CN108474140A - 大规模细胞生产系统 - Google Patents

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Abstract

公开了在大规模水平下培养和生产细胞的方法。具体地，提供了生产系统和装置，以及使用该系统和装置用于在由藻酸盐聚合物制成的中空纤维中培养和生产细胞的方法。

Description

大规模细胞生产系统
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年11月25日提交的第62/260,109号美国临时专利申请的优先权，其公开内容通过引用整体明确并入本文。
背景技术
本发明一般涉及在由藻酸盐聚合物制成的中空水凝胶纤维中培养和生产细胞。更具体地，本公开内容涉及用于以各种规模，特别是在大规模水平下培养细胞的生产系统和装置，所述细胞可用于各种应用。
哺乳动物细胞具有许多应用。干细胞，如人多能干细胞(hPSC)，包括人胚胎干细胞(hESC)和人诱导多能干细胞(iPSC)，及其子代(即，从干细胞分化的细胞)可用于治疗退行性疾病、损伤和癌症。它们也可以用来构造人造组织和器官。此外，干细胞及其子代可用于建模疾病、筛选药物和测试化学物质的功效和毒性。哺乳动物细胞也广泛用于在实验室和工业中表达重组蛋白和病毒。许多这些蛋白质和病毒在临床中使用。这些应用需要大量高质量的细胞。例如，分别需要105个存活的多巴胺能(DA)神经元，约109个心肌细胞或约109个β细胞来治疗患有帕金森氏病(PD)、心肌梗塞(MI)或1型糖尿病的患者。此外，最初需要更多的细胞，因为移植细胞的体外细胞培养产量和随后的体内存活通常都非常低。作为后者的实例，据报导，移植后几个月，在啮齿动物模型中仅有约6％的移植的多巴胺能神经元或约1％的注射的心肌细胞存活。此外，还有大量患有退行性疾病或器官衰竭的患者群体，仅在美国就包括100万以上的PD患者，100-250万的1型糖尿病患者，和约800万的MI患者。大量细胞对于组织工程等应用也是必需的，其中例如，人造的人肝脏或心脏分别需要约1010个肝细胞或心肌细胞。此外，一次可能需要约1010个细胞来筛选百万个化合物文库，并且组合化学、非编码RNA和复杂信号转导和转录网络的研究的进展产生了可以针对许多目标进行筛选的大型文库。生产治疗性生物制剂如单克隆抗体(mAb)、酶和病毒颗粒也需要大量的哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)和人胚肾293细胞(HEK293)。
目前，几乎没有能够成本有效地生产干细胞及其子代和原代细胞的方法，尤其是以大规模生产。其中细胞在2D表面上培养的最广泛使用的2D细胞培养系统受限于其低产量、异质性、可扩展性和再现性。例如，每平方厘米表面积只能培养大约50,000个心肌细胞。
由于上述缺点，正在广泛研究三维(3D)悬浮细胞培养系统，例如旋转瓶和搅拌罐生物反应器以扩大生产。然而，悬浮培养物中的细胞球状体经常聚集形成大的细胞团块。众所周知，营养物质、氧和生长因子向位于直径大于500μm的团块中心的细胞(图10A)的运输以及代谢废物从位于直径大于500μm的团块中心的细胞(图10A)的运输变得不足，导致细胞增殖缓慢、细胞凋亡和不受控制的分化。当搅拌或振荡培养物减少细胞聚集时，它们也产生流体动力学应力，其不利地影响细胞活力、增殖和表型。培养物中的高细胞密度也促进细胞群集。考虑到所有这些因素，在目前的悬浮培养研究中，细胞通常以低密度(例如约3x105个细胞/mL)接种并以70至120转/分钟(rpm)的速度搅拌。即使在这些优化的条件下，细胞生长缓慢、显著的细胞死亡、表型改变、基因组突变和低体积产量也是常见的。例如，已经显示hPSC通常每4天扩增4倍以产生约2.0x106个细胞/mL。这些细胞仅占据低于0.4％的生物反应器体积。低产量导致大规模生产细胞面临经济和技术挑战。
基于上述内容，本领域需要一种稳健的细胞培养系统，其能够以各种规模，特别是以大规模成本有效地生产不同类型的细胞。该系统将在研究实验室和工业中都有用。
发明内容
本发明通常涉及在由藻酸盐聚合物制成的中空水凝胶纤维中培养和生产哺乳动物细胞。更具体地，本发明涉及能够以各种规模，特别是在大规模水平上生产细胞的培养系统和装置，以及使用该系统和装置用于在由藻酸盐聚合物制成的中空水凝胶纤维中培养和生产细胞的方法。
已经发现，使用中空水凝胶纤维作为细胞培养体系促进了原始细胞聚集，确保向细胞的有效质量运输并消除细胞的流体动力学应力，允许培养具有高活力、高细胞生长速率和高体积产量(例如，每毫升体积产生高达5.0x108个细胞)的细胞。这些优点显著降低了生物反应器体积、生产时间和成本。因此，这种新的培养系统具有改变细胞生产的潜力。
一方面，本发明涉及以各种规模生产细胞的方法，所述方法包括：将包含细胞的细胞溶液悬浮在藻酸盐水凝胶纤维的中空空间中；和将包含所述细胞的中空纤维悬浮在细胞培养基中；和培养所述细胞。
另一方面，本发明涉及以各种规模生产细胞的方法，所述方法包括：将细胞溶液和藻酸盐溶液挤出到细胞相容的溶液中，所述细胞相容的溶液使藻酸盐聚合物溶液内的藻酸盐聚合物交联，以形成中空藻酸盐水凝胶纤维；将包含细胞的中空纤维悬浮在细胞培养基中或细胞相容的缓冲液中；和培养所述细胞。
另一方面，本发明涉及用于培养细胞的系统。所述系统包括：壳体，其包括第一入口、第二入口、芯通道、壳通道和出口，所述第一入口能被操作地用于将细胞溶液引入到所述芯通道，所述第二入口能被操作地用于将藻酸盐溶液引入到所述壳通道，其中所述壳通道与芯通道流体接触，以允许所述细胞溶液和所述藻酸盐溶液之间的接触；和细胞培养容器，其在出口处与所述壳体流体接触，其中所述细胞培养容器包含细胞相容的缓冲液。
根据本发明，已经发现令人惊讶地允许在大规模水平上培养各种类型的细胞的方法。如本文所使用，“大”或“大规模”是指约107至约1030个细胞，包括约107至约1015个细胞，且包括约107至约1012个细胞的产物。本发明的方法和生产系统将对再生医学具有显著的影响，因为它们允许足够的、高质量和买得起的细胞。此外，该系统和方法通过提供用于生产重组蛋白质和病毒的更买得起的方法来对生物制药工业提供有利影响。
附图说明
当考虑其以下详细描述时，本发明将被更好地理解，并且除了以上阐述的特征、方面和优点以外的特征、方面和优点将变得显而易见。这样的详细描述参考以下附图，其中：
图1是描绘用于处理中空藻酸盐水凝胶纤维的本发明的装置的示意图。
