KR20190143698A - 고효율 오가노이드 배양 디바이스 및 배양 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배양액을 저장하는 하나 이상의 제1챔버; 오가노이드를 배양하는 하나 이상의 제2챔버; 및 인접하는 챔버를 상호 연결하는 채널;을 포함하는 오가노이드 배양 디바이스 를 제공한다.

Description

고효율 오가노이드 배양 디바이스 및 배양 시스템{A HIGHLY EFFICIENT ORGANOID CULTURE DEVICE AND SYSTEM}

본 발명은 오가노이드를 안정적이고 효율적으로 배양할 수 있는 신규한 형태의 배양 플랫폼에 관한 것이다.

조직 특이적 오가노이드 배양 기술은 현재 줄기세포 연구에서 가장 각광을 받고 있는 최첨단 분야로서 난치성 질환 모델, 환자 맞춤형 약물 스크리닝 플랫폼, 신약 개발을 위한 체외 모델 등 재생의학 및 신약 연구 분야에서 활용성이 무한하게 확장될 수 있다.

미세유체 디바이스를 이용하여 세포를 배양하는 기술은 매크로 스케일 배양과 달리 세포에 적합한 미세한 환경을 제공하고 주변 환경에 예민하게 반응하는 세포들의 배양 조건을 정밀하게 조절하는 기술로 최근 세포조직공학 분야에서 각각 받고 있다.

하지만 동적 배양(dynamic culture)은 정적 배양(static culture)과 달리 유체의 흐름이 필요하므로 시린지 펌프나 유압 펌프와 같은 복잡한 설비, 및 숙련자가 요구된다.

기존의 오가노이드 연구에서 배양액에 흐름을 주기 위해 사용한 방법으로는 배양접시(culture dish)를 궤도형 쉐이커(orbital shaker)에 탑재하거나 스피너 플라스크(spinner flask)와 같은 바이오리액터를 이용하였으나, 각 오가노이드에 제공되는 유체의 흐름이 달라 오가노이드 연구에서 가장 큰 문제점으로 지적되는 극심한 개체 차이(batch-to-batch variation)를 야기할 수 있다.

특히, 기존의 오가노이드 배양 기술은 균일한 오가노이드 배양, 높은 분화능 및 기능성을 가지는 오가노이드 형성, 대량 생산에 있어서 여러가지 문제점이 있다.

본 발명자들은 실험실에서 흔히 사용되는 교반 장치를 이용해 별도의 설비 없이 유체의 흐름을 생성할 수 있는 미세유체 디바이스를 개발하고, 오가노이드의 생존능, 분화능 및 기능성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 별도의 부대시설이 불필요할 뿐만 아니라, 정밀하게 배양 환경을 정밀하게 조절할 수 있는 미세유체 디바이스를 도출하고, 이를 이용한 고효율의 오가노이드 배양 플랫폼을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 배양액을 저장하는 하나 이상의 제1챔버; 오가노이드를 배양하는 하나 이상의 제2챔버; 및 인접하는 챔버를 상호 연결하는 채널;을 포함하는 오가노이드 배양 디바이스가 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 제1챔버 및 제2챔버는 상호 인접할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 제2챔버의 높이가 상기 제1챔버 보다 낮을 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 제2챔버의 부피가 상기 제1챔버 보다 작을 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 제1챔버 및 제2챔버는 5.0 내지 15.0mm 직경의 원통형일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 디바이스는 상기 제2챔버의 덮개를 더 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 채널의 너비는 0.6 내지 1.0mm일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 채널의 높이는 0.1 내지 0.5mm일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 채널은 상기 --챔버의 부피에 따라 하나 이상 적층될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 오가노이드는 뇌, 안배(optic cup), 신장, 간, 췌장, 신경관, 위장, 대장, 전립선, 유방, 심장, 침샘(salivary gland), 자궁내막(endometrium), 젖샘(mammary gland), 갑상선, 혀, 및 폐 오가노이드로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 배양용 디바이스; 진동기(shaker); 및 상기 채널을 통해 공유되는 배양액;을 포함하는 오가노이드 배양 시스템이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 디바이스는 상기 진동기에 의해 요동 운동(swing motion)할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 배양 시스템을 이용하여 오가노이드를 배양하는 방법이 제공된다.

본 발명의 배양 시스템은 고효율로 고기능성 오가노이드 배양을 가능하게 하여 다양한 난치성 질환 모델 구축에 활용될 수 있다.

본 발명의 배양 시스템을 기반으로 조직 특이적 오가노이드를 균일하게 대량 배양하여 약물 스크리닝 및 신약 개발 과정에 활용한다면 신약 개발 성공률을 크게 증진시킬 수 있고 신약 개발에 소요되는 비용을 현저히 절감할 수 있다.

본 발명의 배양 시스템은 다양한 형태와 크기를 가지는 다른 유형의 오가노이드 배양에 적합하도록 형태 및 규격을 달리할 수 있으므로 범용적인 기초연구에 활용 가능하며 범용성으로 인해 상업성 및 제품성이 우수하다.

