CN102703326B - 一株高co2耐受性和固定率的微藻及其选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微藻生物技术领域，特别涉及一种高CO₂耐受性和固定率的微藻及其选育方法。该藻命名为Chlorella sp.Y-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC No.5429。其特点：从自然环境分离得到出发株，经高CO₂浓度条件强化培养、基因克隆、诱变育种等操作后，目标株的碳含量增至56.981％，最佳固定浓度达20％(v/v)，固定率高达5.762g/(L.d)，最高耐受浓度为100％(v/v)，对一系列物理化学培养条件有较好的适应性，传代稳定性良好，总体性能好于目前同类研究成果。发明的目的是解决高浓度CO₂生物固定技术的瓶颈问题，培育一种能高效固定高浓度CO₂的高效生物，实现烟道气等高浓度复杂环境下CO₂的有效固定，同时产生出有益的生物质。

Description

一株高CO2耐受性和固定率的微藻及其选育方法

技术领域

本发明属于微藻生物技术领域，具体涉及一株高CO₂耐受性和固定率的微藻及其选育方法。 

背景技术

近百年来，全球气温明显升高，已经对许多地区的自然生态系统产生了负面影响，甚至导致不可修复性的破坏。随着升温幅度的增加，遭受破坏的生态系统的数目和地理范围也在不断地增加。大量研究表明，全球升温以及由此引发的不良后果主要缘于人类活动排放的CO₂等温室气体的温室效应。CO₂一直是人类活动排放的主要温室气体，因此，CO₂也就不可避免地成为当前温室气体减排控制的重点。 

我国是世界上的人口大国、能源生产和消费大国，每年由化石燃料燃烧排放的温室气体的量一直居高不下。2006年底，科技部联合中国气象局、中国科学院等部门发布的《气候变化国家评估报告》指出，在过去的100年里，我国气温升高了0.6℃，东北最近50年升高了1.1℃，据估测，在未来100年，还可能增加2℃～4℃。现在过去100年增温1℃左右就灾害频繁，未来将会怎样？因此，面对我国气候变化的严峻形势、面对全球环境的新要求，在对所排放烟气中的SO₂和NO_X等大气污染物进行处理的同时，也必须对CO₂的排放加以控制，以承担我国对全球环境变化的责任。 

如何在现有的燃料和能源结构条件下，采取经济有效的方法控制CO₂的排放，是发明者近几年一直致力研究的课题。根据前人的研究经验和本人近几年成果分析，微生物法是一种行之有效的减排法。但是，氢化细菌培养需通入氢气，在实际工程应用中增加了技术的复杂性；微藻耐高温性差，通常当CO₂浓度大于5％时生长就会受到抑制，固碳效率较低。因此选育能高效固定高浓度CO₂的微藻对该技术的发展至关重要。选育合适的微生物不仅可实现对高浓度CO₂高效减排，解决生物法的技术瓶颈，所获得的生物质还可通过质能转化开发新能源，减少对化石燃料的需求，进一步减少因化石燃料燃烧而引起的CO₂的排放，同时又创造了经济效益。选育合适的微生物，使得生物固定技术与其它减排技术相比，具有占地少、成本低、效益显著、运作简便等特点。本发明所培育高效微生物可以耐高温、实现对高浓度CO₂的有效固定，同时，生产的生物质可以作为新能源代替化石燃料，或者用来生产饲料、肥料和绿色食品等。因此，该发明是一项非常重要的绿色环保、高效节能型项目。 

国内外典型研究成果见表1。这些研究或因最适CO₂浓度和最高耐受浓度低、或因为低固定率等原因都未取得满意的结果。如刘玉环等人研究的Scenedesmus dimorphus最适CO₂浓度和最高耐受浓度较高，但在最佳浓度时的固定率仅达0.99g/(L·d)。 

