CN1897890A - 用藻酸盐基质控制细胞生长 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抑制多数增殖细胞增殖的方法。公开了抑制细胞在动物体内的组合物上生长过度的方法。公开了抑制细胞在动物体内的装置上生长过度的方法。公开了外表面上具有含锶的藻酸盐基质的装置。公开了包含各自含有包被在藻酸盐体外表面的单层细胞的藻酸盐体和藻酸盐片层的组合物。公开了制备人造组织的方法。公开了含有封装在藻酸盐基质中和/或以单层维持在藻酸盐体上的细胞的装置，及其制造和使用方法。公开了涂覆组合物和装置的方法。
Description
发明领域
本发明涉及藻酸盐基质和它们在组合物和装置中用于抑制细胞增殖的用途。本发明也涉及藻酸盐制剂、粘附有单层细胞的构建物和装置，及其用途。
发明背景
已知藻酸盐是用于细胞封装的多功能材料，因为它们在恒温的生理条件下能够形成高度生物相容的高强度凝胶(Skjk-Brk G和T.Espevik，Carbohydrates inEurope 1996；14：19-25；和Strand BL等，Minerva Biotecnologica 2000；12：223-233，纳入本文作为参考)。移植藻酸盐基组织构建物可用于治疗许多疾病。藻酸盐可用于将细胞截留在微珠中，从而保护细胞免受宿主的免疫攻击和物理性应力。(Skjk-Brk G和T.Espevik，同上；Strand BL等，同上；Yang H等，CellEncapsulation Technology and Therapeutics.Boston，Birkhauser，1999：第3-17页；Uludag H，等，Adv Drug Deliv Rev 2000；42：29-64；Orive G，等，NatureMedicine 2003；9：104-107；Emerich DF和HC Salzberg，Cell Transplant 2001；10：3-24；Sambanis A，Diabetes Technol Ther 2000；2：81-89以及Lanza RP和DK Cooper，Molecular Medicine Today 1999；4：39-45，纳入本文作为参考)。在各种疾病，包括癌症、糖尿病、帕金森病、慢性疼痛和肝功能衰竭的治疗中，截留在藻酸盐珠中排出治疗分子的细胞可用作可植入生物反应器(Emeri ch DF和HCSalzberg同上；Lanza RP和DK Cooper同上；Wang T，等.Nat Biotechnol 1997；15：Read T-A，等.Nat Biotechnol 19：29-34；Cai J，等.Hepatology 2002；36：386-394；Canaple L，等.Ann N Y Acad Sci 2001；944：350-361；GlicklisR等《治疗用途的组织工程》(Tissue Engineering for Therapeutic Use)，Ikada Y，Okano T(编)，1999：第119-131页；Emerich DF.Cell Transplant 2002；11：1-3；Emerich DF.Neurosci Biobehav Rev 1992；16：437-447；Hagihara Y，等.CellTransplant 1997；6：527-530；Risbud MV和RR Bhonde J Biomater Sci PolymerEdn 2001；12：1243-1252，纳入本文作为参考)。因此，现在在开发治疗用途的生物反应器系统中，藻酸盐被广泛用作细胞或组织固定材料。
在其他类型的医学应用中，也将藻酸盐作为生物结构材料进行研究。根据制造工艺，藻酸盐可取各种形式，如糊状、海绵状、纤维状、条状和管状。将藻酸盐海绵作为细胞移植(Miralles G，等.Journal of Biomedical Materials Research 2001；57：以及Shapiro L和S.Cohen Biomaterials 1997；18：583-590，各自纳入本文作为参考)和神经再生(Sufan W，等.Journal of Neurotrauma 2001；18：329-338；Kataoka K，等.J Biomed Mater Res 200154：和Hashimoto T，等.Exp Brain Res2002；146：356-368，各自纳入本文作为参考)材料进行研究。而且，已将含有软骨细胞的藻酸盐糊剂注射入儿童，成功地治疗了尿道回流问题(Diamond DA和AACaldamone J Urol 1999；162：1185-1188，纳入本文作为参考)，而且将软骨细胞植入通过将胶凝溶液直接加入软骨缺损处原位胶凝的藻酸盐中是有前途的(Fragonas E，等.Biomaterials 2000；21：795-801，纳入本文作为参考)。