본 발명의 배양 시스템은 오가노이드 분화능, 생존능, 기능성을 증진시키고 대량 생산을 가능하게 하므로 차세대 세포치료제 분야를 선도할 수 있는 원천기술 개발에 기여할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 배양 디바이스를 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 오가노이드 배양 디바이스를 도식화한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 오가노이드 배양 시스템의 작동 원리를 도식화한 것이다.
도 4는 qPCR 분석을 통해 배양 시스템에 따른 유전자 발현 차이를 비교 분석한 것이다.
도 5는 배양 시스템에 따른 간 오가노이드의 신진대사 효율을 비교 분석한 것이다.
도 6 내지 8은 배양 시스템에 따른 간 오가노이드의 유전자 발현 및 약물 반응성을 비교 분석한 것이다.
도 9는 배양 시스템에 따른 뇌 오가노이드의 생존 및 증식을 비교 분석한 것이다.
도 10은 배양 시스템에 따른 뇌 오가노이드의 세포 사멸 정도 및 산소 농도를 비교 분석한 것이다.
도 11은 배양 시스템에 따른 뇌 오가노이드의 영양분 공급 및 노폐물 교환량을 비교 분석한 것이다.
도 12는 배양 시스템에 따른 뇌 오가노이드의 신경세포 분화 및 분포를 비교 분석한 것이다.
도 13은 배양 시스템에 따른 뇌 오가노이드의 피질층 마커 발현량을 비교 분석한 것이다.
도 14는 배양 시스템에 따른 뇌 오가노이드의 전기생리학적 기능성을 비교 분석한 것이다.
도 15는 배양 시스템에 따른 뇌 오가노이드의 구조 및 크기를 비교 분석한 것이다.
도 16는 시뮬레이션을 통해 배양 시스템에 따른 배양 환경을 비교 분석한 것이다.
도 17는 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티웰 오가노이드 공배양 시스템을 도식한 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티웰 오가노이드 공배양 시스템을 통한 배양 결과를 관찰한 결과이다.
도 19 및 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티웰 오가노이드 공배양 시스템을 실제 활용한 사례이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 배양액을 저장하는 하나 이상의 제1챔버(101); 오가노이드를 배양하는 하나 이상의 제2챔버(102); 및 인접하는 챔버를 상호 연결하는 채널(103);을 포함하는 오가노이드 배양 디바이스(100)가 제공된다.

상기 “오가노이드(organoid)”는 조직 또는 전분화능줄기세포에서 유래된 세포를 3D 형태로 배양하여 인공장기와 같은 형태로 제작한 초소형 생체기관을 의미한다.

상기 오가노이드는 줄기세포에서 발생하고 생체 내 상태와 유사한 방식으로 자가-조직화(또는 자가-패턴화)하는 장기 특이적 세포를 포함하는 삼차원 조직 유사체로서 제한된 요소(Ex. growth factor) 패터닝에 의해 특정 조직으로 발달할 수 있다.

상기 오가노이드는 세포의 본래 생리학적 특성을 가지며, 세포 혼합물(한정된 세포 유형뿐만 아니라 잔존 줄기세포, 근접 생리학적 니치(physiological niche)를 모두 포함) 원래의 상태를 모방하는 해부학적 구조를 가질 수 있다.

상기 오가노이드는 3차원 배양 방법을 통해 세포와 세포의 기능이 더욱 잘 배열되고, 기능성을 가지는 기관 같은 형태와 조직 특이적 기능을 가질 수 있다.

상기 오가노이드는 뇌, 안배(optic cup), 신장, 간, 췌장, 신경관, 위장, 대장, 전립선, 유방, 심장, 침샘(salivary gland), 자궁내막(endometrium), 젖샘(mammary gland), 갑상선, 혀, 및 폐 오가노이드로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배양 디바이스(100)는 오가노이드를 효율적으로 배양하는 구조를 포함하며, 구체적으로 상기 배양액을 저장하는 하나 이상의 제1챔버(101), 상기 오가노이드를 배양하는 하나 이상의 제2챔버(102), 및 인접하는 챔버를 상호 연결하는 채널(103)을 포함할 수 있다.

상기 제1챔버(101)는 배양액을 저장하고, 상기 제2챔버(102)는 저장된 배양액을 통해 오가노이드를 배양하며, 상기 인접하는 챔버는 채널(103)을 통해 상호 연결되어 전체적으로 배양액을 공유할 수 있다.

상기 챔버는 오가노아드 배양을 위한 일정한 공간 또는 배양액을 수용하는 저장 공간을 제공할 수 있고, 바람직하게는 상부가 개방될 수 있다.

상기 챔버는 유리 또는 합성 수지로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 오가노이드 또는 배양액에 영향을 미치지 않는 다양한 소재로 제작될 수 있다.