黄和等人的“一株小球藻及其应用”(201019026021.X)，分离的小球藻M209256最高CO₂耐受浓度仅为24.5％(v/v)，最佳CO₂固定浓度为5％(v/v)，15天最佳生物量为2.23g/L，按通常的小球藻的含碳量50％计算，最佳CO₂固定率为4.088g/L，折合0.273g/(L·d)，在CO₂浓度为24.5％(v/v)时CO₂固定率为2.05g/L，折合0.137g/(L·d)；刘君寒等人的“一株小球藻及其培养方法和应用”(201110145547.7)，该方法重点获得具有多功能的小球藻，方法述及的小球藻M4653最高CO₂耐受浓度为30％(v/v)，优选在5％(v/v)CO₂时油脂含量为33.5％和产量1.51g/L，在20％时仅为24.7％和0.79g/L，显然该藻不适宜高CO₂浓度环境生存，且方法中也未对该藻的适宜CO₂浓度和最佳CO₂固定情况进行阐述。李福利等人的“一株栅藻及其培养方法和应用”(201110144545.6)，方法仅述及栅藻M4653可用于空气-30％(v/v)CO₂环境，研究重点在于含氨氮等废水的净化及其油脂含量，对CO₂固定及去除情况未提及，且最佳生物质生长量出现在5％(v/v)CO₂时、最佳蛋白量出现在3％(v/v)CO₂时，可以理解为最高CO₂耐受浓度为30％(v/v)，最佳固定浓度仅为5％(v/v)。 

表1国内外典型的研究成果 

发明申请人曾于2004年分离出一株微藻，适宜CO₂浓度为10％(v/v)，最高固定率达2.034g/(L·d)(发表于Energy conversion and management，2005，11)，本发明是申请者在总结前面研究经验基础上，进一步分离和培育出的具有更高的CO₂耐受性和固定率的目标微藻。 

发明内容

本发明的目的是解决高浓度CO₂生物固定技术的瓶颈问题，培育一种高效固定高浓度CO₂的生物，实现烟道气等高浓度复杂环境下CO₂的有效固定，同时产生出有益的生物质。 

本发明的技术方案为：一株具有高CO₂耐受性和高固定率的微藻，其分类命名：Chlorella sp.Y-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年11月14日，保藏编号CGMCC No.5429。 

微藻的选育方法，该方法包括如下步骤： 

(1)出发株的筛选驯化和分离纯化： 

预培养采用BBM培养基，培养时间为3周，控制培养条件为：25℃±2℃，光照强度25000Lux，光暗比12∶12； 

CO₂驯化采用MBM培养基，利用CO₂混合气驯化预培养后的试样，气流体流速1L/min、光照强度25000Lux，25℃±2℃，光暗周期比为12h∶12h，驯化培养10d，CO₂混合气浓度(v/v，％，单位下同)依次为：0.035％，3％、5％和10％、15％，反复驯化4次； 

对驯化之后的藻液采用平板划线分离，直至获得纯藻种，作为出发株B-1，出发株B-1的碳含量为50.726％，最佳生长浓度15％(v/v)，固定率高达2.409g/(L·d)，最高耐受浓度为60％(v/v)，适宜的培养条件范围为在温度为25℃-30℃、初始pH为5.0-6.0、15000-25000Lux的光照、气体流速为0.8-1.01L/min； 

(2)目标株构建： 

出发株强化培养：对出发株B-1采取渐变CO₂浓度连续试验强化培养，试验条件、步骤同出发株的驯化阶段；各培养周期C0₂浓度(v/v，％)依次增加至：5％、10％、15％、20％、30％、50％、60％、80％和100％，各培养6天时间； 

基因诱变育种：诱变条件为诱变剂量致死率为70-80％、最佳诱变藻液浓度为2.5×10⁶～3.6×10⁶个/mL、诱变剂量为20W紫外灯、照射距离为25cm、辐射时间是30min；诱变后的藻液在25℃、转速141r/min、MBM培养基、30％CO₂(v/v)的气体、25000Lux光照、光暗周期比12h∶12h条件下预培养6天，按照10％的接种量每隔5d转接一次，转接三次；驯化阶段采用BBM培养基，其他条件不变，筛选出单株优良藻株，为突变株； 

