CN102311919A

CN102311919A - 一种保藏微藻藻种的方法

Info

Publication number: CN102311919A
Application number: CN 201010222005
Authority: CN
Inventors: 师文静; 王领民; 金平; 李晓姝; 王崇辉
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Priority date: 2010-07-07
Filing date: 2010-07-07
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2030-07-07
Also published as: CN102311919B

Abstract

本发明公开了一种保藏微藻藻种的方法，包括以下内容：将所要保藏藻种收集，获得藻泥，然后将藻泥与保护剂混合制成藻种细胞悬液，上述藻种细胞悬液经过程序预冻过程，最终完全冻结；冻结后的藻种细胞悬液在减压的条件下使水分升华，形成固形海绵体状物质保藏即可；保护剂为脱脂乳和维生素的复合保护剂，以重量计脱脂乳的含量为5％～20％，维生素0.5％～2％。本发明方法具有能够避免杂菌污染、保存效果好、时间长、并且在常温下能够保存、便于运输以及可方便复活使用等优点。

Description

一种保藏微藻藻种的方法

技术领域

本发明属于微藻生物技术领域的微藻藻种保藏方法，特别是涉及一种可以长期保藏微藻藻种的方法。

背景技术

藻类是最低等的自养放氧植物，它是低等植物中种类繁多、分布极其广泛的一个类群。无论是海洋、淡水湖泊等水域，或是潮湿的土壤、树干等处，几乎在有光和潮湿的任何地方都能生存。微藻则是指一些微观的单细胞、群体或丝状的藻类，大多数是浮游藻类，生物量大、分布广。藻类通过热解可获得生物质燃油，是重要的可再生生物能源；通过农业化学技术可从一些富含脂肪的微藻中提取油脂，用于制备食用油或生物柴油；藻类中还含有多种维生素、胡萝卜素、蛋白质、脂肪酸等成分，是药用活性物质的重要来源；藻类还可用于污水处理等。据估算，地球上的生物每年通过光合作用可固定8×10¹⁰吨碳，生产1.46×10¹¹吨生物质，其中40％应归功于藻类的光合作用。因此，藻类生物与人类的生存和发展有极其密切的关系，是重要的可再生生物资源。

微藻藻种的保藏技术一直是制约生产培养单位藻种正常供应和长期保存的重要因素。国内外关于微藻藻种保藏技术报道并不多，目前常用液体传代保藏法保藏藻种，这种方法保种时间短，在低温下仅能保藏3个月，营养盐消耗也快，易污染，工作量也大，容易造成保种的失败。王勇军等人在《水产养殖》2003年第24卷第1期《常用海洋单细胞藻种的固体培养基的保藏技术》一文中介绍了一种海洋微藻固体培养基保藏技术，这种保藏技术在5～8℃下保藏时间约为1年，若延长保存时间，则需要降低温度，但是过低的温度又会造成藻种的死亡，而且用固体培养基长期保藏会造成固体培养基表面干燥，所以也需要定期移种，造成污染和杂菌生长。项文钰等人在《水利渔业》2004(3)：23-24页《微藻冷冻保藏的研究》一文中采用液氮深冷保藏法对小球藻和蛋白核小球藻的保藏作了研究，采用甘油、DMSO作保护剂，此种技术虽然保藏效果较好，时间也较长，但是必须在液氮中深冷保藏，不利于运输。

根据上述分析，目前科研与生产中，微藻藻种可实现短期或中期保藏，但存在着保藏时间短、易染杂菌、不便于运输、复活过程繁琐等的缺陷。而长期有效保藏的方法较少，需要开发出理想的长期保藏藻种的方法，而且需要所保藏的藻种复活过程方便快捷。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种理想的长期保藏微藻藻种的方法，本发明方法具有能够避免杂菌污染、保存效果好、时间长、并且在常温下能够保存、便于运输以及可方便复活使用等诸多优点。

本发明微藻藻种保藏的方法包括以下内容：将所要保藏藻种收集，获得藻泥，使之与保护剂混合制成藻种细胞悬液，上述藻种细胞悬液经过程序预冻过程，最终完全冻结；冻结后的藻种细胞悬液在减压的条件下使水分升华，形成固形海绵体状物质保藏即可，此时藻种的生长和代谢都暂时停止，活性得到保留，可在室温下长期保存。