상기 챔버는 투명, 반투명 또는 불투명 재질로 제작될 수 있으며, 배양 환경이나 활용성을 고려하여 특성을 달리할 수 있다.

상기 배양 디바이스(100)는 상기 챔버를 통해 상기 오가노이드를 효율적으로 배양할 수 있다.

상기 배양 디바이스(100)는 특이적인 구조를 통해 챔버 내의 배양액을 완만한 흐름으로 교환할 수 있으며, 배양액의 흐름에 의한 과도한 자극이나 스트레스를 발생시키지 않고, 일정한 형태 및 크기로 상기 오가노이드를 배양할 수 있다.

상기 배양 디바이스(100)는 상기 챔버를 상호 연결하는 채널(103)을 통해 배양액이 공유되어 있는 구조로서, 일정한 진동에 의해 배양액에 흐름(flow)을 제공할 수 있으면 족하고, 크기, 구조 및 형태가 특별히 제한되는 것은 아니다.

다만, 배양하고자 하는 오가노이드의 종류나 특성에 따라 요구되는 배양액이나 산소의 양이 달라질 수 있다.

따라서, 오가노이드의 배양 환경을 고려하여 챔버의 크기, 직경 등을 달리할 수 있으며 다량의 배양액이 필요한 경우라면 상기 제1챔버(101)의 부피나 개수를 증가시킴으로써 배양액의 공급을 원활하게 할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 제1챔버(101) 및 제2챔버(102)의 형태 및 크기를 동일하게 할 수도 있으며, 오가노이드의 종류나 양을 고려하여 제1챔버(101) 및 제2챔버(102)의 직경, 부피, 형태 등을 개별적으로 최적화할 수도 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제2챔버(102)의 높이가 상기 제1챔버(101) 보다 낮을 수 있다(도 1).

상기 제1챔버(101) 및 제2챔버(102)는 높이가 상이할 수 있고, 인접하는 챔버는 채널(103)로 연결되어 있어 배양액을 공유할 수 있다.

구체적으로, 상기 제2챔버(102)의 높이가 상기 제1챔버(101) 보다 낮을 수 있으며, 각각의 제2챔버(102)의 내부 공간에 상기 오가노이드가 안정적으로 배양될 수 있다.

상기 제1챔버(101)는 배양액을 저장하고 있으나, 제2챔버(102) 보다 높이가 높으므로 디바이스의 진동이나 흔들림에 의한 배양액의 넘침(overflow)을 방지할 수 있고, 상기 제1챔버(101)와 제2챔버(102)의 배양액 수위가 다르더라도 상기 덮개(104)를 통해 제2챔버(102)의 수위를 일정하게 유지시킬 수도 있다.

상기 제1챔버(101) 및 제2챔버(102)의 배열이나 배치는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 제1챔버(101) 및 제2챔버(102)가 상호 인접할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 제1챔버(101) 및 제2챔버(102)는 상호 교차하여 배치될 수 있고, 배양액이 고르게 분포 및 공유될 수 있다.

또한, 상기 제1챔버(101) 및 제2챔버(102)는 1열로 상호 교차하여 배치될 수 있고, 배양 규모나 용도를 고려하여 다열(多列)로 구성될 수도 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 제2챔버(102)의 부피가 상기 제1챔버(101) 보다 작을 수 있다(도 2).

상기 배양 디바이스(100)는 진동이나 일정한 움직임에 의해 배양액에 흐름(flow)을 제공할 수 있으면 족하므로 상기 제2챔버(102)에 배양액이 원활하게 공급될 수 있도록 상기 제1챔버(101)의 부피를 증가시킬 수 있다.

도 2를 참조하면, 상기 배양 디바이스(100)의 제1챔버(101)는 챔버의 직경 및 부피가 크므로 배양액 상단에 더 큰 압력(기압)이 인가되며, 상기 배양 디바이스(100)의 운동에 의해 디바이스 양 말단에 존재하는 제1챔버(101)간 배양액의 흐름이 더욱 촉진되므로 상기 제2챔버(102)에 배양액이 원활하게 공급될 수 있다.

한편, 상기 오가노이드는 3차원 배양을 통해 효율적으로 배양될 수 있으며, 매트리겔 등 당해 기술분야에서 널리 활용되는 하이드로겔을 통해 효과적으로 배양될 수 있다.

상기 “3차원 배양(three-dimensional culture)”은 세포가 평편한 플레이트의 2차원적인 환경에 적응하는 과정을 배제하여 실제 조직과 유사한 환경을 제공하며, 생체 내 세포 성장, 분화 및 기능을 유도할 수 있다.

상기 3차원 배양은 in vitro 환경에서 실제 in vivo 조직 환경을 효과적으로 모방하며 결과의 확실성, 실험의 안정성 및 타당성을 향상시킬 수 있다.

상기 “하이드로겔(hydrogel)”은 졸-겔 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하고 다공성 구조를 이루는 물질로서, 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창함으로써 형성될 수 있다.