在涉及细胞与藻酸盐结构直接接触的应用中，细胞和藻酸盐基质之间的相互作用可能很重要。此外，关于具体的藻酸盐生物反应器系统，主要障碍可能是生产细胞的来源的选择和可用性。作为医学使用前即刻处理新鲜器官的替代方法，体外细胞生长作为生物反应器生产的无限制来源有些优点。可遗传操作这种细胞使其具有更佳特性和能够产生治疗性产物。
通常，对于截留在藻酸盐中的增殖细胞，必须以某种方式控制细胞生长。已确定，藻酸盐凝胶基质中的细胞生长依赖于凝胶网络的类型(Constantinidis I等.Biomaterials 1999；20：和Stabler C，等.Biomaterials 2001；22：各自纳入本文作为参考)，但生长也是细胞类型依赖的(Rokstad AM，等.Cell Transplant2002；11：313-324，纳入本文作为参考)。已显示，与强度较高，即古洛糖酸含量高的凝胶中截留的细胞相比，在古洛糖酸(guluronic acid)含量低的强度较低的藻酸盐凝胶中截留的细胞生长得较快(Constantinidis等.同上；和Stabler C，等.同上)。细胞生长和在凝胶网络中形成集落的结果是，珠可能破裂，细胞可能从珠中泄漏(Constantinidis等.同上；和Stabler CL，等.Ann N Y Acad Sci 2002；961：130-133，纳入本文作为参考)。因此，在藻酸盐珠中使用增殖细胞时的具体问题是细胞继续生长和增殖，珠破裂，以及细胞泄漏使细胞暴露于免疫系统。
动物细胞对邻近细胞和胞外基质的反应和相互作用是高度专门化的。这些反应受特定基因控制。已证明主要胶原(一种主要正常胞外基质组分)能抑制细胞进入凋亡，从而为细胞存活和分化提供基质(O’Connor SM，等.Neurosci Lett 2001；304：189-193，纳入本文作为参考)。然而，细胞和藻酸盐机制之间相互作用背后的分子机制仍不明了。
虽然截留细胞可在凝胶网络中形成球状集落，但近期也证明，细胞可附着在藻酸盐凝胶表面生长(Wang L，等.Biomaterials 2003；24：纳入本文作为参考)。已确定，体外大鼠骨髓细胞可以在藻酸盐凝胶表面上生长，无需对凝胶基质进行任何化学修饰(Wang L，等.同上)。与之前观察到的藻酸盐基质中的细胞生长相反，Wang等也发现与古洛糖酸含量低的藻酸盐凝胶相比，古洛糖酸含量高的藻酸盐凝胶上的增殖速率较高。然而，也发现成肌细胞不能在未进行化学修饰的藻酸盐表面上生长，而结合于藻酸盐基质的RGD肽序列允许细胞生长(Rowley JA等.Journal ofBiomedical Materials Research 2003；60：217-223；和Rowley JA，等.Biomaterials1999；20：45-53，纳入本文作为参考)。然而，这些工作人员也发现，在用古洛糖酸含量高的藻酸盐制成的藻酸盐凝胶上成肌细胞增殖得最好。
在涉及将藻酸盐珠植入动物的应用中，另一常见问题是成纤维细胞和巨噬细胞在所选珠表面上的生长(Vandenbossche GMR等.J Pharm Pharmacol 1993；45：115-120；Rokstad AM，等.Ann N Y Acad Sci 2001；944：216-225；和Siebers U，等.Journal of Molecular Medicine 1999；77：215-218，各自纳入本文作为参考)。在植入其它外来物体如装置时也发生这个问题。因此，明确需要关于与藻酸盐基质接触的细胞生长和粘附行为的更多知识。
需要提供包含截留在藻酸盐中的增殖细胞的组合物和这种组合物的使用方法，其中细胞的生长和增殖受到控制，从而防止珠破裂、细胞泄漏和随后的免疫反应。
需要包含截留在藻酸盐中的细胞的组合物和这种组合物的使用方法，其中细胞排出治疗分子。
需要包含截留在藻酸盐中的细胞的组合物和这种组合物在治疗疾病中的使用方法。
需要提供可植入组合物和装置，以及这种可植入组合物和装置的使用方法，其中不需要的宿主细胞在所述可植入组合物和装置表面上的生长受到控制。
发明概述
本发明涉及抑制多种增殖细胞增殖的方法。该方法包括将该细胞维持在含有藻酸盐聚合物和锶的藻酸盐基质中的步骤。
本发明也涉及在人体中抑制组合物上细胞生长的方法。该方法包括将该组合物维持在人体内的步骤。该组合物包含含锶的藻酸盐凝胶。
本发明也涉及在动物中抑制组合物上细胞生长180天或更长时间的方法。该方法包括将该组合物维持在动物体内180天或更长时间的步骤。该组合物包含含锶的藻酸盐凝胶。
本发明也涉及在动物中抑制装置上细胞生长的方法。该方法包括将该装置维持在动物体内的步骤。该装置包含含锶的藻酸盐凝胶。