基因克隆：以突变株和出发株为对象，大肠杆菌(感受态细胞Top10)和PMG为质粒载体，按照《分子克隆实验指南》配置常用缓冲液及试剂，按照植物基因组DNA提取试剂盒操作提取藻株DNA，从基因库中获得小球藻属的rbcL基因序列，引物设计采用Clustal X 1.8软件进行分析；PCR反应体系的反应循环条件为94℃预变性7min、94℃变性1min、42℃复性1min、72℃延伸1min、35个循环、反应最后72℃延伸7min；取2μL PCR产物用于电泳检测，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒切胶回收DNA片段；按pBS-T连接试剂盒进行PCR产物连接，30℃反应2h后，全部转化50μL TOP10感受态细胞中，冰上放置30min，42℃水浴热激90s，迅速转入冰浴2min，加入200μL LB液体培养基，37℃，220rmp震荡培养45min，取200μL上述转化培养物涂至含有Amp(50μg/ml)的LB平板上，待所有液体被吸收后，37℃倒置培养14h左右，出现单菌落时取出平板，挑取单克隆抗体进行检测、保种和测序；PCR法检测阳性克隆条件为94℃预变性7min，94℃变性1min，42℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环，反应最后72℃延伸7min；采用pBS-T载体测序通用引物测序； 

(3)藻株的含碳量、培养特性测定及优选目标株： 

含碳量采用全自动分析仪检测，色谱条件为：载气压力80KPa，吹扫流速80ml/min，氧化体积20ml，氧气分压35KPa，采样延迟10s，运行时间360s，前级燃烧室温度920℃，炉温115℃；以半胱氨酸为标准品，样品以20mg计，仪器的检出限：N％：0.008％，C％：0.005％； 

培养特性测定条件及过程：在初始pH 6.6、25℃、光照25000Lux、1.0L/min的培养条件下，控制CO₂含量分别为0.035％、5％、10％、20％、25％、30％、60％、和100％，确定CO₂最佳固定浓度和最高耐受性；采用正交试验，设置20℃、25℃、30℃、35℃等四个温度梯度，5000、15000、25000、35000和50000Lux五个光照梯度，pH5、pH6、pH7、pH8四个初始pH梯度，0.7、0.8、1.0、1.1、1.2、1.50L/min六个气体流速梯度，分别以NH₄Cl、NaNO₃和NaNO₂为氮源，藻液初始吸光浓度约在0.1左右，确定适宜的温度、初始pH、光照、气流速度及氮源条件； 

优选目标株：优选目标株的碳含量增至56.981％；在初始pH 6、25℃、光照25000Lux、气体流速1.1L/min、2g/L的NaNO₃为氮源时获得最佳CO₂固定浓度20％，CO₂固定率高达5.762g/(L·d)，最高耐受浓度为100％(v/v)；对环境均具有较强适应性，包括10％-35％CO₂浓度、20℃-30℃、15000-35000Lux的光照、初始pH5.0-6.5、气体流速0.8-1.10L/min、以硝酸钠为氮源的浓度在0.25-2g/L时长势良好。 

本发明的特点及有益效果：本发明以具有较高CO₂浓度的自然环境水样为基础，对原始水样进行了一系列的分离驯化操作，得到具有较高CO₂耐受性和固定率的出发株B-1。在此基础上，采用强化培养、基因工程等技术进一步提高出发株的含碳量，提高出发株的B-1耐受性和固定力，得到目标株Y-1。 