상기 “매트리겔(matrigel)”은 EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스의 육종세포에서 추출된 단백질 복합체로서(BD Bioscience社의 제품명), 라미닌(lamonin), 콜라겐(collagen), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)과 같은 세포외 매트릭스와 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 상피세포 성장인자(epidermal growth factor; EGF), 인슐린 성장인자(insulin-like growth factor; IGF), 형질전환 성장인자-베타(transforming growth factor-beta; TGF-β또는 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor; PDGF)를 포함할 수 있다.

상기 제1챔버(101) 및 제2챔버(102)의 형태는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 원통형일 수 있으며, 직경은 5.0 내지 15.0mm일 수 있다.

상기 오가노이드는 특성에 따라 배양 특성이나 속도가 상이하므로 배양 환경을 고려하여 챔버의 형태나 부피를 달리할 수 있다.

상기 디바이스는 상기 제2챔버(102)의 덮개(104)를 더 포함할 수 있다. 상기 제2챔버(102)는 상기 제1챔버(101)보다 높이가 낮아 상기 디바이스의 진동에 의해 배양액이 외부로 유출될 수 있으므로, 상기 덮개(104)를 통해 상단이 폐쇄될 수 있다.

상기 덮개(104)의 형태나 크기는 특별히 제한되지 않으며, 상기 제2챔버(102)를 개별적으로 폐쇄시키는 캡(cap) 형태이거나, 인접하는 제2챔버(102)를 동시에 폐쇄 가능한 넓은 면적의 덮개 유리(cover glass) 형태일 수도 있다.

상기 채널(103)은 상기 챔버 간 배양액의 이동을 가능하게 할 수 있다. 상기 채널(103)의 단면적 또는 형태는 특별히 제한되지 않으며, 오가노이드의 배양 특성을 고려하여 달리할 수 있으나, 바람직하게 상기 채널(103)의 너비는 0.6 내지 1.0mm일 수 있고, 높이는 0.1 내지 0.5mm일 수 있다.

또한, 상기 채널(103)은 상기 챔버의 부피에 따라 하나 이상 적층될 수 있다. 예컨대, 상기 챔버의 부피가 크고 배양하고자 하는 오가노이드의 부피가 큰 경우 상기 채널(103)을 적층함으로써 배양액의 이동을 촉진할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 배양 디바이스(100); 진동기(shaker); 및 상기 채널(103)을 통해 공유되는 배양액;을 포함하는 오가노이드 배양 시스템이 제공된다.

상기 “배양액(culture medium)”은 세포에 대한 배양매체인 동시에 영양분이나 산소 등의 전송매체이다. 상기 배양액은 세포에게 필요한 영양분이나 산소 등을 공급하고 노폐물을 제거할 수 있다.

상기 “진동기(shaker)”는 상기 배양 디바이스(100)를 일정 주기로 운동시킴으로써 상기 배양액에 동적 흐름(flow)을 부여할 수 있다.

상기 진동기는 상기 디바이스의 위치를 변화시켜 상기 배양액에 동적 흐름을 부여할 수 있으면 족하고, 운동의 범위나 형태가 특별히 제한되는 것은 아니다.

도 3을 참조하면, 상기 디바이스는 상기 진동기에 의해 요동 운동(swing motion)할 수 있다.

상기 “요동 운동(swing motion)”은 기계 장치의 작동 형태를 의미하는 것으로 구동 부분이 축을 중심으로 회전하는 것이 아니라 일정 구간을 왕복하는 운동을 의미한다.

상기 디바이스는 일정한 주기로 요동 운동하므로 상기 디바이스 내 배양액이 챔버 내에서 일정 주기로 왕복 운동할 수 있으며, 상기 오가노이드가 안정적으로 배양할 수 있는 환경이 구축될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 배양 시스템을 이용하여 오가노이드를 배양하는 방법이 제공된다.

상기 배양은 적합한 조건에서 세포를 유지 및 성장시키는 과정을 의미하며, 적합한 조건은 예컨대, 세포가 유지되는 온도, 영양소 가용성, 대기 CO₂ 함량 및 세포 밀도를 의미할 수 있다.

서로 다른 유형의 세포를 유지, 증식, 확대 및 분화 시키기 위한 적절한 배양 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 문서화 되어있다. 상기 오가노이드 형성에 적합한 조건은 세포 분화 및 다세포 구조의 형성을 용이하게 하거나 허용하는 조건일 수 있다.

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

실험예 1 : 동적 배양 시스템 구축

제1챔버 및 제2챔버로 구성된 배양 디바이스를 구현하였다. 오가노이드의 특성에 따라 길이, 지름 및 너비뿐 아니라 챔버 수가 다른 디자인을 선택적으로 구현하였다.

오가노이드의 사이즈를 고려하여 제1챔버의 지름(D)를 증감시키고, 필요한 유체의 흐름의 강도에 따라 채널의 높이(H) 및 적층 채널 개수(N)를 조절하여 유속의 범위를 제어하였다.