本发明也涉及外表面上具有含锶的藻酸盐基质的装置。
本发明也涉及用藻酸盐基质涂覆或覆盖无细胞组合物或装置的外表面的方法。该方法包括首先用藻酸盐溶液覆盖或涂覆无细胞组合物或装置或其组件的步骤，继续或随后通过浸没、沉入、喷洒、雾化或其它技术施加二价交联离子，从而使涂覆该装置的藻酸盐溶液的藻酸盐聚合物通过二价交联离子交联，形成涂覆了藻酸盐基质的装置。本发明也涉及包含藻酸盐体的组合物，该藻酸盐体的外表面上包被着单层细胞。该藻酸盐体含有钙、钡、锌和铜的一种或多种。
本发明也涉及表面上含有单层细胞的藻酸盐片层。该藻酸盐片层含有钙、钡、锌或铜的一种或多种。
本发明也涉及制备人造组织的方法。该方法包括培养多个细胞片层，各细胞片层在包含含有藻酸盐聚合物和钙、钡、锌和铜的一种或多种的藻酸盐基质的片层上包含单层细胞，通过将一细胞片层的底部置于另一细胞片层的细胞上堆积细胞片层，将堆积的细胞片层维持在一定条件下使各片层的藻酸盐基质溶解，从而使各单层细胞与至少另一层单层细胞直接接触，产生具有多层细胞的组织。
附图简要说明
图1显示封装在藻酸钙(左)和藻酸锶(右)珠中约1.5月的HEK293 Endo细胞的光学显微镜图像。
图2显示截留在藻酸钙(左)和藻酸锶(右)珠中培养约2.5月后的MDCK细胞的光学显微图像。所有藻酸钙珠被附着细胞完全覆盖。对于藻酸锶珠而言，在珠中可见单细胞和细胞聚集体。
图3显示作为封装到藻酸钙和藻酸锶珠中后的时间的函数的MDCK细胞过渡生长的珠所占分数的图。也对不完全过渡生长的藻酸钙珠的数量计数。
图4是在PRONOVA UP LVG藻酸盐珠中4周后的HEK 293Endo细胞的光学显微图。在珠中心可见生长细胞的大集落(球形)。球形中心最终会坏死。右下方的珠显示出细胞在珠表面和下表面上生长。
图5显示含有MDCK细胞的藻酸钙(PRONOVA SLG)珠的图。在一个珠上(下方)，细胞已完全覆盖了表面，而表面上的其它生长仍未开始。
图6显示在藻酸盐珠中4-6月后的MDCK细胞的图。细胞被截留在1.8％PRONOVAUP LVG藻酸盐的50mM CaCl2(左)和50mM SrCl2(右)溶液中。对截留在藻酸钙的细胞而言，100％的珠完全被球形单层细胞覆盖，而其它珠没有在其表面上附着有细胞。虽然珠仍然完整，但一些细胞增殖似乎在这些珠内部发生。
图7显示截留在较大藻酸盐珠中的藻酸钙珠上的球形单层MDCK细胞的图。
优选实施方式详述
本发明起因于证明用于产生藻酸盐基质的二价阳离子类型对与这种藻酸盐基质接触的细胞增殖有影响的发现。这些发现允许设计和产生特定组合物和装置，这些组合物和装置根据抑制或支持细胞增殖的需要包括特定类型的藻酸盐基质。本发明的一些方面提供了与抑制细胞增殖的藻酸盐基质相关的组合物和装置及其用途。本发明的一些方面提供了与促进控制的细胞生长、从而可以单层细胞来培养和维持细胞的藻酸盐基质相关的组合物和装置及其用途。
根据本发明涉及细胞增殖抑制的方面的一些实施方式，封装在藻酸盐基质内的细胞的增殖可被抑制，以防止在藻酸盐基质内维持增殖细胞相关的问题，尤其是当这种封装在藻酸盐基质中的增殖细胞植入动物中时产生的问题。相似地，可通过接受者自身细胞抑制细胞增殖以防止长时间留在接受者体内的植入组合物和装置上移植物生长过度。抑制细胞生长过度克服了使用可植入组合物和装置相关问题，并提供了改进的组合物、装置和方法。
据发现，藻酸盐基质中锶的存在抑制了细胞增殖，而不影响细胞活力。此发现提供了在令人惊讶的长时间中在这种基质中抑制增殖细胞增殖的方法，并提供了抑制细胞增殖以防止植入组合物和装置上细胞生长过度的方法，以致于这些组合物和装置可在令人惊讶的长时间中维持在接受者体内。
在意图将物质分泌到接受者体内的细胞被封装在藻酸盐基质中的可植入组合物的情况下，锶的存在抑制了接受者体内细胞生长过度，它(如果存在)可防止物质从组合物分泌到接受者体内。通过防止生长过度，从组合物的分泌可随时间无阻碍地继续。
防止含有封装在藻酸盐基质中的活细胞的组合物中细胞生长过度也允许基质中的细胞继续获得在令人惊讶的长时间中延续其活力所必需的营养和物质。
在组合物是封装增殖细胞的藻酸盐基质的实施方式中，锶的存在抑制封装细胞的增殖，已知这会引起许多问题，使这种组合物不能长期使用。本文所用“增殖细胞”指能够在缺少锶的维持条件下连续和重复地进行细胞分裂的细胞，锶的存在会有效抑制细胞增殖。抑制连续的细胞增殖防止破坏基质的完整性和随后细胞泄漏到体内。因此，本发明的一些实施方式提供了允许含有增殖细胞的组合物在令人惊讶的长时间中维持在接受者体内而不破坏基质和泄漏细胞的方法。