本发明方法中，所保藏的微藻藻种可以选自普通小球藻、葡萄藻、小环藻、微绿球藻、硅藻等单细胞藻类之任何一种。

本发明方法中，所收集的藻种培养液生长状态良好，最优选藻液处于生长的稳定期。

本发明方法中，制作藻种细胞悬液的保护剂为脱脂乳和维生素的复合保护剂，以重量计脱脂乳的含量为5％～20％，维生素为0.5％～2％，藻种细胞悬液的细胞密度为1.0×10⁸～5.0×10⁹个/mL。其中的维生素可以是维生素B、维生素C、维生素E中的一或几种，维生素B如B₂、B₁₂、等中的一种或几种，优选为维生素E。

本发明方法中，程序预冻过程采用逐步降温的方式对藻种细胞悬液进行预冻，优选进行三级预冻过程，室温～4℃维持4～6小时；4℃以下至-18℃维持4～6小时，-18℃以下至-60℃维持4～6小时。

本发明技术方案可以通过以下具体步骤得到进一步实现：

(1)将处于稳定生长期的藻液通过镜检，确定无杂菌后低温下(优选10℃以下)离心收集藻泥。

(2)将步骤(1)的藻泥加入配制的复合保护剂中，制成藻种细胞悬液，藻细胞密度大约为1.0×10⁸～5.0×10⁹个/mL。

(3)将(2)步骤的藻种细胞悬液分装在保存藻种用的安瓿管中，每个分装0.2mL，并用消毒过的脱脂棉把口封住，避免空气中的杂菌污染。

(4)将分装好藻种细胞悬液的安瓿管在冷冻设备中采取分级降温进行预冻。

(5)冷冻真空干燥，启动冷冻真空干燥机制冷系统。冷冻真空干燥在温度-50℃以下进行，优选在-50～-60℃进行。当冷冻真空干燥机冷却至所需温度时，启动真空泵抽气，将预冻的装有藻悬液的安瓿管连接到冷冻干燥机的岐管上抽真空直至样品干燥。

(6)将样品抽真空2～3小时，此时安瓿管内的样品为蓬松的海绵状物体为达到要求，样品完全干燥。然后用酒精喷灯对样品管进行熔封。

(7)将装有藻种的安瓿管放在室温下或低温下(如-20～30℃)保存。

(8)定期将保存的藻种接种到新鲜的培养基上进行复壮，并采用平板藻落计数法对保藏的藻种进行存活率检测。

本技术与现有的藻种保藏技术相比，具有以下优点和积极效果：

本发明所采用的保护剂在传统的冷冻干燥单一保护剂脱脂乳的基础上，添加了水溶性维生素的微量物质，该物质具有强抗氧化作用，可以防止细胞膜受自由基的损害，具有维持细胞膜稳定性的作用，并且还可以对损伤的细胞有一定的修复作用。本发明在采用冷冻真空干燥技术基础上，采用了程序分级预冻方式，避免藻细胞在快速冷冻时遭到破坏。本发明采用逐步缓慢降温的方式可以让藻细胞进行自身的调节来适应环境的变化，避免快速冷冻带来的细胞的损伤。因此采用本发明的技术方案保藏藻种可以达到以下效果：

(1)在真空和干燥条件下保藏藻种，藻种的代谢活动停止，繁殖受到抑制，保藏藻种的时间长，现有的固体传代保藏技术仅能保藏1～2年，本发明保藏藻种可以长达10年。

(2)在常规的冻干保护剂的基础上，加入了微量物质，同时采用了逐步分级降温预冻的方式，提高了保藏的藻种存活率，存活率可达95％以上，保藏1年后藻种存活率仍可达90％，性质稳定。

(3)干燥的藻种在熔封的安瓿管中常温下即可保藏，不受温度和设备的限制，便于运输。

具体实施方式

本发明方法中对所要保藏的藻种在无菌不失活条件下进行收集，使用理想的保护剂以及优化其配比，制成藻细胞悬液，分装到保藏管后通过程序预冻，最后预冻好的藻细胞样品在真空状态下冷冻干燥。

所用的离心管和安瓿管(封口用脱脂棉塞住)用牛皮纸包好放在灭菌锅里在121℃、0.1MPa下灭菌20分钟，保护剂的灭菌条件为110℃下20分钟。以下通过实施例进一步说明本发明方案和技术效果，其中的百分含量为重量百分含量。

实施例1

取处于稳定期的小球藻藻液，藻液中活藻密度为1×10⁹个/mL藻液，离心后富集收集藻泥，加入脱脂乳含量20％及0～2％维生素保护剂中，用接种环混匀配成活藻密度为2.5×10⁹个/mL的藻种细胞悬液，将配制好的藻种细胞悬液吸取0.2mL分装在安瓿管中，分装好后用脱脂棉把口塞住，以防空气中杂菌进入。