图2描绘了用于处理中空藻酸盐水凝胶纤维的本发明的示例性装置。
图3A-3E是描绘用于培养中空藻酸盐水凝胶纤维内的细胞的本发明的方法步骤的示意图。图3A描绘了在中空藻酸盐水凝胶纤维的填充介质的空间中培养的细胞。包含细胞的纤维悬浮在细胞培养容器或生物反应器中的细胞培养基中。细胞在中空纤维中扩增(图3B)并收获(图3C)或分化(图3D)。中空纤维中的细胞也可用于产生重组蛋白和病毒(图3E)。
图4描绘了如本发明所公开的悬浮在细胞培养基中的包含细胞的中空藻酸盐水凝胶纤维。
图5A-5C描绘了在中空水凝胶纤维中培养干细胞。显示了H9人胚胎干细胞(图5A)，诱导人多能干细胞：MSC-iPSC(由人间充质干细胞制备的iPSC)(图5B)和Fib-iPSC(由人成纤维细胞制备的iPSC)(图5C)。将细胞在中空纤维中培养8天，在此期间细胞从单个细胞生长成大聚集体。
图6A-6F描绘了分化成皮层神经元(图6A-6C)和多巴胺能神经元(图6D-6F)的人iPSC。图6A和6B描绘了在第30天的中空藻酸盐水凝胶纤维内的皮层神经元的相位图像。图6D和6E描绘了在第30天的中空纤维内的多巴胺能神经元的相位图像。图6C和6F描绘了分化为相应神经元的人iPSC在第30天的免疫染色。
图7A-7C描绘了在中空藻酸盐水凝胶纤维中培养的人胶质母细胞瘤干细胞。图7A描绘了在7天的时期内在中空纤维中培养的细胞系L0。图7B描绘了在7天的时期内在中空纤维中培养的细胞系L1。图7C描绘了在7天的时期内在中空纤维中培养的细胞系L2。细胞从单个细胞生长成大聚集体。
图8描绘了在中空藻酸盐水凝胶纤维中培养的用于产生重组Wnt 3A蛋白的小鼠L细胞。将稳定表达Wnt3A蛋白的L细胞在中空纤维中培养6天。细胞到第6天生长成高密度聚集体。
图9A-9J描绘了如实施例5中分析的中空藻酸盐水凝胶纤维细胞培养系统(“细胞培养系统”)。图9A和9B显示了用于处理一根中空纤维的自制微型挤出机。将含有单个细胞的透明质酸(HA)溶液和藻酸盐溶液分别泵入微型挤出机的中央和侧面通道中以形成同轴芯-壳流，所述同轴芯-壳流被挤出到100mM CaCl2缓冲液中，其立即交联藻酸盐以形成水凝胶壳以制备一根中空纤维。随后，用细胞培养基替代CaCl2缓冲液，并将细胞悬浮并生长在中空纤维的芯微空间中。图9C描绘了在CaCl2缓冲液中新鲜制备的中空纤维。图9D-9F描绘了具有9个喷嘴的微型挤出机，用于同时加工9根中空纤维。图9G描绘了需要HA来制备无缺陷的中空纤维。在没有HA的情况下(-HA)，形成具有不对称的壳或珠的纤维。图9H是显示细胞培养系统中细胞生长的中空藻酸盐水凝胶纤维的图示。在数小时内，单个细胞结合以形成小细胞团(即初始群集)。随后，细胞增殖并且小细胞团扩增为球状体，最终融合以形成圆柱形细胞团块。将细胞团块的直径控制在小于500μm，以确保细胞团块中有效的质量输送。将分别用显示绿色和红色荧光的DIO和DID染料染色的两瓶H9hESC以1:1混合，并在细胞培养系统中培养。清楚地看到单个细胞(第0天)，小细胞团(第1天)，圆柱形细胞团块(第9天)。图9J描绘了原始细胞存活所需的ROCK抑制剂(RI)。活/死染色显示在没有RI的情况下(-RI)，大多数细胞在24小时后凋亡。在有RI的情况下(+RI)细胞存活并生长良好。比例尺：(图9G、9I和9J)200μm。
图10A描绘了在目前3D悬浮培养物(例如旋转瓶或搅拌罐生物反应器)中，单个hPSC在24小时内(即初始群集阶段)结合形成小细胞团，所述团随后作为球状体扩增(即细胞扩增阶段)。细胞和球状体经常彼此融合以形成大的聚集体。图10B证实了实验中的细胞聚集：分别用DIO和DID染料染色的两瓶H9hESC以1:1混合并在悬浮液中培养。在荧光显微镜下，亲脂性DIO和DID染料分别使细胞染色，以显示绿色和红色。清楚地看到单个细胞(第0天)，具有绿色和红色细胞的小团(第1天)，具有绿色和红色细胞的球状体和聚集体(第4天)。比例尺：100μm。
图11A-11F描绘了藻酸盐水凝胶制剂对细胞培养系统中的hPSC培养物的影响。将H9hESC在由具有不同的粘度或分子量(500约600cp；300约400cp和80约120cp)的来自Sigma(#A2033-100G)或Wako Chemicals的2％藻酸盐制备的中空藻酸盐水凝胶纤维(内径：约400μm；壳厚度：约40μm)中培养9天。图11A描绘了显示中空纤维中第0天的单个H9和第4天的H9球状体的相位图像。图11B描绘了活/死染色显示中空纤维中几乎没有死细胞。图11C描绘了第10天的细胞的Oct4染色。H9在第9天从中空纤维释放，并且在固定和染色之前在基质胶包被的平板上培养过夜。箭头指向分化的Oct4-细胞。图11D和11E描绘了第5、7和9天的扩增倍数和体积产量。图11F描绘了9天培养后的Oct4+细胞的百分比。误差条表示标准偏差(n＝3)。***表示p<0.001水平的统计显著性。比例尺：(图11A和11B)400μm；(图11C)50μm。
图12A-12E描绘了藻酸盐水凝胶制剂对细胞培养系统中的hPSC培养物的影响。将H9在由来自Wako Chemicals的1％、1.5％或2％藻酸盐(80至120cp)制备的中空藻酸盐水凝胶纤维(内径：约400μm；壳厚度：约40μm)中培养9天。图12A描绘了中空纤维中第0、1和8天细胞的相位图像。图12B和12C描绘了第5、7和9天的扩增倍数和体积产量。图12D描绘了第10天的细胞的Oct4染色。H9在第9天从中空纤维释放，并且在固定和染色之前在基质胶包被的平板上培养过夜。图12E描绘了9天培养后的Oct4+细胞的百分比。误差条表示标准偏差(n＝3)。比例尺：(图12A)400μm；(图12D)50μm。
图13A-13G描绘了水凝胶壳厚度对细胞培养系统中的hPSC培养物的影响。将H9在由来自Wako Chemicals的1.5％藻酸盐(80至120cp)制备的壳厚度为30、40、70或90μm的中空藻酸盐水凝胶纤维中培养9天。图13A给出用于基于细胞溶液和藻酸盐溶液的体积流速和纤维外径来预测壳厚度的等式。图13B描绘了实验壳厚度与预测数据非常吻合。图13C描绘了具有不同壳厚度的中空纤维中的细胞在第0天的相位图像。图13D和13E描绘了第5、7和9天的扩增倍数和体积产量。图13F描绘了第10天的细胞的Oct4染色。H9在第9天从中空纤维释放，并且在固定和染色之前在基质胶包被的平板上培养过夜。图13G描绘了9天培养后的Oct4+细胞的百分比。误差条表示标准偏差(n＝3)。比例尺：(图13C)200μm；(图13D)50μm。