用含有锶的藻酸盐基质抑制细胞增殖提供了抑制细胞在植入装置和组合物上过度生长的方法，从而克服了与使用植入装置和组合物相关的问题。提供了改进装置和使用该装置的改进方法。提供了改进装置，如在外表面上具有含锶藻酸盐基质的装置，和使用这种组合物的方法。这些装置尤其有用，因为它们的用途的特征是抑制了与许多植入装置有关的细胞生长过度，以及这种细胞生长过度的问题和不良后果。改进的组合物包括如上所述包含封装在藻酸盐基质中的细胞的组合物，以及无细胞组合物如含有藻酸盐基质或由藻酸盐基质组成的组合物，同时也提供了使用这种组合物的方法。在一些实施方式中，组合物包含封装从植入组合物分泌到体内的药物或蛋白质的藻酸盐基质。在一些实施方式中，组合物可用作填充剂，用于(例如)提供可在需要支持、装入或整合于装置和组织时占据空间的生物相容性材料。
根据本发明的一些实施方式，提供了抑制多数增殖细胞增殖的方法。该方法包括将增殖细胞维持在含有藻酸盐聚合物和锶的藻酸盐基质中的步骤。在一些优选实施方式中，将封装细胞维持在动物体内。在一些实施方式中，该动物是哺乳动物，优选人、啮齿类如小鼠或大鼠，或牛、羊、马、犬或猫科动物。在一些实施方式中，该动物是鱼或鸟类。在一些实施方式中，将该细胞维持在藻酸盐基质中至少7天，优选至少30天，在一些实施方式中至少60天，在一些实施方式中至少90天，更优选至少180天，更优选1年或更长时间。在优选实施方式中，将藻酸盐基质中的细胞维持在动物体内至少7天，优选至少30天，在一些实施方式中至少60天，在一些实施方式中至少90天，更优选至少180天，更优选1年或更长时间。在一些实施方式中，将藻酸盐基质中的细胞维持在植入装置如可维持在动物体内的容器中。在一些实施方式中，维持在可植入装置中的藻酸盐基质中的细胞可被维持至少7天，优选至少30天，在一些实施方式中至少60天，在一些实施方式中至少90天，更优选至少180天，更优选1年或更长时间。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的增殖细胞在封装在藻酸盐基质中的藻酸盐体的外表面上附着成单层。在一些实施方式中，该藻酸盐体包含藻酸盐聚合物和钙。在一些实施方式中，该藻酸盐体包含藻酸盐聚合物以及钙、钡、锌和铜中的一种或多种。
根据本发明的一些实施方式，提供了抑制人体内包含多数细胞的组合物的外表面上的细胞生长7天或更多天的方法。该方法包括将组合物维持在人体内7天或更多天的步骤，其中该组合物包含封装在含锶藻酸盐基质中的多数细胞。该细胞可以是增殖细胞、非增殖细胞或其组合。在一些实施方式中，将该组合物维持在人体内1年或更长时间。
根据本发明的一些实施方式，提供了在动物体内在含有多数细胞的组合物的外表面上抑制细胞生长至少180天的方法。该方法包括将该组合物维持在动物体内7天或更多天的步骤，其中该组合物包含封装在含锶藻酸盐基质中的多数细胞。该细胞可以是增殖细胞、非增殖细胞或其组合。在一些实施方式中，将该组合物维持在动物体内1年或更长时间。
在细胞封装在藻酸盐基质中的一些实施方式中，该基质通常是球形。在一些实施方式中，该基质是不规则形状。通常，藻酸盐基质必须足够大，以容纳有效数量的细胞，同时也足够小，以使基质外表面的表面积相对于基质内容量足够大。在本文中，藻酸盐基质尺寸通常表示基本是球形的基质，尺寸表示为最大横截面度量。在球形基质的情况下，此横截面度量是直径。在一些实施方式中，藻酸盐基质是球形，其尺寸为约20-1000μm。在一些实施方式中，藻酸盐基质的尺寸小于100μm，例如20-100μm；在一些实施方式中，藻酸盐基质的尺寸大于800μm，例如800-1000μm。在一些实施方式中，藻酸盐基质的尺寸约为100μm，在一些实施方式中，藻酸盐基质的尺寸约为200μm，在一些实施方式中，藻酸盐基质的尺寸约为300μm，在一些实施方式中，藻酸盐基质的尺寸约为400μm，在一些实施方式中，藻酸盐基质的尺寸约为500μm，在一些实施方式中，藻酸盐基质的尺寸约为600μm，在一些实施方式中约为700μm。
在细胞封装在藻酸盐基质中的一些实施方式中，封装细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞。在封装细胞是非增殖细胞的一些实施方式中，非增殖细胞可选自但不限于：郎格罕氏岛(pancreatic islet)、肝细胞、神经细胞、肾皮质细胞、血管内皮细胞、甲状腺和副甲状腺细胞、肾上腺细胞、胸腺细胞、卵巢细胞和最初来源(primaryorigin)的其它细胞类型。在封装细胞是增殖细胞的一些实施方式中，增殖细胞可衍生自建立的细胞系，例如但不限于：HEK293、MDCK和C2C12细胞系。在一些实施方式中，封装细胞包含编码在维持细胞时表达的一种或多种蛋白的表达载体。在一些实施方式中，该蛋白是细胞因子，生长因子，胰岛素或新生血管发生抑制剂如血管抑制素或内皮抑制素。因为凝胶网络的多孔性，分子量较低，小于约60-70kD的蛋白质是特别好的候选物。在一些实施方式中，封装细胞在封装在藻酸盐基质中的藻酸盐体的外表面上附着成单层。在一些实施方式中，该藻酸盐体包含藻酸盐聚合物和钙。
