp离心30s，对沉底的组织进行物理破碎；将65℃预热的700μl缓冲液GP1转入离心管中迅速颠倒混匀后，放在65℃水浴中20min，该过程中多次颠倒摇晃以混合样品；加入700μl氯仿充分混匀，在12000rmp下离心5min；将所得上层水相转入新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2充分混匀；将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rmp下离心30s后弃掉废液；向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rmp下离心30s后倒掉废液，将吸附柱CB3中放入收集管中；向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12000rmp下离心30s后倒掉废液，将吸附柱CB3中放入收集管中；向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rmp下离心30s后倒掉废液；将吸附柱CB3中放回收集管中，12000rmp下离心2min后倒掉废液；将吸附柱CB3置于室温放置，以彻底晾干残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入新的干净离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μlpH值在7.0-8.5之间的水，室温放置2-5min，12000rmp离心2min，将溶液收集到离心管中；将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rmp离心2min得DNA产物，将DNA产物保存在-20℃，以防DNA降解；
④引物设计
从Genebank中获得菌株的rbcL基因序列，引物设计采用ClustalX1.8软件进行分析。按以下原则进行筛选：引物要与模板序列紧密互补，引物间要避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物特异性要高以避免错误引发，引物Tm值在55-65℃、GC含量在40-60％，引物的3’端避免使用碱基T，3’端避免出现3个以上的连续相同碱基，不要在3’端或是离3’端太近的位置形成二聚体；选择最保守的区域得到引物；
⑤PCR反应体系和反应条件
PCR反应体系为：25μl的2×PCRTaqMix，两个1μl的50mMPrimer，2μl的模板DNA；用ddH2O将总体系补足到50μl；
反应循环条件：94℃预变性7min，94℃变性1min，42℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环，反应最后72℃延伸7min；
1ml的2×PCRTaqMix中含有：100nMkcl、20nMTris-HCL、3nMMgcl2、400ΜmdNTP混合物、0.1U/μlTaqDNA聚合酶、溴酚蓝和其他增强剂与稳定剂；
取2μlPCP产物用于电泳检测，检测是否有明显的目的条带，然后切胶回收目的片段；
⑥普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒
试剂盒组成：平衡液BL，溶胶液PN，漂洗液PW，洗脱缓冲液EB，吸附柱CA2，收集管；
⑦PCR产物连接pBS-T连接试剂盒
连接反应体系为：1μl的pBS-T载体，1μl的10×T4DNALigationBuffer，1μl的T4DNALigation，5μl的目的PCR片段，用ddH2O将总体系补足到10μl；
30℃反应2h后，全量转化至50μlTOP10感受态细胞中；
⑧连接产物的转化
将连接反应液10μl全部转化至50μlTOP10感受态细胞中，轻轻混匀置于冰上放置30min；将收集管置于42℃水浴中热激90s，迅速转入冰浴中2min；加入200μlLB液体培养基，37℃、220rmp震荡培养45min；取200μl上述转化培养物涂至含有Amp的LB平板上，待所有液体被吸收后，37℃倒置培养14h左右，待出现明显而又未相互重叠的单菌落时取出平板；
⑨挑取单克隆抗体
每个试样挑取20个克隆单体放入离心管中，向离心管中加800μl含有AMP的LB培养液，再置于37℃恒温摇床上220rmp培养3h，然后取少量菌液用于PCR检测，其他用于保种和测序；
⑩PCR法检测阳性克隆
阳性克隆检测的PCR反应体系为：25μl的2×PCRTaqMix，两个1μl的50mMPrimer，2μl的菌液，用ddH2O将总体系补足到50μl；
反应循环条件：94℃预变性7min，94℃变性1min，42℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环，反应最后72℃延伸7min；将在1.2kbp出现条带的菌液用于测序和保种，采用pBS-T载体测序通用引物测序；
(10)藻株的碳含量测定
采用全自动元素分析仪分别对原始水样中的藻株和得到的稳定突变株的碳含量进行测定对比；
(11)目标株的培养特性测定
采用正交试验方式，在微藻选育装置中确定出适合目标株的最高耐CO2的浓度、最适宜的培养温度、气体流速、光照条件、初始pH值和N源一系列培养条件，从而得到最终优选的目标株，实现具有高CO2耐受性和固定率微藻的选育。
2.根据权利要求1所述的具有高CO2耐受性和固定率的微藻选育方法，其特征在于该方法在微藻选育装置中实现，所述微藻选育装置主体结构包括CO2钢瓶、空气泵、CO2分析仪、水浴加热器、纤维膜组件、反应器、光源、三通阀、气体流量计、配气器、Ⅰ号管道、Ⅱ号管道和Ⅲ号管道，CO2钢瓶的瓶口处设置有Ⅰ号管道用于输送CO2气体，空气泵上连接有Ⅱ号管道用于输送空气，Ⅱ号管道通过三通阀与Ⅰ号管道连通，Ⅰ号管道上连通设置有配气器用于配制来自CO2钢瓶和空气泵的气体以形成富含CO2的气体；配气器下端连通的Ⅰ号管道通过三通阀分别与CO2分析仪和Ⅲ号管道连通，CO2分析仪用于测定CO2的体积浓度，Ⅲ号管道与反应器密封对接连通用于传送配气器配制后的气体；Ⅰ号管道和Ⅱ号管道上均设置有气体流量计用于控制气流速度，Ⅲ号管道内部设置有无菌滤膜和纤维膜组件用于过滤通入的气体，反应器固定放置于水浴加热器中进行恒温水浴加热，反应器的上方固定设置有配有光照度计的光源以提供稳定的光照强度，从而实现微藻的选育培养。
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