将装有藻液的安瓿管放在三级冰箱中分级进行预冻，4℃大约6小时；-12℃大约6小时；-50℃大约6小时。

预冻过程中启动真空冷冻干燥系统，当温度下降到-50～-52℃以下时，启动真空泵抽气，当真空度降到10～20Pa(绝对压力)后，将预冻好装有藻液的安瓿管连接到冷冻干燥机的岐管上抽真空直至样品干燥，当安瓿管管内的样品成蓬松的海绵状时，用酒精喷灯对安瓿管进行熔封，熔封过程在真空度10～20Pa下进行。

将熔封后的安瓿管理的干藻粉用新鲜培养基溶解，进行活藻数目检测。

藻液中活藻密度采用平板藻落计数法，测定方法参考《工业微生物实验技术手册》(中国轻工业出版社，1997)。

检测结果如下表1所示。

表1添加不同浓度维生素藻细胞存活率表

由表1可以看出，保护剂中添加适宜维生素后藻细胞存活率升高，添加量以0.5％-2％为佳。

实施例2：

将稳定期的小球藻藻液离心收集藻泥，加入含量为20％的脱脂乳和2％的维生素E的复合保护剂，配成不同藻细胞浓度的藻悬液，不同藻细胞浓度的藻悬液按实施例1进行分装，预冻，冷冻真空干燥。预冻过程为：4℃大约4小时；-18℃大约4小时；-55℃大约4小时。干燥后将被保藏的藻种用0.2mL的培养基溶解，并对溶解后的藻液进行活藻数目检测，所得结果如表2，以干燥前保护剂中活藻密度在1×10⁸～5×10⁹个/mL为佳。

表2不同浓度保存的小球藻检测结果

实施例3

取处于稳定期的小球藻藻液，藻液中活藻密度为1×10⁹个/mL藻液，加入含量为20％的脱脂乳和2％的维生素E的复合保护剂，按实施例1进行分装，对分装的样品分别采用两种预冻的方式过程。一种方式为快速冷冻的方式，把样品放在深冷冰箱中快速降温至-55℃，并预冻4小时；另一种方式为程序降温方式，预冻过程同实施例2。其他冷冻干燥过程同实施例1所述，冷冻干燥后将保存的藻种进行活藻数目检测，所得的结果如表3所示。

实施例4

取处于稳定期的小球藻藻液，藻液中活藻密度为3×10⁹个/mL藻液，离心后收集藻泥，加入脱脂乳含量10％及0.5％维生素E的保护剂，用接种环混匀配成活藻密度为1×10⁹个/mL的藻悬液，将配制好的藻悬液吸取0.2mL分装在安瓿管中，分装好后用脱脂塞住。预冻过程为：4℃大约5小时；-5℃大约6小时；-25大约6小时。其它过程如实施例1所述。常温保藏后的藻种定期复壮检测存活率，结果如表4。

表4保藏后藻种不同时间的存活率

保藏时间	存活率
		1个月	96％
3个月	96％
		1年	92％
2年	89％

上述实施例是相对于小球藻而言，对于硅藻、葡萄藻、小环藻可以得出类似的结果。

Claims

1.一种保藏微藻藻种的方法，包括以下内容：将所要保藏藻种收集，获得藻泥，然后将藻泥与保护剂混合制成藻种细胞悬液，上述藻种细胞悬液经过程序预冻过程，最终完全冻结；其特征在于：冻结后的藻种细胞悬液在减压的条件下使水分升华，形成固形海绵体状物质保藏即可；保护剂为脱脂乳和维生素的复合保护剂，以重量计脱脂乳的含量为5％～20％，维生素0.5％～2％。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所保藏的微藻藻种选自小球藻、葡萄藻、小环藻、微绿球藻、硅藻的任何一种。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：藻种细胞悬液的细胞密度为1.0×10⁸～5.0×10⁹个/mL。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：程序预冻过程采用逐步降温的方式对藻种细胞悬液进行预冻。

5.按照权利要求1或4所述的方法，其特征在于：程序预冻过程进行三级预冻过程，室温～4℃维持4～6小时，4℃以下至-18℃维持4～6小时，-18℃以下至-60℃维持4～6小时。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：藻种收集方法为将处于稳定生长期的藻液通过镜检，确定无杂菌后低温下离心收集藻泥。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：用安瓿管分装藻种细胞悬液，在冷冻设备中采取分级降温进行预冻。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：冻结后的藻种细胞悬液在减压的条件下使水分升华的过程采用冷冻真空干燥操作，冷冻真空干燥在-50℃以下进行。

9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：冷冻真空干燥后的样品熔封在安瓿管中。

10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：采用室温或低温保藏微藻藻种。

11.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的维生素为维生素B、维生素C、维生素E中的一或几种。