图14A-14E描绘了中空纤维内径对细胞培养系统中的hPSC培养物的影响。将H9在由来自Wako Chemicals的1.5％藻酸盐(80至120cp)制备的内径为400、250或120μm的中空藻酸盐水凝胶纤维中培养9天。图14A描绘了中空纤维中的细胞在第0、1、5和8天的相位图像。图14B和14C描绘了在第5、7和9天的扩增倍数和体积产量。图14D描绘了第10天的细胞的Oct4染色。H9在第9天从中空纤维释放，并且在固定和染色之前在基质胶包被的平板上培养过夜。图14E描绘了9天培养后的Oct4+细胞的百分比。误差条表示标准偏差(n＝3)。比例尺：(图14A)400pm；(图14D)50pm。
图15A-15F描绘了细胞培养系统中液体芯生态位对hPSC培养物的影响。将H9在由具有不同芯液体配方的来自Wako Chemicals的1.5％藻酸盐(80至120cp)加工的中空藻酸盐水凝胶纤维中培养9天，所述配方包括3％甲基纤维素(MC)、1％透明质酸(HA)、2％HA、2％HA+1μg/mL纤连蛋白+0.5μg/mL层粘连蛋白或2％HA+StemBeads。图15A描绘了显示第0天和第3天的细胞的相位图像。图15B描绘了活/死染色显示中空纤维中几乎没有死细胞。图15C描绘了第10天的细胞的Oct4染色。H9在第9天从中空纤维释放，并且在固定和染色之前在基质胶包被的平板上培养过夜。图15D和15E描绘了在第5、7和9天的扩增倍数和体积产量。图15F描绘了9天培养后的Oct4+细胞的百分比。误差条表示标准偏差(n＝3)。比例尺：(图15A和15B)400μm；(图15C)50μm。
图16A-16E描绘了细胞接种密度对细胞培养系统中的hPSC培养物的影响。将H9在由来自Wako Chemicals的1.5％藻酸盐(80至120cp)加工的中空藻酸盐水凝胶纤维中培养9天。图16A描绘了中空纤维中的细胞的相位图像。24小时后，在更高的接种密度下的细胞团更大，但团的数量相似。图16B描绘了第5、7和9天的扩增倍数显示hPSC在较低接种密度下生长得更快，而在第9天的最终体积产量非常接近(图16C)。图16D描绘了第10天的细胞的Oct4染色。H9在第9天从中空纤维释放，并且在固定和染色之前在基质胶包被的平板上培养过夜。图16E描绘了9天培养后的Oct4+细胞的百分比。误差条表示标准偏差(n＝3)。***表示p<0.001水平的统计显著性。比例尺：(图16A)400μm；(图16D)50μm。
图17A-17F描绘了在具有超低接种密度的细胞培养系统中培养hPSC。将H9以1.0x、3.0x或5.0x105个细胞/mL接种于由来自Wako Chemicals的1.5％藻酸盐(80至120cp)加工的中空藻酸盐水凝胶纤维中。图17A描绘了显示少量H9在中空纤维中生长成圆柱形细胞团块的相位图像。图17B描绘了活/死染色显示几乎没有死细胞。图17C是显示在培养的不同天数具有H9的单一纤维的图像。图17D描绘了在所有接种密度下最终的体积产量接近。图17E描绘了第10天的细胞的Oct4染色。H9从中空纤维释放，并且在固定和染色之前在基质胶包被的平板上培养过夜。图17F描绘了培养10天后的Oct4+细胞的百分比。误差条表示标准偏差(n＝3)。比例尺：(图17A和17B)400μm；(图17E)50μm。
图18A-18D描绘了细胞培养系统中hPSC的第1代培养。H9、MSC-iPSC和Fib-iPSC在由来自Wako Chemicals的1.5％藻酸盐(80至120cp)加工的中空藻酸盐水凝胶纤维中培养。图18A描绘了细胞培养系统中hPSC的相位图像和活/死染色。图18B和18C描绘了在第5、7和9天的扩增倍数和体积产量。图18D描绘了第9天的细胞团块被固定并且针对以下多能性标志物染色：Nanog、Oct4、SSEA-4和碱性磷酸酶(ALP)。显示了圆柱形细胞团块的不同切片的图像。对于MSC-iPSC和Fib-iPSC获得类似的结果。误差条表示标准偏差(n＝3)。比例尺：400μm。
图19A-19G描绘了在细胞培养系统中的hPSC的长期培养。将H9、Fib-iPSC和MSC-iPSC在由来自Wako Chemicals的1.5％藻酸盐(80至120cp)制备的中空藻酸盐水凝胶纤维中培养以传代10次。图19A描绘了第10代中空纤维中第0、3和5天的细胞的相位图像。图19B描述了活/死染色显示第10代中空纤维中几乎没有死细胞。图19C和19D描绘了第10代hPSC在第5、7和9天的扩增倍数和体积产量。图19E描绘了第10代第9天的细胞团块中以下多能性标志物的表达：Nanog、Oct4、SSEA-4和碱性磷酸酶(ALP)。图19F显示约95％的第10代细胞表达Oct4和Nanog。图19G描绘了当以1.0x107个细胞/mL接种时，在长期培养过程中hPSC每5天每次传代持续扩增约15倍。误差条表示标准偏差(n＝3)。比例尺：(图19A和19B)400μm；(图19E)200μm。
图20A-20F显示hPSC在细胞培养系统中长期培养后保留了多能性。将H9在由来自Wako Chemicals的1.5％藻酸盐(80至120cp)制备的中空藻酸盐水凝胶纤维中培养以传代10次。在胚状体(EB)测定中，细胞分化成巢蛋白+外胚层细胞、α-SMA+中胚层细胞和FOXA2+内胚层细胞(图20A)，形成含有三种胚层组织的畸胎瘤(图20B)和具有正常核型(图20C)。通过在中胚层(图20D)或内胚层(图20E)或心肌细胞(图20F)分化培养基中进一步培养，中空藻酸盐水凝胶纤维中的hPSC可以高效率地分化成相应的Brachyury+中胚层细胞或FOXA2+内胚层细胞或cTNT+心肌细胞。比例尺：(图20A和20B)100μm；(图20D-20F)200μm。
图21A-21F描绘了hPSC在细胞培养系统中长期培养后保持多能性。将MSC-iPSC和Fib-iPSC在由来自Wako Chemicals的1.5％藻酸盐(80至120cp)制备的中空藻酸盐水凝胶纤维中培养以传代10次。在EB测定中，两种细胞都分化成巢蛋白+外胚层细胞、α-SMA+中胚层细胞和FOXA2+内胚层细胞(图21A和21B)，形成含有三种胚层组织的畸胎瘤(图21C和21D)，并具有正常核型(21E和21F)。比例尺：100μm。
图22描绘了hPSC在细胞培养系统中长期培养后保持多能性。H9、MSC-iPSC和Fib-iPSC在由来自Wako Chemicals的1.5％藻酸盐(80至120cp)制备的中空纤维中培养以传代10次。这些细胞进一步在基质胶包被的平板上培养。显示了在基质胶包被的平板上传代一次后表达多能性标志物Oct4的hPSC集落的图像。比例尺：100μm。