根据本发明的一些实施方式，提供了在动物体内在无细胞组合物的外表面上抑制细胞生长7天或更多天的方法。该方法包括将无细胞组合物维持在动物体内的步骤，其中该组合物包含含锶的藻酸盐基质。在一些实施方式中，无细胞组合物包含封装在藻酸盐基质中的药物。在一些实施方式中，无细胞组合物包含封装在藻酸盐基质中的蛋白质。在一些实施方式中，无细胞组合物是组织填充移植物。在一些实施方式中，无细胞组合物是基本上由藻酸盐聚合物和锶组成的组织填充移植物。
根据本发明的一些实施方式，提供了在动物体内在装置的外表面上抑制细胞生长的方法。该方法包括将该装置维持在动物体内的步骤，其中将含锶藻酸盐基质沉积在该装置的外表面上。在一些实施方式中，该装置选自：移植片固定模(stent)、心脏起搏器、导管、可植入修复假体、外科用螺钉、外科用金属线、组织填充移植物、食道回流抑制性移植物、失禁抑制性移植物、肾回流抑制性移植物、适用于支撑沉积在表面外和/或用藻酸盐基质封装的细胞的容器如固态装置或大胶囊、乳房移植物、颌移植物、颊移植物、胸移植物、臀肌移植物和牙移植物。
在一些优选实施方式中，将无细胞组合物或装置维持在哺乳动物优选人、啮齿类如小鼠或大鼠，或牛、牛、羊、马、犬或猫科动物体内。在一些实施方式中，该动物是鱼或鸟类。在一些实施方式中，将该装置维持在动物体内至少7天，优选至少30天，更优选至少60天，更优选至少90天，更优选至少180天，更优选1年或更长时间。
本发明也涉及在外表面上沉积了含锶藻酸盐基质的可植入装置。在一些实施方式中，该装置选自：移植片固定模(stent)、心脏起搏器、导管、修复假体、外科用螺钉、外科用金属线、组织填充移植物、食道回流抑制性移植物、失禁抑制性移植物、肾回流移植物、适用于支撑沉积在表面外和/或用藻酸盐基质封装的细胞的容器如固态装置或大胶囊、乳房移植物、颌移植物、颊移植物、胸移植物、臀肌移植物和牙移植物。
本发明涉及用藻酸盐基质涂覆或覆盖无细胞组合物或装置的外表面的方法，该方法包括首先用藻酸盐溶液涂覆或覆盖无细胞组合物或装置或其组件的步骤，继续或随后通过浸没、沉入、喷洒、雾化或其它技术施加二价交联离子如钙、钡、铜、锌或锶，从而使涂覆该装置的藻酸盐溶液的藻酸盐聚合物通过二价交联离子交联，形成涂覆了藻酸盐基质的装置。在这些实施方式中，用于起始涂覆或覆盖的藻酸盐溶液应有足够粘度，以有效涂覆或覆盖该无细胞组合物或装置。在一些实施方式中，起始覆盖或涂覆在水合(湿)状态中进一步交联。在一些实施方式中，起始覆盖或涂覆在与交联离子反应之前先干燥。
涉及抑制细胞增殖的本发明的这些各个方面各自提供含锶的藻酸盐基质。在一些实施方式中，藻酸盐基质起初基本不含钙、钡、锌和铜的一种或多种。在一些优选实施方式中，藻酸盐基质中的二价阳离子是锶。在一些优选实施方式中，藻酸盐基质基本上由藻酸盐聚合物和锶组成。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物含有50％以上的α-L-古洛糖酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物含有60％以上的α-L-古洛糖酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物含有60％-80％的α-L-古洛糖酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物含有65％-75％的α-L-古洛糖酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物含有70％以上的α-L-古洛糖酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物的平均分子量为20-500kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物的平均分子量为50-500kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物的平均分子量为100-500kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质不含聚阳离子氨基酸。
