CN109182245A - 烟草悬浮细胞的培养方法 - Google Patents

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王树声
刘光亮
张彦
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Abstract

本发明公开了烟草悬浮细胞的培养方法，包括无菌苗及愈伤组织的获得；愈伤组织的继代培养；悬浮细胞体系的建立；悬浮细胞的再培养。本发明的有益效果是建立了烟草悬浮细胞的培养方法，可以快速获得大量悬浮细胞，用于测定烟草代谢组学和细胞生物学等其它相关指标及分析研究。采用本发明制备烟草悬浮细胞，生产周期短、增殖速度快、产量较大、细胞分散性好，操作便捷，利于大规模生产操作。

Description

烟草悬浮细胞的培养方法
技术领域
本发明属于植物技术领域，涉及烟草细胞悬浮培养体系。
背景技术
烟草是管花目茄科烟草属的一年或有限多年生草本植物，是一种重要的经济作物，在社会经济领域和自然科学研究领域扮演着重要的角色，同时又是一种科学研究的模式植物，在植物细胞工程研究领域占有重要地位。目前烟草细胞培养的研究和报道不少，但悬浮细胞液中多为几个细胞粘黏的小细胞团，不利于后续细胞代谢和细胞生物学研究。影响烟草悬浮培养细胞分散性的因素很多，研究发现主要与添加激素的浓度、生长速度和细胞滤筛孔径密切相关。针对烟草悬浮细胞培养的研究还不够完善，因此本发明提供一种烟草悬浮细胞培养的方法，能够在短时间内获得大量烟草悬浮细胞，且细胞间很少粘黏，通过细胞培养技术手段解决烟草细胞资源的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供烟草悬浮细胞的培养方法，本发明的有益效果是能够在短时间内获得大量且分散性较好的烟草悬浮细胞，可为烟草细胞的代谢组学或细胞生物学研究提供充足的原料。
本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
步骤1：无菌苗及愈伤组织的获得；
(1)将烟草种子依次用清水冲洗，用乙醇浸泡，无菌水冲洗，H2O2浸泡，无菌水冲洗，播种于MS固体培养基中；
(2)将无菌幼苗转接到MS固体培养基中培养，获得无菌组培苗；
(3)将无菌幼苗叶片剪成小块，平铺于愈伤组织诱导培养基中，温室内暗培养，长出乳白色愈伤组织；
步骤2：愈伤组织的继代培养；
取长势较好，无褐化的愈伤组织转接到新的相同培养基中，2周转接一次，保证愈伤组织的营养含量及无菌环境，继代3代后，得到分散性较好且松脆的愈伤组织；
步骤3：悬浮细胞体系的建立；
取愈伤组织碾碎，接种到悬浮细胞液体培养基，培养1周，保证装悬浮细胞液体培养基的容器的溶氧和通气充分；
步骤4：悬浮细胞的再培养；
将上层的1/3体积悬浮细胞液转移到无菌空三角瓶中，添加2/3体积的悬浮细胞液体培养基继续振荡培养，3天后采用同样的方法再转接一次，7-8天后采用同样的方法再转接一次，将悬浮细胞经筛网过滤后接种到新鲜悬浮细胞液体培养基中继续振荡培养，用同样的方法连续培养3代后，可获得稳定且分散性较好的悬浮细胞，建立稳定的烟草细胞悬浮培养体系。
进一步，步骤(1)中(1)将烟草种子用清水冲洗数次，用75％乙醇浸泡30秒，无菌水冲洗3次，15％H2O2浸泡15min，无菌水冲洗5次，播种于MS培养基中，所有操作均在超净工作台中操作；
(2)将无菌幼苗转接到MS固体培养基中培养，4周后获得无菌组培苗；
(3)在超净工作台中，将无菌幼苗叶片剪成5mm*5mm小块，平铺于MS固体培养基中，MS固体培养基含激素NAA，6BA，2,4-D，温室内26±2℃暗培养4周，长出乳白色愈伤组织。
进一步，步骤(1)中培养条件为26±2℃，光照强度1000-2000lux，16h光照，8h黑暗，湿度30％-60％。
进一步，步骤(2)中愈伤组织诱导培养基最优生长条件为MS固体培养基+NAA2.72mg/L，6-BA 0.85mg/L，2,4-D 0.34mg/L。
进一步，步骤(3)中悬浮细胞液体培养基为MS液体培养基+NAA 2.72mg/L，6-BA0.85mg/L，2,4-D 0.34mg/L，pH值为5.8，采用150ml三角烧瓶装液30-50ml，液体培养基的容量介于1/5--1/3，保证容器的溶氧和通气充分，摇床转速为110-130r/min，温度26±2℃，采用透气封瓶膜封口，适宜细胞生长。
进一步，步骤(4)中细胞悬浮培养温度为26±2℃，30g/L蔗糖为碳源，振荡转速120r/min，初始培养基pH5.8。
附图说明
图1是无菌苗培养；
图2是初代烟草愈伤组织；
图3是继代后的愈伤组织；
图4是细胞悬浮培养；
图5是在显微镜(40倍)下的细胞；
图6是悬浮细胞生长曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明方法如下：
1无菌苗及愈伤组织的获得
(1)将烟草种子用清水冲洗数次，用75％乙醇浸泡30秒，无菌水冲洗3次，15％H2O2浸泡15min，无菌水冲洗5次，播种于MS固体培养基中，所有操作均在超净工作台中操作。培养条件为26±2℃，光照强度1000-2000lux，16h光照，8h黑暗，湿度30％-60％。
(2)将无菌幼苗转接到MS固体培养基中培养，4周后获得无菌组培苗。