图23A-23F描绘了具有中空藻酸盐水凝胶纤维的原型生物反应器。图23A描绘了悬浮在圆柱形容器中的具有细胞的中空纤维。介质储存在塑料波纹管中，可以分别按压所述塑料波纹管以使介质流入容器或释放所述塑料波纹管以从容器中抽出介质。图23B示出了用于按压和释放波纹管的机械台的图像；能够针对按压和释放速度以及按压和释放之间的时间间隔的持续时间进行编程的控制器；以及容器和波纹管。图23C是第10天生物反应器中的圆柱形白色细胞团块的图像。图23D显示用2.0mL中空纤维制备1.0x109个细胞。图23E和23F显示这些细胞表达多能性标志物：Nanog、Oct4、SSEA4和ALP。误差条表示标准偏差(n＝3)。比例尺：(图23C)1cm；(图23E)200μm。
图24A-24E描绘了在细胞培养系统中培养被工程化以表达Wnt3a蛋白的L-Wnt-3A-细胞。将细胞在接种密度为1.0x或2.0x107个细胞/mL的细胞培养系统中培养。图24A描绘了中空纤维中的细胞的相位图像。图24B描绘了活/死染色显示几乎没有死细胞。图24C和24D描绘了在第2至6天的扩增倍数和体积产量。图24E显示Wnt3a蛋白在16天培养期间持续表达。误差条表示标准偏差(n＝3)。比例尺：(图24A和24B)400μm。
图25A-25E描绘了用于细胞培养系统的原型生物反应器。具有细胞的中空纤维包含在封闭的细胞培养室中。将培养基储存在烧瓶中并连续灌注到培养室中。图25C是10cm培养皿中(在第10天从生物反应器收获的)圆柱形白色细胞团块的图像。图25D和25E描绘了具有100个喷嘴的挤出机，用于同时处理100根中空纤维。
尽管本发明允许各种修改和供选择的形式，但其具体实施方案已经通过实例的方式在附图中示出并且在下文中详细描述。然而，应该理解的是，具体实施方案的描述并非意图将本发明限制为覆盖落入由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的所有修改、等价方案和供选择的方案。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本文描述的那些相似或等价的任何方法和材料，但是以下描述的是优选的方法和材料。
根据本发明，已经发现令人惊讶地允许在大规模水平上培养和生产细胞的方法。具体地，本发明提供了生产系统和装置，以及使用该系统和装置用于在由藻酸盐聚合物制成的中空纤维中培养和生产细胞的方法。
生产/培养细胞的方法
本发明的方法可用于以各种规模培养和生产细胞。该方法至少提供优于常规细胞培养方法的以下优点：(1)允许大规模细胞生产；(2)允许高密度细胞培养，从而减少细胞培养的空间、劳动和材料；(3)允许各种类型的细胞的培养；和(4)允许以更便宜、更有效的方式生产细胞。可使用本文所述的方法和系统培养和生产的这类细胞的非限制性实例包括哺乳动物细胞、昆虫细胞(例如果蝇S2细胞)、植物细胞、酵母细胞和细菌细胞。虽然使用哺乳动物细胞，尤其是人多能干细胞更充分地描述，但应认识到，在不脱离本发明的范围的情况下，本文所述的方法和系统可与任何上述类型的细胞一起使用。
如本文所使用，“哺乳动物细胞”是指源自人和动物的细胞。特别合适的用于本发明的方法和系统的哺乳动物细胞包括哺乳动物胚胎干细胞、哺乳动物诱导多能干细胞、哺乳动物原始多能干细胞、从哺乳动物胚胎干细胞分化的细胞、哺乳动物诱导多能干细胞和哺乳动物原始多能干细胞、从其他细胞类型重编程的哺乳动物细胞(例如从人成纤维细胞重编程的人神经元)、哺乳动物原代细胞(例如人脐静脉内皮细胞、癌细胞、T细胞)、哺乳动物组织干细胞(例如间充质干细胞、胎儿神经干细胞)、哺乳动物细胞系(例如人胚肾(HEK293)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。
通常，本发明的方法包括：将细胞悬浮在中空水凝胶纤维内的填充液体介质的空间中；将中空纤维悬浮在细胞培养基中以使细胞扩增和/或分化；并收获细胞。
将细胞悬浮于细胞培养基或细胞相容的缓冲液中以形成细胞溶液。细胞培养基是细胞类型依赖性的。适合地，将细胞悬浮于培养基中，浓度从1至几十亿个细胞/立方毫升。
中空纤维由藻酸盐聚合物材料制备。用于制备纤维的合适藻酸盐聚合物材料包括任何市售或自纯化的藻酸盐聚合物，例如来自Sigma(+W201502)的海藻酸或海藻酸钠，以及改性藻酸盐聚合物，例如甲基丙烯酸酯改性藻酸盐及其组合。如本文所使用，“其组合”是指聚合物的混合物以及聚合物共混物。此外，在一些实施方案中，可以将其他聚合物例如透明质酸共混或掺入藻酸盐聚合物中以掺杂藻酸盐水凝胶。为了形成纤维，首先将藻酸盐聚合物溶解在水或细胞相容的缓冲液中以形成包含约0.01％(w/v)至约20％(w/v)的藻酸盐的藻酸盐溶液。在特别合适的方面，随后使用挤出机制备纤维并用细胞填充。挤出条件将是本领域已知的适用于特定细胞存活和生长的那些条件。
举例来说，如图1和2所示，包含细胞的细胞溶液经由第一入口100供应，藻酸盐溶液经由至少第二入口(在图1中显示为入口102、104)供应。包含细胞溶液的第一流和包含藻酸盐溶液的第二流都被挤出到含有可以交联藻酸盐溶液中藻酸盐聚合物的钙离子或其他离子或化学物质，如钡离子的细胞相容的溶液中。细胞相容的溶液允许藻酸盐聚合物立即交联，从而胶凝藻酸盐溶液并形成中空纤维。通常，纤维在约1分钟至约30分钟的时期内充分交联。
通常，如所形成的，中空纤维的尺寸将根据具体的细胞和期望的细胞扩增量而定。纤维的长度通常可以从几毫米到几米。另外，中空水凝胶纤维的外径和内径可以从微米到毫米变化。
一旦充分交联以形成中空纤维，则去除细胞相容的溶液并添加细胞培养基以培养已在交联的中空藻酸盐水凝胶纤维内的细胞。在一些方面，将包括细胞的纤维悬浮在细胞培养容器或生物反应器中的细胞培养基中。细胞培养基可以是适用于支持细胞存活、生长和分化的细胞培养领域已知的任何培养基。通常，细胞培养基将包括但不限于碳源、氮源和生长因子。用于培养交联的中空藻酸盐水凝胶纤维内的细胞的特定细胞培养基将取决于待培养的细胞类型。
细胞培养条件将根据细胞的类型、细胞扩增量和期望的细胞数量而变化。一旦达到足够的细胞扩增和期望的细胞数量，可将细胞传代并接种到新的交联的中空藻酸盐水凝胶纤维中以进行下一轮的生长和扩增循环。供选择地，可以将扩增的细胞在中空空间内分化成最终期望的细胞类型。