该发明有效解决了CO₂生物固定技术的瓶颈问题。(1)目标株具有高CO₂耐受性和固定力，在20％(v/v)CO₂时具有最好的生长，固定率高达5.762g/(L·d)，最高CO₂耐受浓度高达100％(v/v)。从综合角度考虑，这个结果远好于国内外目前的研究(国内外目前的典型研究成果见表1)。有效解决了一般微藻在较高CO₂浓度条件无法存活、生长受到抑制或固定力低等问题；(2)目标株对一系列物理化学培养条件具有很好的适应性，只需简单的脱硫除尘处理就可以直接用于烟气等复杂环境的高浓度CO₂的高效固定，大大减少了技术的复杂性，降低系统运行成本。(3)目标株的高生长量获得的生物质可以进行新能源开发，同时它高的含氮量性质决定其又可以用于食品、饲料加工。所以本发明不仅具有很好的社会环境效益，还具有很好的经济前景。 

附图说明

图1.试验装置图 

图2.CO₂浓度为15％(v/v)时15种微藻的生长曲线 

其中，CT1-5为某温泉池塘中分离的5种藻，HL1-3为某河流，HB1为某河流电厂段DT1-6为某稻田土壤样 

图3.B-1藻的光学显微镜和电子显微镜(×10000)照片 

图4.藻细胞密度与干重的标准曲线图 

图5.出发株和突变株rbcL基因序列扩增产物电泳图 

其中，M-marker；1，chlorella sp.；2，mutant B-1；3，mutant B-2；4，mutant-B-3；5，contrast. 

图6.NJ法构建的分子树 

图7.碳含量标准曲线 

其中、1、CO₂钢瓶；2、阀门；3、转子流量计；4、空气泵；5、滤菌膜；6、缓冲瓶；7、 电源；8、加热棒；9、曝气头；10、气体收集烧杯；11、荧光灯 

具体实施方式

第一阶段：出发株的筛选驯化及分离纯化 

试验装置如附图1所示。试验样品依次为：某稻田土壤样品(含水率≥90％)，某温泉池塘水样，某温泉自然河流水样，某温泉排污塘水样，某发电厂附近水潭水样和某电厂段水样。 

样品预培养阶段： 

BBM培养基，其组成如表2所示，pH6.6左右。将配置好的母液单独灭菌，于4℃保存。使用时，按母液顺序依次加入到蒸馏水中，混合均匀后定容到刻度。 

表2BBM培养基的组成 

取少量各取样源水样、土壤样品溶解于水中，取上清液。300ml三角瓶中按1∶3的比例加入所取样品于BBM培养基，控制培养条件为：25℃±2℃，光照强度25000Lux，光暗比12∶12，预培养3周。待明显变绿后，按上述步骤继续进行扩大培养。 

通CO₂筛选驯化、分离纯化阶段： 

MBM培养基组成如表3，pH 6.0左右，保存与配置的方法同BBM培养基一样。 

表3MBM培养基的组成(单位：mg/L) 

将50mL藻液加入到450mL的MBM培养基中，利用不同浓度的CO₂混合气驯化培养预培养 后的试样，气流流速为1L/min。采用荧光灯为光源，光照强度约为25000Lux，25℃±2℃，光暗周期比为12h∶12h，驯化培养10d。反复驯化4次。CO₂浓度(v/v，％，下同)依次为：0.035％，3％、5％和10％、15％。对驯化之后的藻液采用平板划线分离至获得纯藻种。试验经预培养、驯化和分离，共获得了15种微藻。 

控制CO₂浓度为15％，比较分离出的15种微藻对高浓度CO₂的耐受性，培养条件同驯化阶段。15种微藻10天的生长曲线如图2所示。 

取50ml对数期藻液接种到已灭菌的450mL MBM培养基中，在CO₂浓度分别为0.035％、5％、10％、15％。20％、30％、60％、80％和100％条件下培养10天时间，考察15种微藻对高浓度CO₂的耐受性。在15％CO₂时，编号DT-5呈现出最好的生长状态，5天后生长率为2.97倍/天，十天之后，吸光度值为1.42，是初始值的56.8倍，能耐受60％的CO₂。在温度为25℃-30℃、初始pH 5.0-6.0、气体流速0.8-1.01L/min、15000-25000Lux的光照范围内，生长稳定。在15％CO₂、25℃、pH 6.0、气体流速1L/min时，增长速率最高，CO₂固定率达到2.409g/(L·d)。 