(3)在超净工作台中，将无菌幼苗叶片剪成5mm*5mm小块，平铺于愈伤组织诱导培养基中(MS固体培养基+NAA 2.72mg/L，6-BA 0.85mg/L，2,4-D 0.34mg/L)，温室内26±2℃暗培养4周，长出乳白色愈伤组织。
(4)取长势较好，无褐化的愈伤组织转接到新的相同培养基中，2周转接一次，保证愈伤组织的营养含量及无菌环境。继代3代后，可得到脆散型的愈伤组织。
3悬浮细胞体系的建立
取1-3g左右愈伤组织碾碎，接种到悬浮细胞液体培养基(MS液体培养基+NAA2.72mg/L，6-BA 0.85mg/L，2,4-D 0.34mg/L)，pH值为5.8。采用150ml三角烧瓶装液30-50ml，液体培养基的容量介于1/5--1/3，保证容器的溶氧和通气充分，摇床转速为110-130r/min，温度26±2℃，采用透气封瓶膜封口，适宜细胞生长。
4悬浮细胞的再培养
将上层的1/3体积悬浮细胞液转移到无菌空三角瓶中继续振荡培养，添加2/3体积的悬浮细胞液体培养基继续振荡培养，3天后采用同样的方法再转接一次，7天后将悬浮细胞经200μm筛网过滤后接种到新鲜培养基中继续振荡培养，用同样的方法连续培养3代后(每代培养7天)，直到达到一定数量的均一稳定的细胞悬浮培养体系。细胞悬浮培养温度为26±2℃，30g/L蔗糖为碳源，振荡转速120r/min，初始培养基pH5.8。
本发明的图1是无菌苗培养；图2是初代烟草愈伤组织；图3是继代后的愈伤组织；图4是细胞悬浮培养；图5是在显微镜(40倍)下的细胞；图6是悬浮细胞生长曲线图。
本发明包括烟草无菌苗的获得，愈伤组织的诱导，继代培养，接种，经摇床恒温震荡，黑暗悬浮培养，得到较完善的烟草悬浮细胞培养体系。本发明建立了烟草悬浮细胞的培养方法，可以快速获得大量分散性好的悬浮细胞，用于测定烟草代谢组学和细胞生物学等其它相关指标及分析研究。采用本发明制备烟草悬浮细胞，生产周期短、增殖速度快、产量较大、细胞分散性好，操作便捷，利于大规模生产操作。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.烟草悬浮细胞的培养方法，其特征在于按照以下步骤进行：
步骤1：无菌苗及愈伤组织的获得；
(1)将烟草种子依次用清水冲洗，用乙醇浸泡，无菌水冲洗，H2O2浸泡，无菌水冲洗，播种于MS固体培养基中；
(2)将无菌幼苗转接到MS固体培养基中培养，获得无菌组培苗；
(3)将无菌幼苗叶片剪成小块，平铺于愈伤组织诱导培养基中，温室内暗培养，长出乳白色愈伤组织；
步骤2：愈伤组织的继代培养；
取长势较好，无褐化的愈伤组织转接到新的相同培养基中，2周转接一次，保证愈伤组织的营养含量及无菌环境，继代3代后，得到分散性较好且松脆的愈伤组织；
步骤3：悬浮细胞体系的建立；
取愈伤组织碾碎，接种到悬浮细胞液体培养基，保证装悬浮细胞液体培养基的容器的溶氧和通气充分；
步骤4：悬浮细胞的再培养；
将上层的悬浮细胞液转移到无菌空三角瓶中继续振荡培养，3天后采用同样的方法再转接一次，7-8天后采用同样的方法再转接一次，将悬浮细胞经筛网过滤后接种到新鲜培养基中继续振荡培养，用同样的方法连续培养3代后，可获得稳定且分散性较好的悬浮细胞，建立稳定的烟草细胞悬浮培养体系。
2.按照权利要求1所述烟草悬浮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中(1)将烟草种子用清水冲洗数次，用75％乙醇浸泡30秒，无菌水冲洗3次，15％H2O2浸泡15min，无菌水冲洗5次，播种于MS培养基中，所有操作均在超净工作台中操作；
(2)将无菌幼苗转接到MS固体培养基中培养，4周后获得无菌组培苗；
(3)在超净工作台中，将无菌幼苗叶片剪成5mm*5mm小块，平铺于愈伤组织诱导培养基中(MS固体培养基+NAA2.72mg/L，6-BA0.85mg/L，2,4-D0.34mg/L)，温室内26±2℃暗培养4-5周，长出乳白色愈伤组织。
3.按照权利要求1所述烟草悬浮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(1) 中培养条件为26±2℃，光照强度1000-2000lux，16h光照，8h黑暗，湿度30％-60％。
4.按照权利要求1所述烟草悬浮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中悬浮细胞液体培养基为MS液体培养基+NAA2.72mg/L，6-BA0.85mg/L，2,4-D0.34mg/L。
5.按照权利要求1所述烟草悬浮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中悬浮细胞液体培养基(MS液体培养基+NAA2.72mg/L，6-BA0.85mg/L，2,4-D0.34mg/L)，pH值为5.8，采用150ml三角烧瓶装液30-50ml，液体培养基的容量介于1/5--1/3，保证容器的溶氧和通气充分，摇床转速为110-130r/min，温度26±2℃，采用透气封瓶膜封口，适宜细胞生长。
6.按照权利要求1所述烟草悬浮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(4)中细胞悬浮培养温度为26±2℃，30g/L蔗糖为碳源，振荡转速120r/min，初始培养基pH5.8。
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