通过化学或物理溶解纤维，细胞最终从纤维的中空空间释放。一方面，使用化学溶剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)或藻酸盐裂解酶溶液(可从Sigma-Aldrich获得)溶解纤维。另一方面，使用机械力溶解纤维。中空纤维内细胞的持续时间通常可以从几天到几个月不等。
细胞在研究实验室和工业中都是有用的。小规模和大规模的细胞可以分别使用实验室和工业应用的系统生产。细胞可以在尺寸和数量上被有效率地和有效地制备，用于退行性疾病和损伤治疗、药物筛选、表达蛋白质等。此外，细胞可用于生产蛋白质和疫苗。在再其他方面，细胞可以用于组织工程学。
用于制备藻酸盐中空纤维的系统/装置
另一方面，本发明涉及用于由藻酸盐聚合物制备的具有悬浮在中空空间中的细胞的中空纤维的装置。一般来说，参考图1，装置1包括壳体2，壳体2包括沿着所述壳体2的中心延伸的芯通道106。芯通道连接到第一入口100，用于将细胞引入壳体2中。装置1的壳体2还包括壳通道108、110，用于使通过第二入口104、102引入的藻酸盐溶液流入壳体2。虽然显示具有两个壳通道，但应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，壳体可以包括更少或更多的壳通道，例如单个壳通道，或者三个、四个、五个或更多个壳通道。在一些特别合适的实施方案中，在入口100、102、104处包括泵(未显示)，用于将细胞和藻酸盐溶液流推入装置1的壳体2中。
装置1的通道106的出口与包含细胞相容的缓冲液的细胞培养容器或生物反应器112接触，以形成包括壳体2和细胞培养容器或生物反应器112的系统。容器112包括如上所述的缓冲液114，所述缓冲液114包含钙离子或其他离子或化学品，其可以交联藻酸盐溶液内的藻酸盐聚合物以胶凝溶液形成纤维。
在考虑以下非限制性实施例后将更全面地理解本发明。
实施例
除非另外说明，否则如上所述制备中空纤维。
实施例1
在该实施例中，在8天内分析人多能干细胞，包括人胚胎干细胞(hESC)和人诱导多能干细胞(人iPSC)在中空纤维中的扩增和生长。
单个人胚胎干细胞(H9，WiCell)(图5A)，或从人间充质干细胞(MSC-iPSC)重编程的诱导人多能干细胞(图5B)，或从人皮肤成纤维细胞(Fib-iPSC)重编程的诱导人多能干细胞(图5C)以1x106个细胞/ml的密度悬浮于含有0.5％(w/v)透明质酸(LifecoreBiomedical)的Essential 8培养基(Life Technology)中。将藻酸钠溶于0.9％(w/v)盐水中以达到1.2％(w/v)藻酸盐的浓度并高压灭菌。用挤出机(参见例如图1和2)将10ml细胞溶液和10ml藻酸盐溶液挤出到室温下的100ml含有100mM CaCl2的无菌缓冲液中，以形成具有悬浮在中空空间中的细胞的藻酸盐中空纤维。纤维在室温下在CaCl2溶液中交联5分钟。除去CaCl2溶液并用Essential 8培养基代替。在37℃下，在5％CO2，95％空气中，在1atm下，在常规细胞培养箱中在悬浮在培养基中的中空纤维中培养细胞8天。单个细胞生长成细胞聚集体。为了收获细胞，移除Essential 8培养基，并在37℃下用含有100mM EDTA(Sigma)或40mg/ml藻酸盐裂解酶(Sigma)的PBS替代10分钟。溶解藻酸盐水凝胶纤维并收获细胞。这些细胞聚集体可以通过用Accutase(Life Technology)在37℃下处理10分钟来解离成单个细胞。细胞可以处理到藻酸盐中空纤维中以进行第二轮扩增。如图5A-5C所示，使用中空纤维，细胞有效地从单个细胞生长成大聚集体。
实施例2
在该实施例中，如实施例1中制备的包含人iPSC的中空藻酸盐纤维在纤维内分化成皮层神经元和多巴胺能神经元。
使人MSC-iPSC在中空纤维中扩增5天。然后将Essential 8培养基替换为自制的和化学限定神经元分化培养基，然后在藻酸盐中空纤维内分化成皮层和多巴胺能神经元30天。结果显示在图6A-6F中。如图6C和6F所示，第30天的免疫染色表明大多数人iPSC分化成相应的神经元。
实施例3
在该实施例中，在中空纤维中培养人胶质母细胞瘤干细胞。
在中空纤维中培养分离自人成胶质细胞瘤的三种癌干细胞系L0、L1和L2。单个细胞以0.5x106个细胞/ml的密度悬浮于含有0.8％(w/v)透明质酸(Lifecore Biomedical)的NeuroCult培养基(Stem Cell Technology)中。将藻酸钠溶于0.9％(w/v)盐水中以达到1.5％(w/v)藻酸盐的浓度并高压灭菌。用挤出机(参见例如图1和2)将10ml细胞溶液和10ml藻酸盐溶液挤出到室温下的100ml含有100mM CaCl2的无菌缓冲液中，以形成具有悬浮在中空空间中的细胞的藻酸盐中空纤维。纤维在室温下在CaCl2溶液中交联10分钟。除去CaCl2溶液并用NeuroCult培养基代替。在37℃下，在5％CO2和95％空气中，在1atm下，在常规细胞培养箱中在悬浮在培养基中的中空纤维中培养细胞7天。单个细胞生长成细胞聚集体。为了收获细胞，移除NeuroCult培养基，并在37℃下用含有40mg/ml藻酸盐裂解酶(Sigma-Aldrich)的PBS置换10分钟。溶解藻酸盐纤维并收获细胞聚集体。这些聚集体可以通过用0.05％胰蛋白酶(Life Technology)在37℃下处理10分钟来解离成单个细胞。细胞可以处理到藻酸盐中空纤维中以进行第二轮扩增。细胞从单个细胞生长成大聚集体(参见图7A-7C)。
实施例4
在该实施例中，培养工程化以表达Wnt 3A蛋白的小鼠L细胞，用于在中空纤维中产生重组蛋白。
将稳定表达Wnt 3A蛋白(CRL-2647)的小鼠L细胞在中空纤维中培养20天。单个细胞以1x106个细胞/ml的密度悬浮于含有0.8％(w/v)透明质酸(LifecoreBiomedical)的DMEM培养基(Stem Cell Technology)中。将藻酸钠溶于0.9％(w/v)盐水中以达到1.2％(w/v)藻酸盐的浓度并高压灭菌。用挤出机(参见图1和2)将20ml细胞溶液和20ml藻酸盐溶液挤出到室温下的200ml含有100mM CaCl2的无菌缓冲液中，以形成具有悬浮在中空空间中的细胞的藻酸盐中空纤维。纤维在室温下在CaCl2溶液中交联10分钟。除去CaCl2溶液并用包含10％FBS的DMEM培养基(Atlanta Biologicals)代替。在37℃下，在5％CO2和95％空气中，在1atm下，在常规细胞培养箱中在悬浮在培养基中的中空纤维中培养细胞20天。细胞到第6天生长成高密度聚集体(参见图8)。