튜브 관으로 연결된 시린지 펌프를 통해 유체의 흐름을 형성하는 종래의 칩내 동적 배양 시스템은 추가적인 부대 시설이 필수적으로 요구될 뿐만 아니라 칩과 시린지를 1:1로 연결해야 하므로 실험 샘플 수에 한계가 있으며, 활용적인 측면에서 숙련도가 요구되므로 편의성이 미흡하다.

본 발명의 오가노이드 배양 시스템은 진동기를 이용하여 유체 흐름을 간단하게 형성할 수 있으며 사용성 및 확장성이 우수하다.

본 발명의 오가노이드 배양 시스템은 진동기의 속도 및 각도에 따라 다양한 유체의 흐름을 제공할 수 있으며, 각각의 오가노이드가 배양되는 챔버는 배양액을 공유하므로 다종의 오가노이드를 공배양 하여 서로 간의 영향을 확인할 수 있다.

실험예 2 : 유전자 발현 및 약물 반응성 비교

qPCR 분석을 통해 배양 조건에 따른 간 오가노이드의 유전자 발현을 정량하였다.

유도간세포(H) 또는 유도간세포와 인간혈관내피세포(HUVEC)를 (HE) 3차원 하이드로겔에 캡슐화(encapsulation)하고, static(S) 또는 디바이스 내에서 flow(F)를 주며 배양하였다.

도 4를 참조하면, 혈관내피세포와 공배양하고, flow를 제공한 그룹에서 간 특이적 유전자 마커 발현이 가장 높은 것으로 확인되었다.

Flow 그룹(iH-F, iHE-F)의 경우 세포사멸의 대표적 마커인 CAPS3(caspase-3)의 발현이 static 그룹(iH-S, iHE-S)에 비해 감소하였다.

또한, 세포 간 상호작용에 관련된 마커인 ECAD(E-cadherin)의 경우, iHE-F 그룹에서 가장 높은 수준으로 발현되었다.

실험예 3 : 신진대사 효율(metabolism efficiency) 비교

다양한 조건(혈관내피세포와의 공배양, 디바이스 내 유속 제공)에서 간 오가노이드의 젖산(lactate) 생산량 및 포도당(glucose) 소비량을 정량하였다.

도 5를 참조하면, 디바이스를 이용하여 동적 배양한 그룹(iH-F, iHE-F)의 경우 정적 배양한 그룹(iH-S, iHE-S)에 비해 젖산/포도당 농도 비율이 감소하였다.

상기 결과는 디바이스 내 동적 조건이 간 오가노이드의 신진대사 효율을 증가시킴을 시사한다.

실험예 4 : 유전자 발현 및 약물 반응성 비교

RNA 서열분석(RNA-sequencing)을 통해 전사체 분석

iH-S 그룹과 비교하였을 때 발현의 차이가 2배 이상 나는 유전자들을 heat-map으로 표시하였다.

도 6A를 참조하면, iHE-S와 iHE-F 그룹은 iH-S과 달리 서로 유사한 유전자 발현 패턴을 나타내었다.

GO(gene ontology) 방법을 통해 발현이 2배 이상 증가된 유전자를 분석한 결과, metabolic/biosynthetic activity ALC molecular binding 관련 유전자의 발현이 증가하였으며(도 6B), 특히, drug metabolic process, xenobiotic metabolic process, response to drugs와 관련된 유전자의 발현이 증가하였다(도 6C).

iHE-F 그룹에서 대부분의 GO term들이 가장 높은 수준으로 증가하였으며, 상기 결과는 본 발명의 배양 시스템 내의 flow 배양 조건에서 혈관내피세포와 공배양된 간 오가노이드가 약물 반응성 및 독성 평가에 더욱 용이함을 시사한다.

약물 독성 평가 실험

간독성이 있다고 알려진 APAP(acetaminophen) 약물과 HE 그룹을 48시간 동안 배양을 한 후, Live/Dead 분석을 통해 간독성 평가를 수행한 결과, flow 그룹에서 더 민감한 독성이 관찰되었다(도 7).

즉, iHE-F 그룹이 iHE-S 그룹보다 동일한 약물농도에서 더 민감한 반응을 나타내므로, 간독성 평가에 더욱 유용하게 활용될 수 있다.

약물 반응성 비교 실험

APAP 약물의 간독성 평가를 수행하였다. iHE-F 그룹의 간 오가노이드를 다양한 APAP(20 내지 500mM) 농도에서 배양하였을 때, 세포 내 GSH(glutathione) 및 ROS(reactive oxygen species) formation 분포도를 mBCL(monochlorobimane) 및 DHE(dihydroethidium) 분석을 통해 확인하였다.

도 8을 참조하면, 높은 농도에서 mBCL과 DHE의 형광도가 더 높았으며, mBCL은 lipophilic GSH 특이적 프로브로서 GSH과 결합하였을 때 특정 주파수에서 형광을 나타내었다.