DT-5在固体平板培养基上生长很好，藻落呈墨绿色，表面湿润光滑，致密性好。光学显微镜下观察为球状，单细胞，一个叶绿体，细胞微小，直径2-3μm。光学显微镜和电子显微镜(×10000)照片如图3所示。查阅淡水藻类分类学书籍，初步认定为小球藻属，将其命名为B-1藻。 

第二阶段：目标株的构建 

(一)高强度驯化培养 

对出发株B-1采取渐变CO₂浓度连续试验强化培养，试验条件及装置同前面的驯化阶段。各培养周期CO₂浓度依次增加至：5％、10％、15％、20％、30％、50％、60％、80％和100％，培养周期6天，分离筛选出长势最好的藻株，编号BB-1。 

(二)基因诱变 

藻株生长量的测定方法： 

采用吸收法和干重法，建立细胞干重和藻液吸光度A的对应关系，标准曲线图如图4。 

诱变预实验确定诱变条件： 

根据有利于正向突变的原则，选取诱变剂量致死率为70-80％。取对数生长期的藻液5mL置于直径为9cm的培养皿内，用紫外灯(20W、照射距离25cm进行0、5、10、15、20、25、30、35min不同时间的照射)，选择诱变剂量为紫外线照射30min。处理OD680nm分别为0.020、0.031、0.035、0.046、0.055、0.088的藻液，根据细胞致死率确定初始藻细胞浓度。每个试验都做3个平行样，取其平均值。 

确定藻液浓度大概在2.5×10⁶～3.6×10⁶个/m L为最佳诱变浓度，诱变剂量为20W紫外 灯，照射距离为25cm，辐射时间是30min，对BB-1进行诱变。 

诱变后预培养： 

将诱变后的藻液转移到500ml锥形瓶中，置于25℃的恒温水浴摇床中，转速141r/min，遮光12h。将藻液转接入400mL MBM培养基中，通入30％CO₂，光照25000Lux，光暗周期比为12h∶12h，藻液变绿后，按照10％的接种量转接，继续培养，以后每隔5d转接一次。 

诱变后筛选： 

取转接后生长稳定的藻液稀释后，涂于BBM平板培养基上，恒温光照培养10天后形成单个藻落。挑取深绿色单个藻落接种于含有30mL BBM培养基的试管中，在光照培养箱中培养6天后，选取吸光度较高的藻株，接种于1000mL锥形瓶中，在光强为25000Lux，温度为25℃，光暗周期比为12h∶12h时通入30％CO₂进行培养，筛选出优良藻株。 

5天培养后诱变的三组生长情况明显由于出发株，尤其是第一组。对第一组进行分离筛选，获取生长最好的单株突变株。通入30％CO₂，25℃，初始pH6.6，光照25000lux条件下，编号YB-1、YB-4和YB-13的生长明显优于出发株。经过5天的培养，最终浓度分别达到9.7×10⁷个/m L、10.12×10⁷个/m L和10.01×10⁷个/m L。 

突变株的传代稳定性测定： 

将突变株分别接入新鲜BBM培养液中连续培养四代，比较第四代藻株与第一代的生长曲线。第一代以YB-1的第一代为代表，YB-1、YB-4和YB-13第四代与YB-1第一代生长曲线相比没有明显变化，突变株传代稳定性较好。 

(三)基因克隆及测序 

以突变株YB-1、YB-4、YB-13和出发株B-1为对象，大肠杆菌(感受态细胞Top10)和PMG质粒载体。 

常用缓冲液及试剂均按照《分子克隆实验指南》进行配置。TAE：40mM Tris-acetate，10mM EDTA。EB：1gEB溶于100ml蒸馏水中，放于棕色瓶避光保存。试剂：植物基因组DNA提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit)，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANgel Midi PurificationKit)。LB培养基(g/100ml)：胰蛋白胨，1；酵母提取物，0.5；Nacl，1；琼脂，1.5；pH7.0。 