实施例5
在该实施例中，将各种细胞悬浮并生长在中空藻酸盐水凝胶纤维(也称为细胞培养系统或培养系统)中。
材料和方法
材料：从George Q.Daley实验室(波士顿儿童医院，波士顿)获得Fib-iPSC(从人真皮成纤维细胞重编程的iPSC)和MSC-iPSC(从人间充质干细胞重编程的iPSC)。H9hESC购自WiCell研究所(WiCell Research Institute)。L Wnt-3A细胞(CRL-2647TM)由ATCC获得。试剂及其供应商：E8培养基(E8)、Accutase和活/死细胞活力染色试剂盒：LifeTechnologies；Y-27632：Selleckchem；基质胶：D Biosciences；透明质酸钠(HA 700K-1)：Lifecore Biomedical。藻酸钠(500至600cp；300至400cp和80至120cp)：Wako Chemicals。藻酸钠(A2033-100G)：Sigma。Vybrant细胞标记溶液：Molecular Probes,Inc。DMEM：GEHealthcare Life Sciences；FBS：Atlanta biologicals；G418：Sigma。抗体及其供应商：Oct4(Santa Cruz Biotechnology；1:100)；FOXA2(Santa Cruz Biotechnology；1:200)；α-SMA(Abcam；1:200)；巢蛋白(Millipore；1:200)。Nanog(10mg/mL)，Oct4(10mg/mL)，SSEA-4(10mg/mL)和碱性磷酸酶(10mg/mL)和Brachyury(10mg/mL)(R&D systems,Inc.)。注射泵(New Era Pump System,Inc.)；一次性注射器(Henke sass wolf)；透明丙烯酸矩形条、钢管和塑料管(McMaster)；氯化钙(Acros Orcanics)；氯化钠(Fisher scientific)。机械台和控制器(CESCO)；波纹瓶(Spectrum Chemical Mfg.Corp.)；荧光素酶测定试剂盒(Biovision,K801-200)。
制备藻酸盐中空纤维：使用自制的微型挤出机制备藻酸盐中空纤维。将含有单个细胞和藻酸盐溶液的透明质酸(HA)溶液分别泵入自制微型挤出机的中央通道和侧面通道中，并挤出到CaCl2缓冲液(100mM)中制成中空纤维。随后，用细胞培养基代替CaCl2缓冲液。
在中空藻酸盐水凝胶纤维中培养hPSC：对于典型的细胞培养，将20μL藻酸盐中空纤维中的细胞溶液悬浮在6孔板中的2mL E8培养基，并在37℃下在具有5％CO2、21％O2的培养箱中培养。每天更换培养基。为了使细胞传代，移除培养基并将藻酸盐水凝胶用0.5mMEDTA溶解5分钟。通过在100g下离心5分钟收集细胞团块，用Accutase在37℃下处理12分钟，并解离成单细胞用于以下培养。
在中空藻酸盐水凝胶纤维中培养L-Wnt3A-细胞：对于典型的细胞培养，将20μL藻酸盐中空纤维中的细胞溶液悬浮于在6孔板中的2mL添加10％FBS和00.4mg/mL G418的DMEM培养基，并在37℃下在具有5％CO2、21％O2的培养箱中培养。每天更换并收集培养基，用于定量Wnt3A蛋白质。为了定量Wnt3A蛋白质，使用用于经典Wnt信号转导的萤光素酶报道基因(Addgene,#24308)稳定转染MDA-468细胞(HTB-132TM)。将这些MDA-468-TFP细胞接种在96孔板(5000个细胞/孔/200mL培养基)中。24小时后，添加150mL添加10％FBS的新鲜DMEM和50mL L-Wnt3A-细胞条件培养基，并再孵育18小时。然后除去培养基，用PBS洗涤细胞一次，然后添加200mL细胞裂解缓冲液并在室温下孵育10分钟。将50mL细胞裂解物、来自荧光素酶测定试剂盒的50mL底物A和50mL底物B混合，并立即用光度计读取光信号。用标准曲线计算Wnt3a蛋白质的量。
使用生物反应器在中空藻酸盐水凝胶纤维中培养hPSC：将2.0mL中空纤维中的细胞溶液悬浮于自制生物反应器中。将细胞在37℃下在具有5％CO2、21％O2的培养箱中培养10天。对于生物反应器1，将培养基储存在烧瓶中并连续灌注到生物反应器中。对于生物反应器2，将介质存储在波纹管中，该波纹管定期被按压以使介质流入容器中或被释放以从容器中抽出介质。
染色和成像：将在2D表面上培养的细胞用4％多聚甲醛(PFA)在室温下固定15分钟，用0.25％的Triton X-100透化15分钟，并用5％驴血清封闭1小时。然后将细胞与第一抗体在4℃下孵育过夜。充分洗涤后，加入第二抗体和4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)并在室温下再孵育1小时。用PBS洗涤细胞3次，然后用Zeiss Axio Observer荧光显微镜成像。为了评估细胞的多能性，在固定和染色之前，将hPSC接种到基质胶包被的平板上过夜。用Image J软件定量Oct4+或Nanog+细胞核的百分比。分析至少1000个细胞核。为了染色3D圆柱形细胞团块，收获细胞团块并用4％PFA在室温下固定30分钟，然后在4℃下用PBS+0.25％Triton X-100+5％山羊血清+第一抗体孵育48小时。充分洗涤后，加入2％BSA中的第二抗体并在4℃下孵育24小时。用PBS洗涤细胞3次，然后用Nikon A1共聚焦显微镜成像。根据产品手册，细胞活力染色用于评估活细胞和死细胞。
胚状体(EB)分化：将从中空藻酸盐水凝胶纤维释放的hPSC悬浮在低粘附板中的DMEM+20％FBS+10μMβ-巯基乙醇中6天。然后将细胞团块转移到包被有0.1％明胶的平板上，并在相同培养基中再培养6天，随后如上所述进行固定和染色。
体内畸胎瘤形成：所有动物方案均由内布拉斯加大学林肯分校的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of the University ofNebraska-Lincoln)批准。所有涉及动物的实验程序均按照内布拉斯加大学林肯分校的机构动物护理和使用委员会的指南进行。将2x106个hPSC悬浮在25μL PBS加25μL基质胶中，并在NOD-SCID小鼠(Charles River实验室)的颈后部皮下注射。6-12周后收获肿瘤。将肿瘤用4％PFA固定48小时，然后用70％、95％和100％乙醇依次脱水，并用二甲苯脱脂2小时，然后包埋于石蜡中。然后切下10μm厚的切片并用苏木精和伊红染色。