상기 결과는 APAP 약물의 농도 증가에 따라 간 오가노이드 세포 내 독성 및 손상이 증가하였음을 의미한다.

실험예 5 : 생존 및 증식 비교

진동기(shaker, rocker)를 이용한 동적 디바이스에서 배양한 인간 유도만능줄기세포 유래의 뇌 오가노이드와 기존 배양 시스템에서 배양된 뇌 오가노이드의 특성을 분석하였다.

3차원 배양 플랫폼에서 30일 간 뇌 오가노이드를 배양한 후 면역염색을 통해 분석하였다.

도 9A를 참조하면, 세포증식 마커인 Ki67 및 신경줄기세포 마커인 nestin 면역염색을 통해 뇌 오가노이드의 증식이 촉진되고 크기 생장과 신경계통으로의 분화가 촉진되었음을 확인하였다.

도 9B를 참조하면, 면역염색 이미지 기반 정량 분석을 진행한 결과 디바이스에서 뇌 오가노이드 배양 시 증식하는 세포가 유의미하게 증가하고, 신경줄기세포의 수도 유의미하게 증가하였다.

도 9C를 참조하면, 기존 배양 시스템에서 배양한 뇌 오가노이드보다 본 발명의 디바이스에서 배양된 뇌 오가노이드의 크기가 현저히 증가하였다.

즉, 신경줄기세포의 수의 증가를 통해 본 발명의 디바이스에서 배양된 뇌 오가노이드 발달 및 크기의 증가가 확인되었다.

실험예 6 : 세포사멸 비교

본 발명의 디바이스에서 배양한 뇌 오가노이드와 기존 배양 시스템에서 배양된 뇌 오가노이드를 30일 간 배양한 후 세포사멸 정도를 비교 분석하였다.

도 10A를 참조하면, 면역염색과 이미지 기반 정량분석을 통해 기존의 배양 시스템과 비교하여 디바이스에서 배양한 뇌 오가노이드에서 세포사멸 마커인 caspase-3(casp3) 염색의 발현이 감소하였다.

도 10B를 참조하면, 산소량의 증가에 따라 형광 발현이 감소하는 나노입자를 통해 뇌 오가노이드 내의 상대적 산소량을 비교 분석한 결과, 본 발명의 디바이스에서 배양한 뇌 오가노이드 내부로 많은 산소가 전달되었다.

상기 결과는 본 발명의 동적 배양 플랫폼은 오가노이드 내부로 산소를 충분히 공급시켜 세포사멸이 줄어들 수 있는 환경을 제공할 수 있음을 시사한다.

실험예 7 : 영양분 공급 및 노폐물 교환 비교 분석

본 발명의 배양 시스템 및 종래 배양 시스템의 영양분 공급 및 노폐물 교환 정도를 비교 분석 하였다.

도 11A를 참조하면, 기존의 멀티웰 플레이트 시스템에서 배양된 뇌 오가노이드와 비교했을 때 본 발명의 디바이스에서 배양된 뇌 오가노이드에서 포도당 소모율이 높은 수준으로 분석되었으며, 이는 뇌 오가노이드의 활발한 대사활동을 의미한다.

도 11B를 참조하면, 발명의 디바이스에서 배양된 뇌 오가노이드의 젖산(L-lactate) 생성률이 감소하였으며, 이는 노폐물 확산이 활발하게 일어남을 의미한다.

도 11C를 참조하면, 뇌 오가노이드의 포도당 소모율 대비 젖산 생성량의 비율을 분석한 결과, 본 발명의 배양 시스템에서 영양분 공급 및 노폐물 교환이 활발하게 촉진되었다.

실험예 8 : 신경세포 분포 비교 분석 및 3차원 이미징 분석

본 발명의 배양 시스템 및 종래 배양 시스템의 뇌 오가노이드의 신경세포 분화 및 분포를 비교 분석 하였다.

도 12A를 참조하면, 본 발명의 디바이스에서 배양된 뇌 오가노이드의 경우 기존 배양 시스템 대비 신경세포 바이오마커인 Tuj1 및 MAP2의 발현이 증가하였으며, 성숙한 세포가 존재하는 층의 두께를 통해 뇌 오가노이드로의 발달이 촉진되었음이 확인되었다.

도 12B를 참조하면, 조직 투명화 기술을 이용하여 신경 분화 정도를 3차원적으로 분석하였다. 3차원 조직 투명화 기술을 통해 뇌 오가노이드를 3차원 구조 전체의 이미징이 용이한 상태로 제작하였다.

바이오마커(Tuj1, MAP2)의 발현량을 분석한 결과, 본 발명의 배양 시스템에서 뇌 오가노이드의 성숙한 신경 세포 분화가 현저히 증가하였다(도 12C).

실험예 9 : 뇌 오가노이드의 피질층 마커 발현 비교 분석

본 발명의 배양 시스템 및 종래 배양 시스템에서 뇌 오가노이드의 피질층 발달을 확인하였다.