已发现，用含有钙、锌和钡的一种或多种的藻酸盐基质可将粘附于藻酸盐基质表面的细胞维持为单层。此发现提供的本发明方面涉及由藻酸盐基质组成的藻酸盐体和表面粘附了细胞单层的藻酸盐基质片层以及使用此种藻酸盐体和藻酸盐片层的方法。已发现，粘附于这种藻酸盐体和藻酸盐片层的细胞可作为单层稳定维持。藻酸盐体和藻酸盐片层提供了维持、传代和处理细胞的稳定平台。藻酸盐体和藻酸盐片层可包含多数作为单层粘附于表面的非增殖细胞，这有利于处理、有效维持、在体积中分散得更规则和防止这些细胞聚集。而且，这些藻酸盐体和藻酸盐片层可用于将细胞保持在非常高的密度，在保持细胞活力的情况下仍能进行营养物的交换，从而提高治疗产物的排出效率。在藻酸盐表面上培养和维持细胞单层可用于提供特定形状的细胞/基质组合物。此外，通过以单层培养细胞，可以最佳方式安排细胞，以使细胞在非常高的浓度下保持活力。在一些实施方式中，将细胞掺入或一起用于装置或大胶囊。通过在藻酸盐表面上以单层维持细胞，可在该装置或大胶囊中更佳地安排细胞。这尤其可用于体积小，细胞密度的优化很重要的装置。
包含多数增殖细胞的藻酸盐体和藻酸盐片层与包含非增殖细胞的优点相同，额外优点是允许单层细胞的增殖更受控制。
在一些实施方式中，组合物包含在藻酸盐体的外表面上有单层细胞的藻酸盐体，其中藻酸盐体包含钙、钡、锌和铜的一种或多种。在一些实施方式中，藻酸盐体通常是球形，藻酸盐体的尺寸为600μm以下，在一些实施方式中500μm以下，在一些实施方式中400μm以下，在一些实施方式中300μm以下，在一些实施方式中200μm以下，在一些实施方式中100μm以下。
在一些实施方式中，该细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞。在一些实施例中，细胞是非增殖细胞，优选选自但不限于：干细胞、郎格罕氏岛、肝细胞、神经细胞、肾皮质细胞、血管内皮细胞、甲状腺和副甲状腺细胞、肾上腺细胞、胸腺细胞和卵巢细胞。在一些实施方式中，该细胞是增殖细胞如衍生自建立的细胞系，如HEK293、MDCK和细胞系的细胞。在一些实施方式中，该细胞包含编码在维持细胞时表达的蛋白的表达载体。在一些实施方式中，该蛋白是细胞因子，生长因子，胰岛素或新生血管发生抑制剂如血管抑制素或内皮抑制素。
在一些实施方式中，将该藻酸盐体封装在藻酸盐基质如包含藻酸盐聚合物和锶的藻酸盐基质中。在一些实施方式中，用增殖细胞培养成单层，然后转化为终末分化状态或其它非增殖状态。在一些实施方式中，可植入装置中包含粘附有单层细胞的藻酸盐体。
在本发明的一些实施方式中，将包含在含有藻酸盐聚合物和锶的藻酸盐基质中的封装细胞掺入用含有藻酸盐聚合物和锶的藻酸盐基质任选地涂覆的可植入装置中。在一些这种实施方式中，藻酸盐基质中的细胞以单层粘附于优选包含藻酸盐聚合物和钙、钡、锌、铜和/或镁的藻酸盐体的外表面。用于这些实施方式的细胞优选选自以下细胞：干细胞、郎格罕氏岛、肝细胞、神经细胞、肾皮质细胞、血管内皮细胞、甲状腺和副甲状腺细胞、肾上腺细胞、胸腺细胞、卵巢细胞、HEK293细胞、MDCK细胞和C2C12细胞。在一些实施方式中，该细胞包含编码在维持细胞时表达的蛋白如细胞因子、生长因子、胰岛素或新生血管发生抑制剂如血管抑制素或内皮抑制素的表达载体。
在本发明的一些实施方式中，将包含封装的胰岛素生产细胞如郎格罕氏岛细胞(包含在含有藻酸盐聚合物和锶的藻酸盐基质中)的可植入装置用于治疗患有糖尿病的个体。将允许物质在其内部和外部转移的该装置植入个体并维持，装置内的细胞产生和释放胰岛素，进入该个体体内。在一些这种实施方式中，用含有藻酸盐聚合物和锶的藻酸盐基质涂覆可植入装置。在一些这种实施方式中，包含在藻酸盐基质中的胰岛素生产细胞以单层粘附于优选含有藻酸盐聚合物和钙、钡、锌、铜和/或镁的藻酸盐体的外表面。
在一些实施方式中，组合物包含藻酸盐片层，藻酸盐片层表面上含有单层细胞，其中藻酸盐片层包含钙。在一些实施方式中，该细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞。在一些实施例中，细胞是非增殖细胞，优选选自但不限于：干细胞、郎格罕氏岛、肝细胞、神经细胞、肾皮质细胞、血管内皮细胞、甲状腺和副甲状腺细胞、肾上腺细胞、胸腺细胞和卵巢细胞。在一些实施方式中，该细胞是增殖细胞如衍生自建立的细胞系，例如但不限于HEK293、MDCK和细胞系的细胞。在一些实施方式中，该细胞包含编码在维持细胞时表达的一种或多种蛋白的表达载体。在一些实施方式中，提供了制备人造组织的方法。培养多数细胞片层，其中各细胞片层在包含含有藻酸盐聚合物和钙的藻酸盐基质的片层上包含单层细胞。通过将一细胞片层的底部置于另一细胞片层的细胞上堆积细胞片层。将堆积的细胞片层维持在一定条件下使各片层的藻酸盐基质溶解，从而使各单层细胞至少与另一层单层细胞直接接触，产生具有多层细胞的组织。在一些实施方式中，多个细胞片层包含多片层上皮细胞。在一些实施方式中，多个细胞片层还包括一层或多层成纤维细胞。在一些实施方式中，多个细胞片层包含多层肝细胞。在一些实施方式中，多个细胞片层还包括一层或多层岛细胞。在一些实施方式中，所用细胞是干细胞。根据一些实施方式，将上皮组织构建为人造皮肤。将上皮细胞(角质形成细胞等)层加在结缔组织(成纤维细胞)层上，用于为患者替换损伤的皮肤。