藻细胞DNA的提取： 

按照植物基因组DNA提取试剂盒操作步骤提取小球藻DNA。电泳检测。取15m L对数生长期的微藻，在4300rmp下离心15分钟收集藻体，转接到1.5m L离心管中，-20℃冻结；取出离心管在室温溶解，12000rmp离心30s，将沉底的组织进行物理破碎；将65℃预热的700μL缓冲液GP1转入离心管(实验前加入巯基乙醇，使其最终浓度为0.1％)，迅速颠倒混 匀，放在65℃水浴20分钟，同时数次颠倒离心管以混合样品；加入700μL氯仿，充分混匀，12000rmp离心5分钟；小心地将上层水相转入新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀；将混合液转入吸附柱CB3中，12000rmp离心30秒，弃掉废液；加入500μL缓冲液GD(使用前加入无水乙醇)，12000rmp离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向CB3中加入700μL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，12000rmp离心30秒，倒掉废液；将CB3放回收集管，向CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rmp离心30秒，倒掉废液；将CB3放回收集管，12000rmp离心2分钟，倒掉废液；将CB3置于室温数分钟至晾干吸附材料中残余的漂洗液；将CB3转入干净的离心管，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL专用水(pH值在7.0-8.5之间)，室温放置2-5分钟，12000rmp离心2分钟，将溶液收集到离心管中；为了增加DNA的得率，将上一步离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12000rmp离心2分钟。将DNA产物保存在-20℃，以防DNA降解。 

引物设计： 

从基因库中获得小球藻属的rbcL基因序列，引物设计采用Clustal X 1.8软件进行分析。按以下原则进行筛选：引物要与模板序列紧密互补；引物间要避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物特异性要高，避免错误引发；引物Tm值在55-65℃，GC含量在40-60％；引物的3’端避免使用碱基T；3’端避免出现3个以上的连续相同碱基，尽量不要在3’端或是离3’端太近的位置形成二聚体。选择最保守的区域，得到一对引物： 

Primer1：5’CGTTCCGTATGACTCCTC3’ 

Primer2：5’CCAAACTTCACACGCTGC3’ 

PCR反应体系和反应条件：反应体系如表4，反应循环条件为94℃预变性7min、94℃变性1min、42℃复性1min、72℃延伸1min、35个循环、反应最后72℃延伸7min。1mL2×PCRTaqMix含有：100nM kCl、20nM Tris-HCl、3nM MgCl₂、400nM dNTP混合物、0.1U/μL TaqDNA聚合酶、溴酚蓝和其他增强剂与稳定剂。取2μL PCR产物用于电泳检测，检测是否有明显的目的条带，然后切胶回收目的片段。 

表4PCR反应体系 

普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段： 

回收试剂盒组成：平衡液BL，溶胶液PN，漂洗液PW，洗脱缓冲液EB，吸附柱CA2，收集管。 

用小刀将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，尽量切除多余部分，放入干净的离心管中，称取重量；向吸附柱(吸附柱CA2放入收集管中)中加入500μL平衡液BL，12000rmp离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中；向胶块中加入3倍体积溶胶液(如凝胶重0.1g，其体积可视为100μL)。50℃水浴十分钟，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；将所得溶液加入吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12000rmp离心1min，倒掉废液，将吸附柱CA2放入收集管中；向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，静置2-5min，12000rmp离心1min，倒掉废液，将吸附柱CA2放入收集管中；向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液；将吸附柱CA2放回收集管；12000rmp离心2min，出尽漂洗液，于室温放置数分钟，彻底晾干；将吸附柱CA2放入干净的离心管中，向吸附膜中间悬空滴加适量DNA保存专用水，室温放置2min，12000rmp离心2min收集DNA溶液；为了提高DNA回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤8。 