도 13A를 참조하면, 본 발명의 배양 시스템에서 대뇌 피질층 VI를 형성하는 TBR1+세포로의 발달이 촉진되고, 뇌이랑(gyrus)과 뇌고랑(sulcus)의 발달이 증가하였다.

도 13B를 참조하면, 뇌실 하 부위(subventricular zone)와 뇌실 부위(ventricular zone)를 이루는 대뇌 피질 상층의 바이오마커인 TBR2의 발현이 증가하였다.

도 13C를 참조하면, 뇌 오가노이드 전반적으로 피질층이 넓게 형성되었으며, 이는 성숙한 뇌 오가노이드로의 발달을 의미한다.

실험예 10 : 전기생리학적 기능성 비교 분석

뇌 오가노이드의 피질층 발달을 확인하기 위해 60일간 배양한 후 패치클램프 분석을 통해 전기생리학적인 기능을 분석하였다.

기존 배양 시스템(도 14A 좌측) 대비 본 발명의 배양 시스템(도 14B 촤측)에서 신경세포 나트륨 채널(sodium channel)의 활성이 더 컸으며 기능성을 지닌 신경세포로 분화가 촉진되었다.

도 14를 참조하면, 활동 전위, 역치값(threshold)의 증가 및 나트륨 전류(sodium current)의 최소값 감소를 통해 기능적으로 매우 성숙한 신경세포로의 분화가 확인되었다(도 14A 우측, 도 14B 우측, 도 14D 및 도 14E).

또한, 본 발명의 배양 시스템의 경우 기존 배양 시스템과 달리 신경세포 시냅스 간 네트워크인 흥분성 시냅스후 전위(excitatory postsynaptic potential; EPSC)가 확인되었다(도 14C).

실험예 11 : 뇌 오가노이드의 구조 분석

60일 간 배양된 뇌 오가노이드의 피질층 발달 및 구조적 분석을 수행하였다.

도 15를 참조하면, 광학현미경을 이용하여 분석한 결과 본 발명의 배양 시스템에서 뇌 오가노이드는 크기가 증가하고 주름진 구조가 외부 표면 뿐 아니라 내부에도 발달하여 실제 뇌의 피질층을 유사하게 모사하였다.

라이트 시트 현미경(light sheet microscopy)을 이용하여 고해상도 3차원 뇌 조직 유사 오가노이드를 분석한 결과, 본 발명의 배양 시스템의 경우 피질층의 주름 구조가 잘 발달하고 전반적인 부피도 증가하여 조직과 유사한 구조 및 크기를 구현하는 뇌 오가노이드가 형성되었다(도 15C 하단 및 도 15D).

실험예 12 : 시뮬레이션을 통한 배양 환경 분석

유체 시뮬레이션을 통하여 유체의 흐름 및 물질의 이동을 예측하였다.

도 16을 참조하면, 유체의 흐름이 있는 동적 배양과 정적 배양 시스템을 물질 이동 측면에서 분석한 결과, 동적 배양의 경우 산소 및 노폐물의 교환을 촉진하므로 크기가 커지면서 중심부가 사멸하는 오가노이드 배양을 개선할 수 있으며, 디자인을 변경함으로써 유체의 흐름 강도를 제어할 수 있다.

실험예 13 : 오가노이드 배양 시스템의 활용

고효율로 많은 수의 오가노이드(32개)를 동시에 배양할 수 있는 시스템을 구축하였다.

96웰 플레이트와 규격을 동일하게 구성하여 플레이트 리더와 같은 범용적인 96웰 기반 분석 시스템에 적용하였다.

도 17을 참조하면, 배양 및 관찰에 중점을 둔 소규모 디바이스와 달리 96웰 기반 디바이스의 경우 정량 분석 기기에 적용하기 위해 각 웰의 바닥면이 미약하게 굴곡져 있어 기기 측정시 오가노이드가 각 웰의 중심에 위치하도록 고안하였다.

유도 간세포 기반 간 오가노이드, 줄기세포 유래의 장 오가노이드 및 위 오가노이드를 본 발명의 배양 시스템을 이용하여 3일 동안 공배양하였다(도 18).

면역염색을 통해 공배양된 각각의 오가노이드가 조직 세포 특이적 마커의 발현을 관찰하였다(ALB=albumin, Ecad=E-cadherin, Lyso=lysozyme, P-pump=proton pump).

유도 간 오가노이드와 성체 줄기세포 유래 장 오가노이드의 공배양을 실시하고, 양 오가노이드 간의 상호작용을 분석하였다.

한편, 담즙산(bile acid)은 간에서 콜레스테롤으로부터 생성되는데, 간에서 형성된 1차 담즙산이 장으로 분비된 후, 장내에 존재하는 장내미생물에 의해 2차 담즙산으로 변형된다. 장에 도달한 담즙산의 대부분이 장간순환(entero-hepatic circulation)에 의하여 간으로 재흡수된다.