涉及在藻酸盐体或片层上维持细胞单层的本发明的这些各个方面提供了包含钙、钡、锌和铜的一种或多种的藻酸盐基质。在一些实施方式中，藻酸盐基质基本不含锶。在一些优选实施方式中，藻酸盐基质中的二价阳离子由钙组成。在一些优选实施方式中，藻酸盐基质基本上由藻酸盐聚合物和钙组成。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物是50％以上的α-L-古洛糖酸单体。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物含有60％以上的α-L-古洛糖酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物是60％-80％的α-L-古洛糖酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物含有70％以上的α-L-古洛糖酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物含有65％-75％的α-L-古洛糖酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物的平均分子量为20-500kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物的平均分子量为50-500kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质的藻酸盐聚合物的平均分子量为100-500kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质不含聚阳离子氨基酸。
实施例
实施例1
在这项工作中，我们研究了截留在藻酸盐珠中的细胞培养物，并观察了它们随时间在珠中和珠表面上的生长。我们发现，细胞生长可发生在珠表面上，细胞可以球形单层覆盖珠，而且此过程是依赖胶凝离子的。这些发现可能提示了细胞和藻酸盐基质之间相互作用背后的机制。
材料和方法
细胞培养物和封装方法
采用人HEK293Endo细胞(胚肾细胞，转染以生产内皮抑制素)和犬MDCK细胞(衍生自成年雌性考克斯班尼犬的外观正常的肾)。将该细胞常规培养成单层细胞培养物，每周再培养3次。各实验中，胰蛋白酶处理细胞，与1.8％PRONOVA SLG 20藻酸盐溶液混合，并用静电珠发生器(bead generator)将其截留在藻酸盐珠中，如KlokkTI和JE Melvik，J Microencapsulation 2002；19：415-424所述，纳入本文作为参考。用0.35mm外径的喷嘴，并在6kV/cm的静电势下、以约1cm的喷嘴尖和胶凝浴间距操作珠发生器，制成大小约为400μm的珠。在胶凝期间用甘露醇作为渗透质(osmolyte)而尽可能避免钠离子的存在，以获得性质更好的不均一珠(Strand BL，等.Biotechnol Bioeng 2003；82：386-394，纳入本文作为参考)。所用胶凝溶液含有50mM CaCl2、SrCl2或BaCl2。胶凝后，将珠转移到细胞培养瓶中，加入正常细胞生长培养基。生长培养基每周换2-3次，也将珠定期转移到新培养瓶中，以避免从珠中释放的细胞在培养瓶生长面上广泛生长。用光学或荧光显微术随时间跟踪珠和细胞生长。
截留细胞的活死染色
用LIVE/DEAD活力/细胞毒性试剂盒(Molecular Probes，Oregon，USA)进行活细胞和死细胞的检测。如试剂盒中的方法所述进行细胞染色。检测来自酯酶-转化的钙黄绿素的绿色荧光，这是活细胞指标，而同时检测来自溴化乙锭染色死细胞(细胞膜泄漏)的红色荧光。用成像显微术观察含有细胞的藻酸盐珠。
结果
将人HEK293Endo细胞和犬MDCK细胞封装在不含任何涂覆物质的藻酸钙和藻酸锶珠中，在光学显微镜下随时间进行目测。两种细胞系的生长行为明显不同。仅数天后，可观察到珠内的细胞生长，在HEK293Endo细胞中更加明显。在珠内生成大的细胞聚集体，不到一个月以后，可观察到珠外的细胞生长。图1显示HEK293Endo细胞在藻酸锶和藻酸钙珠中培养1.5个月后的图像。在珠内的细胞增殖明显依赖于胶凝离子，因为在含有锶离子的珠内细胞加载(cell load)较少。在两种培养物中都发生细胞泄漏，因为细胞集落粘附于细胞培养瓶底部并在此产生集落。然而，在藻酸钙珠中，细胞也能够在一些珠的表面上生长，也可观察到或多或少有些松散地粘附于珠的细胞聚集体。然而，在藻酸锶珠上没有观察到这种细胞生长过度。