核型：核型分析由WiCell研究所进行。
中胚层诱导：将中空纤维中的H9细胞在E8培养基中培养7天，然后在含有1％的无胰岛素的B27和12mM CHIR99021的DMEM/F12培养基中培养24小时，然后固定和染色。
内胚层诱导：将中空纤维中的H9细胞在E8培养基中培养7天，然后在含有1％GlutaMAX、1％的无胰岛素的B27、4mM CHIR99021的RPMI1640培养基中培养24小时，并且在含有1％GlutaMAX、1％不含胰岛素的B27的RPMI 1640培养基中再培养24小时，然后固定和染色。
心肌细胞分化：将中空纤维中的H9细胞在E8培养基中培养7天，然后在含有1％B27-胰岛素的DMEM/F12中培养6天，并且在含有1％B27的DMEM/F12中培养9天。分化过程中添加下列小分子：第0-1天添加12mM CHIR99021；第3-4天添加5mM IWR1。细胞团块在第11天释放到明胶包被的平板上。在第15天拍摄搏动的心肌细胞。一些样品在第11天固定用于cTNT免疫染色。
统计学分析：使用统计软件包Instat(GraphPad Software,La Jolla,CA)进行统计学分析。
结果
制造微挤出机用于用藻酸盐水凝胶制备中空纤维(图9A和9B)。挤出机可以具有一个或多个喷嘴，用于同时制备一根或多根中空纤维(图9A-9F)。发现细胞溶液和藻酸盐溶液的粘度应该接近，以制备无缺陷的中空纤维。为此目的，透明质酸(HA)和甲基纤维素(MC)溶液均可用于悬浮细胞。在没有HA或MC的情况下，经常形成具有不对称壳或珠的中空纤维(图9G)。这两种缺陷都可能导致细胞培养失败。与悬浮培养物中的hPSC类似(图10A和10B)。中空纤维细胞培养系统中的hPSC通过初始群集阶段和随后的细胞扩增阶段生长(图9H和9I)，并且ROCK抑制剂Y-27632是解离的hPSC的初始存活所需的(图9J)。
发现纤维中hPSC的增殖和多能性受到藻酸盐水凝胶制剂的显著影响。例如，当用来自Sigma(#A2033-100G)和Wako Chemicals(500至600cp；300至400cp和80至120cp)的2％藻酸盐制备的中空纤维培养9天时，hPSC扩增27、51、51和49倍，分别产生2.7x108、5.1x108、5.1x108和4.9x108个细胞/mL，其中47％、76％、80％和89％的最终细胞表达多能性标志物Oct4(图11A-11F)。活/死细胞染色显示所有培养物都几乎没有细胞死亡(图11B)。与藻酸盐类型相比，藻酸盐浓度在1.0％至2.0％范围内的影响要小得多。例如，在用1.0％、1.5％和2.0％Wako Chemicals 80-120cp藻酸盐制备的中空纤维中培养9天的hPSC的细胞增殖和多能性没有显着差异(图12A-12E)。结论是1.5％Wako Chemicals 80-120cp藻酸盐水凝胶适用于在中空藻酸盐水凝胶纤维细胞培养系统中培养hPSC。
纤维几何结构也影响细胞培养系统中的hPSC培养。在给定的纤维外径下，可以通过改变细胞溶液和藻酸盐溶液流速之比来控制水凝胶壳厚度，并且可以用图13A和13B中描述的公式预测。纤维外径大致等于挤出机喷嘴的内径。当在具有30、40、70和90μm壳的中空纤维中培养9天时，94％、92％、85％和80％的最终细胞保留多能性标志物Oct4。在不同条件之间的细胞活力和扩增没有显著差异(图13C-13E)。当在内径为400μm、250μm和120μm的中空纤维中培养9天时，95％的细胞保留Oct4标志物(图14-14E)。结论是壳厚度<70μm且内径<400μm的中空纤维适用于在中空藻酸盐水凝胶纤维细胞培养系统中培养hPSC。
研究显示在悬浮培养物中添加细胞外基质蛋白如纤连蛋白和层粘连蛋白增强hPSC培养效率。本实施例的结果显示，这些蛋白在测试浓度下不改善细胞活力、生长速率和多能性，并且对于细胞培养系统是不必要的(图15A-15F)。由于HA和MC均可用于细胞，因此进一步分析它们是否对细胞培养有不同影响。结果显示1％HA、2％HA和3％MC导致相似的细胞活力、扩增和多能性(图15A-15F)。在藻酸盐中空纤维中培养hPSC的主要关注在于培养基中的大蛋白质因子(例如bFGF、胰岛素和转铁蛋白)可能不能有效地穿过水凝胶壳和细胞块以供给细胞。当含有并缓慢释放bFGF的乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)微球(StemBeads)被添加到中空纤维的液体芯中时，细胞活力、扩增和多能性未得到改善，表明蛋白质在新的培养系统中的运输是有效和充分的(图15A-15F)。
还研究了细胞接种密度对细胞培养系统中hPSC培养物的影响。当以1.0x106、2.0x106、5.0x106、10.0x106个细胞/mL接种时，hPSC分别在第9天扩增433、196、104和46倍，产生约5.0x108个细胞/mL(图16B)。对于所有条件，细胞都通过上述两个阶段生长(图16A)。在24小时，细胞团尺寸对于较高的接种密度而言较大，但每体积的细胞团的数量不受接种密度的显著影响(图16A，第1天，插入)。这些结果显示hPSC在较低的接种密度下生长得更快。然而，接种密度不影响多能性(图16D和16E)。非常令人兴奋的是，以超低密度接种的hPSC也可以在不牺牲细胞活力和多能性的情况下生长。当以1.0x105、3.0x105和5.0x105个细胞/mL接种时，hPSC在第14、12和10天分别扩增4000、1666和1000倍以产生约4.2x、5.1x、4.8x108个细胞/mL(图17D)。
优化后，评价细胞培养系统用于长期培养多个hPSC系。所有hPSC在细胞培养系统中生长良好，并且hPSC系之间的细胞形态、活力、生长速率和多能性没有显著差异(图18A-18D)。在细胞培养系统中的10次传代培养过程中，当以1.0x107个细胞/mL接种时，hPSC每5天每次传代持续扩增约15倍，并且>95％的细胞表达Oct4(图19G)。细胞培养系统中的长期培养不改变细胞表型，如与第1代hPSC相似的形态、活力、生长动力学和多能性所示(图18A-18D和图19A-19G)。体外胚状体(EB)分化和体内畸胎瘤形成证实了它们在长期培养后的多能性。在EB测定中，所有hPSC成功分化成FOXA2++内胚层细胞、α-SMA+中胚层细胞和巢蛋白+外胚层细胞(图20A和21A和21B)。当移植到免疫缺陷小鼠时，所有hPSC形成含有内胚层、中胚层和外胚层组织的畸胎瘤(图20B和21C和21D)。此外，在长期培养后，所有hPSC保持正常的核型(图20C和21E和21F)，并且可以在基质胶包被的2D表面上冷冻保存或进一步培养(图22)。在中胚层或内胚层或心肌细胞分化培养基中扩增并进一步培养后，中空纤维中的hPSC可以高效分化成相应的中胚层细胞或内胚层细胞或心肌细胞，表明细胞培养系统支持hPSC分化(图23D-23F)。