PCR产物连接(pBS-T连接试剂盒)： 

表5连接反应体系 

30℃反应2h后，全部转化TOP10感受态细胞(50μL)中。 

连接产物的转化： 

将连接反应液10μL全部转化至50μL TOP10感受态细胞中，轻轻混匀置于冰上30min后，置于42℃水浴热激90s，迅速转入冰浴2min。加入200μL LB液体培养基，37℃，220rmp震荡培养45min。取200μL上述转化培养物涂至含有Amp(50μg/ml)的LB平板上，待所有液体被吸收后，37℃倒置培养14h左右，待出现单菌落时取出平板。 

挑取单克隆抗体： 

挑取白色单菌落，每个样挑取20个克隆单体放入离心管中。向离心管中加800μL含有AMP的LB培养液。将离心管放置37℃恒温摇床上，220rmp培养3h，取少量菌液用于PCR检测，其他用于保种和测序。 

PCR法检测阳性克隆： 

表6阳性克隆检测的PCR反应体系 

反应循环条件：94℃预变性7min，94℃变性1min，42℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环，反应最后72℃延伸7min。 

将在1.2kbp出现条带的菌液用于测序和保种，采用pBS-T载体测序通用引物测序。 

如图5所示为出发株B-1(7#)和突变株YB-1、YB-4和YB-13rbcL基因PCR扩增产物的电泳结果，获得了单一条带大约1.2kb，扩增的B-1(7#)的rbcL基因序列长度为1204bp。 

将测得的序列在基因数据库中做BLAST，结果发现出发株小球藻与Chlorella sp.IFRPD1018有最大相似性，其BLASTn值为2080，表7为Chlorella sp.的rbcL基因序列BLAST结果。 

表7 Chlorella sp.的rbcL基因序列BLAST结果 

表8 16株小球藻rbcL序列的遗传距离 

注：表中序号所代表的小球藻及其GeneBank登录号：A、Chlorella vulgaris strain NIES-227(AB260909)，B、Chlorella vulgaris strain CCAP 254/5(EF589154)，C、Chlorella vulgaris (AB001684)，D、’Chlorella’ellipsoidea strain CCAP 211/33(EF589156)，E、’Chlorella’ellipsoidea strain Ce(EU038287)，F、Chlorella sp.IFRPD 1014(AB260910)，G、Chlorella sp.IFRPD 1018(AB260911)，H、’Chlorella’luteoviridis strain UTEX 21(EF113428)，I、Auxenochlorella protothecoides strain F-2(EU038285)，J、Chlorella pyrenoidosa strain F-5(EU038282)，K、Chlorellapyrenoidosa strain F-9(EU038283)，L、Chlorella pyrenoidosa SUN CHLORELLA(AB240145)，M、Chlorella sorokiniana strain UTEX 246(EF113429)，N、’Chlorella’saccharophila(AM260446)，0、Chlorella vulgaris strain SAG 211-11b(AF499684)，P、Chlorella sp. 

表8反映了16株小球藻的rbcL序列间遗传距离。其中这15种小球藻(不包括chlorella sp.)分属于8个不同的种。根据rbcL序列计算它们的遗传距离在0.0000～0.2414。种间的遗传距离最大为0.0383，rbcL在种间和种内的保守性较好，chlorella sp.和Chlorella sp.IFRPD 1018的遗传距离最小为0.0301。 

根据小球藻和一个外群Chlamydomonas pulsa tilla(衣藻属)，采用NJ法构建分子系统树如图6。由系统树上分析可知，chlorella sp.与Chlorella sp.IFRPD 1014、Chlorella sp. IFRPD 1018聚为一族，原始小球藻Auxenochlorella protothecoides strain F-2和蛋白核小球藻的亲缘关系比较近。 

本实验所选育的藻株和Chlorella sp.IFRPD 1018种间关系最近，遗传距离、NJ系统树分析和BLASTn结果一致，Chlorella.sp和Chlorella sp.IFRPD 1018有可能是种内关系，最终确定藻株和Chlorella sp.IFRPD 1018亲缘关系最近。 