담즙산이 정상 수치보다 과다 분비될 경우 장내 존재하는 enterocyte가 인지하여 FGF19(쥐에서는 FGF15)의 유전자 발현이 증가한다.

간세포가 FGF19를 인지하고, 콜레스테롤(Cholesterol)을 담즙산으로 분해함에 있어 가장 중요한 Cytochrome P450 enzyme CYP7A1의 유전자 발현이 억제됨으로써, 담즙산 생성이 감소된다.

도 19를 참조하면, 배양 배지에 chenodeoxycholic acid(CDCA; 소수성 담즙산으로 많은 부분의 담즙산을 차치함)이 존재할 경우, 간 오가노이드만 배양한 그룹에서 같은 부피의 DMSO를 넣어준 대조군과 비교하여 CYP7A1의 발현량의 차이가 나타나지 않았으나, 장 오가노이드와 공배양한 그룹의 경우 CYP7A1의 발현량이 감소하였다.

반면, 담즙산의 적정량 생산을 유지하도록 하는 feedback loop와 관련이 없는 알부민 유전자의 경우, 모든 조건에서 차이가 없었다.

따라서, 본 발명의 배양 시스템을 이용함으로써 간 오가노이드와 장 오가노이드의 공배양에 용이하고, 세포 간 상호작용을 가능하게 할 수 있다.

실험예 13 : 약물 농도 구배가 가능한 배양 시스템 구축 및 독성 시험

도 20을 참조하면, 시린지 펌프(syringe pump)와 혼합 채널(mixing channel)을 본 발명의 배양 디바이스에 연결할 경우, 원하는 약물의 농도 구배가 용이하다.

시린지 펌프를 이용하여 inlet port에는 파란색 용액을, 다른 한쪽에는 주황색 용액을 주입을 할 경우, 혼합 채널에 의해 농도 구배가 형성될 수 있다.

실질적으로는, inlet port에 500 mM APAP가 함유된 배지와 나머지 한쪽 inlet에는 APAP가 함유되어 있지 않은 배지를 주입하였다.

형성된 APAP 약물 농도 구배 하에서 간 오가노이드를 48시간 배양한 결과, 약물이 함유되어 있지 않은 배지에서 배양된 세포(1구역)에서 GSH(glutathione) 및 ROS(reactive oxygen species) 생성이 가장 적었으며, 약물 농도가 증가함에 따라 간 오가노이드 내 세포 독성이 증가하였다.

즉, 본 발명의 배양 시스템을 활용함으로써 약물 농도에 따른 오가노이드 독성 시험을 정교하고 신속하게 수행할 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

100 : 배양 디바이스
101 : 제1챔버
102 : 제2챔버
103 : 채널
104 : 덮개

Claims (13)

1. 배양액을 저장하는 하나 이상의 제1챔버;
   오가노이드를 배양하는 하나 이상의 제2챔버; 및
   인접하는 챔버를 상호 연결하는 채널;을 포함하는 오가노이드 배양 디바이스.
2. 제1항에 있어서,
   상기 제1챔버 및 제2챔버는 상호 인접하는 오가노이드 배양 디바이스.
3. 제1항에 있어서,
   상기 제2챔버의 높이가 상기 제1챔버 보다 낮은 오가노이드 배양 디바이스.
4. 제1항에 있어서,
   상기 제2챔버의 부피가 상기 제1챔버 보다 작은 오가노이드 배양 디바이스.
5. 제1항에 있어서,
   상기 제1챔버 및 제2챔버는 5.0 내지 15.0mm 직경의 원통형인 오가노이드 배양 디바이스.
6. 제1항에 있어서,
   상기 제2챔버의 덮개를 더 포함하는 오가노이드 배양 디바이스.
7. 제1항에 있어서,
   상기 채널의 너비는 0.6 내지 1.0mm인 오가노이드 배양 디바이스.
8. 제1항에 있어서,
   상기 채널의 높이는 0.1 내지 0.5mm인 오가노이드 배양 디바이스.
9. 제1항에 있어서,
   상기 채널은 상기 챔버의 부피에 따라 하나 이상 적층되는 오가노이드 배양 디바이스.
10. 제1항에 있어서,
    상기 오가노이드는 뇌, 안배(optic cup), 신장, 간, 췌장, 신경관, 위장, 대장, 전립선, 유방, 심장, 침샘(salivary gland), 자궁내막(endometrium), 젖샘(mammary gland), 갑상선, 혀, 및 폐 오가노이드로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 오가노이드 배양 디바이스.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 디바이스;
    진동기(shaker); 및
    상기 채널을 통해 공유되는 배양액;을 포함하는 오가노이드 배양 시스템.
12. 제11항에 있어서,
    상기 디바이스는 상기 진동기에 의해 요동 운동(swing motion)하는 오가노이드 배양 시스템.
13. 제11항의 배양 시스템을 이용하여 오가노이드를 배양하는 방법.

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