培养系统可以用于培养除hPSC以外的细胞。例如，工程化以表达Wnt3a蛋白的鼠L细胞可以被有效地培养而没有显著的细胞死亡，产生约6.0x108个细胞/mL。重要的是，这些细胞在16天的培养过程中持续以与在2D培养皿中培养的L细胞表达的水平类似的水平表达Wnt3a蛋白(图24A-24E)。该结果证实了中空水凝胶纤维作为培养细胞的一般适用系统的潜力。
两种原型生物反应器被设计和构建用于细胞培养系统。将具有细胞的中空纤维制备成圆柱形容器。在生物反应器1中，将储存在烧瓶中的介质连续灌注到容器中(图25A-25C)。在生物反应器2中，将介质储存在塑料波纹管中，该塑料波纹管可以分别被按压以使介质流入容器或被释放以从容器中抽出介质(图23A-23F)。两种生物反应器中的hPSC生长良好并且在第10天产生约5.0x108个细胞/mL。>95％的细胞表达多能性标志物。这些原型生物反应器未来可以放大。为了放大中空藻酸盐水凝胶纤维的制备，还制造有100个喷嘴的挤出机，其可在30分钟内制备1升中空纤维(图25D和25E)。
这些结果表明，本发明的方法和装置可用于在中空藻酸盐水凝胶纤维中培养和生产细胞。预期该方法可用于研究实验室和工业中，以制备用于疾病和损伤治疗、筛选药物文库以及生产蛋白质和疫苗的足够的和高质量的细胞。

Claims (20)

1.一种以各种规模生产细胞的方法，所述方法包括：
将包含细胞的细胞溶液悬浮在藻酸盐水凝胶纤维的中空空间中；
将包含所述细胞的纤维悬浮在细胞培养基中；和
培养所述细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中所述藻酸盐水凝胶纤维包含藻酸盐聚合物，所述藻酸盐聚合物选自由以下组成的组：藻酸聚合物、藻酸钠聚合物、改性藻酸盐聚合物及其组合。
3.权利要求1所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的组：哺乳动物胚胎干细胞、哺乳动物诱导多能干细胞、哺乳动物原始多能干细胞、从哺乳动物胚胎干细胞分化的细胞、哺乳动物诱导多能干细胞和哺乳动物初始多能干细胞、从其他细胞类型重编程的哺乳动物细胞、哺乳动物原代细胞、人脐静脉内皮细胞、癌细胞、T细胞、哺乳动物组织干细胞、哺乳动物细胞系、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌细胞。
4.权利要求1所述的方法，还包括从藻酸盐水凝胶纤维的中空空间释放培养的细胞，从藻酸盐水凝胶纤维的中空空间释放培养的细胞包括溶解所述藻酸盐水凝胶纤维。
5.权利要求4所述的方法，其中溶解所述藻酸盐水凝胶纤维包括使用化学溶剂化学溶解所述纤维，所述化学溶剂选自由以下组成的组：乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和藻酸盐裂解酶溶液。
6.权利要求4所述的方法，其中溶解所述藻酸盐水凝胶纤维包括使用机械力物理溶解所述纤维。
7.一种以各种规模生产细胞的方法，所述方法包括：
将细胞溶液和藻酸盐溶液挤出到细胞相容的溶液中，所述细胞相容的溶液使藻酸盐聚合物溶液内的藻酸盐聚合物交联，以形成中空藻酸盐水凝胶纤维；
将包含细胞的纤维悬浮在细胞培养基中或细胞相容的缓冲液中；和
培养所述细胞。
8.权利要求7所述的方法，其中通过将藻酸盐聚合物以按重量/体积计约0.01％至约20％的藻酸盐聚合物的浓度悬浮在溶液中来制备所述藻酸盐溶液。
9.权利要求7所述的方法，其中所述细胞相容的溶液包含钙离子和钡离子中的一种或多种。
10.权利要求7所述的方法，还包括从所述藻酸盐水凝胶纤维释放培养的细胞，从藻酸盐水凝胶纤维释放培养的细胞包括溶解所述藻酸盐水凝胶纤维。
11.权利要求10所述的方法，其中溶解所述藻酸盐水凝胶纤维包括使用化学溶剂化学溶解所述藻酸盐水凝胶纤维，所述化学溶剂选自由以下组成的组：乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和藻酸盐裂解酶溶液。
12.权利要求10所述的方法，其中溶解所述藻酸盐水凝胶纤维包括使用机械力物理溶解所述藻酸盐水凝胶纤维。
13.一种用于培养细胞的系统，所述系统包括：
壳体，其包括第一入口、第二入口、芯通道、壳通道和出口，所述第一入口能被操作以用于将细胞溶液引入到所述芯通道，所述第二入口能被操作以用于将藻酸盐溶液引入到所述壳通道，其中所述壳通道与所述芯通道流体接触，以允许所述细胞溶液和所述藻酸盐溶液之间的接触；和
细胞培养容器，其在所述出口处与所述壳体流体接触，其中所述细胞培养容器包含细胞相容的缓冲液。
14.权利要求13所述的系统，其中所述壳体还包括第三入口，所述第三入口能被操作以用于将藻酸盐溶液引入第二壳通道。
15.权利要求13所述的系统，其中所述细胞溶液包含选自以下组成的组的细胞：哺乳动物胚胎干细胞、哺乳动物诱导多能干细胞、哺乳动物原始多能干细胞、从哺乳动物胚胎干细胞分化的细胞、哺乳动物诱导多能干细胞和哺乳动物原始多能干细胞、从其他细胞类型重编程的哺乳动物细胞、哺乳动物原代细胞、人脐静脉内皮细胞、癌细胞、T细胞、哺乳动物组织干细胞、哺乳动物细胞系、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌细胞。
16.权利要求13所述的系统，其中所述藻酸盐溶液包含选自由以下组成的组的藻酸盐聚合物材料：藻酸聚合物、藻酸钠聚合物、改性藻酸盐聚合物及其组合。
17.权利要求13所述的系统，其中所述藻酸盐溶液包含约0.01％(w/v)至约20％(w/v)的藻酸盐。
18.权利要求13所述的系统，其中所述细胞相容的缓冲液包含钙离子和钡离子中的至少一种。
19.权利要求18所述的系统，其中所述细胞相容的缓冲液包含CaCl2和BaCl2中的至少一种。
20.权利要求13所述的系统，还包括与所述第一入口和所述第二入口中的一个流体连接的至少一个泵。
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