第三阶段：藻株的碳含量、培养特性测定及优选目标株 

将前面构建得到的藻株作为初选目标株，对应编号仍为YB-1、YB-4、YB-13，其他同前。 

藻株的碳含量比较： 

采用全自动元素分析仪分析出发株和初选目标株的碳含量。元素分析仪的色谱条件：载气压力80KPa，吹扫流速80ml/min，氧化体积20ml，氧气分压35KPa，采样延迟10s，运行时间360s，前级燃烧室温度920℃，炉温115℃。以半胱氨酸为标准品，样品以20mg计，仪器的检出限：N％：0.008％，C％：0.005％。标准曲线的绘制：以外表定量法，分别称取一定量的半胱氨酸进行分析得到N、C含量的标准曲线。 

碳含量标准曲线见图7，分析处理好的样品得结果如表9。 

表9出发株和初选目标株藻细胞的碳氮、硫含量 

三株初选目标株的碳含量都高于出发株，比出发株高出约6个百分点。 

藻株CO₂的耐受性及固定力比较： 

设置0.035％、5％、10％、20％、25％、30％、60％、和100％等CO₂浓度梯度，考察藻株对CO₂耐受性。其他培养条件为初始pH值为6.6、温度25℃、光照25000Lux、1.0L/min。 

出发株和初选目标株在通入10％CO₂时，最终的细胞密度相差不大，但是初选目标株在通入20％CO₂时，YB-1、YB-4和YB-13最终密度分别达到4.47×10⁸个/ml、4.85×10⁸个/ml和4.68×10⁸个/ml，均高于出发株B-1的1.3×10⁸个/ml。说明三株初选株CO₂耐高浓度性要好于出发株。当通入CO₂为20％时，初选株YB-1、YB-4和YB-13的CO₂固定速率分别达到5.591g/L·d、5.654g/(L·d)和5.619g/(L·d)，高于出发株的1.98g/(L·d)，出发株在通入15％CO₂时最大固碳速率2.409g/(L·d)。在通入100％CO₂时，初选目标株仍有一定的生长。 

其他培养条件测试： 

采用正交试验，考察温度、光照、培养液初始pH、氮源等条件。设置20℃、25℃、30℃、35℃四个温度梯度，5000Lux、15000Lux、25000Lux、35000Lux和50000Lux五个光照梯度，pH5、pH6、pH7、pH8四个初始pH梯度，0.7、0.8、1.0、1.1、1.2、1.50L/min六个气体流速梯度，取对数生长期的藻液，藻液初始吸光浓度约在0.1左右，确定适宜的CO₂浓度、温度、初始pH及光照等培养条件。 

三株初选株对一系列复杂环境均具有较强适应性，包括10％-35％CO₂浓度、20-30℃的温度、15000-35000Lux的光照、初始pH值5-7、气体流速0.8-1.10L/min。最高CO₂耐受性达100％。在通入20％CO₂，初始pH 6、25℃、光照25000Lux、气体流速1.1L/min的条件下生长最快，5天培养后YB-1、YB-4和YB-13的固碳速率分别是5.632g/(L·d)、5.704g/(L·d)和5.665g/(L·d)。YB-4的固碳速率最高。 

在最优培养条件下，分别以NH₄Cl、NaNO₃和NaNO₂为氮源，考察氮源对YB-4固碳效果的影响。NH₄Cl对YB-4有抑制作用，浓度大于150mg/l的NaNO₂能“杀死”YB-4，最适合的氮源为NaNO₃。以硝酸钠为氮源的浓度在0.25-2g/L时，长势良好，在NaNO₃浓度为2g/l时，YB-4取得最大固碳速率5.762g/(L·d)。 

根据前面的研究结果，确定初选目标株YB-4为最终优选目标藻株，命名为Chlorella sp.Y-1。 

Claims (1)

1.一株具有高CO₂耐受性和高固定率的微藻，其分类命名：Chlorella sp.Y-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年11月14日，保藏编号CGMCC No.5429。

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