对于截留在藻酸盐珠中的MDCK细胞而言，增殖速率比HEK293Endo细胞慢得多。在这个实验(图2)中，将细胞以2×106个细胞/毫升的浓度截留在350μm藻酸锶或藻酸钙珠中。数天后，可在两种类型珠中观察到细胞生长，这在钙珠中更为明显。一些MDCK细胞也从这两种珠类型中逃逸，并在细胞培养瓶表面上产生集落。同时，对于这些细胞而言，还有一个主要区别是在藻酸钙和藻酸锶珠的珠表面上的细胞生长。图2显示了含有MDCK细胞的两种藻酸盐凝胶珠在培养约2.5个月后的图像。在这个阶段，所有藻酸钙珠被细胞完全覆盖，而锶珠上没有显示出任何细胞生长过度。这两种细胞类型的珠表面生长行为明显不同，MDCK细胞以单层覆盖在钙珠表面上，而HEK293Endo细胞还生长为大的或多或少有些松散地附着于珠表面生长的聚集体。
在光学显微镜中可以容易地观察到珠上的细胞生长过度。通过对有限数量的珠计数，特征鉴定珠表面的细胞生长模式(图3)。也注意到珠上被细胞完全覆盖或仅部分覆盖。如图3所示，藻酸钙珠上的细胞生长发生在约3周后，粘附有细胞的珠的分数迅速增加，直到封装后约40天所有珠被细胞覆盖。在实验期间，某一时刻仅有至多约25％的藻酸钙珠被细胞不完全覆盖。这与在珠表面一开始生长，细胞就快速生长过度相一致。我们在单独实验中对珠观察了5个月以上。观察到藻酸钙珠仍然被完整的球形单层MDCK细胞所覆盖，而锶珠在表面上没有显示出任何细胞生长。
我们也通过将新空珠加入细胞培养物中，测试了来自被细胞覆盖的珠的细胞是否能够转移并附着于空珠。观察珠数周，未发现任何细胞转移到新珠上的迹象(图片未显示)。
也通过细胞的“活/死”染色和成像技术研究珠内和珠表面上的细胞生长。在此实验中，在活细胞中的胞内酯酶-转化的钙黄绿素发出绿色荧光，而溴化乙锭染色的死细胞(细胞膜泄漏)发出红色荧光。显示了整个珠上一部分的共聚焦荧光图像。因此，在该图像中仅显示了珠中荧光细胞的一部分(图片未显示)。对于藻酸钙珠而言，清楚地观察到球形单层活细胞，而在珠中心的细胞已死亡。珠中坏死的原因可能解释为由于球形单层细胞的消耗，氧气和其它营养物质耗尽。相反，藻酸锶珠没有被细胞覆盖并含有活细胞。然而，应注意，锶珠中的大细胞集落也随时间产生中心坏死的细胞聚集体。
讨论
采用良好定义的杂质水平非常低的药品级藻酸盐(Dornish JM等.Y Acad Sci2001；944：388-397和Skaugrud等.Biotechnol Genet Eng Rev 1999；16：23-40，各自纳入本文作为参考)。因此，通常在大部分商品藻酸盐中以较高或未知量存在的内毒素或其它杂质不大可能对观察结果产生任何影响(Skaugrud等.同上)。
这两种细胞系的细胞在藻酸盐凝胶网络中的生长模式明显不同(图1和2)。虽然MDCK细胞在单层培养物中更快地生长，但是与HEK293Endo细胞相比，在凝胶网络中的生长较慢。以前也报道过类似差异(Rokstad AM等.同上)。然而，与钙珠相比，锶凝胶网络的较高强度在较长时间中维持了含有两种封装细胞系的珠的完整性。藻酸盐网络微结构的强度可能直接影响细胞的生长速率(Rokstad AM，等.同上和Stabler CL和A Sambanis同上)。由于细胞增殖以及凝胶和生长培养基之间的离子交换，凝胶网络的强度也可随时间改变(Rokstad AM等.同上；Smidsrd O和GSkjk-Brk TIBTECH 1990；8：71-78；和Read T-A等.Int J Devl Neuroscience1999；17：653-663，各自纳入本文作为参考)。也说明存在降解凝胶网络的酶机制(Rokstad AM，等.同上)。与藻酸钙凝胶相比，藻酸锶凝胶在胶凝离子浓度低的溶液中较不易于随时间降解。一些珠的破坏以及细胞通过凝胶网络生长和运动的结果是，细胞有可能从不同珠中释放。
两种细胞系的细胞在珠表面的生长模式也高度不同。虽然HEK293Endo细胞或多或少地粘附在珠上生长(图1)，但MDCK细胞以完整球形单层覆盖珠(图2)。MDCK细胞明显强烈地粘附于藻酸钙珠表面，如共聚焦成像所示。紧密粘附于钙珠表面说明锚定依赖性生长涉及特定粘附机制。而且，在锶凝胶表面没有生长说明在凝胶网络中特定胶凝离子的存在很重要。这可直接涉及胶凝离子单独存在或凝胶结构的差异。Attramdal A.Journal of Peridontal Research 1969；4：281-285(纳入本文作为参考)支持了胶凝离子的重要性，他观察到与钙离子相反，锶离子不支持细胞与玻璃表面的粘附。现在也熟知，正常细胞粘附于胞外基质或细胞依赖于膜蛋白如整联蛋白和钙调蛋白。而且，已知这些细胞膜粘附蛋白也依赖二价阳离子以进行基材粘附(Hynes RO.Cell 2002；110：673-687，纳入本文作为参考)。虽然不希望本发明受限于任何具体理论，但二价离子依赖性锚定机制参与细胞与钙凝胶表面的粘附似乎是一个合理的解释。虽然锶离子的化学特性与钙离子相似，但锶凝胶网络可能不支持细胞粘附机制。五个月以后，在锶珠上没有观察到粘附的细胞，而活细胞仍然完全覆盖所有的钙珠。
约3周后，MDCK细胞开始在藻酸钙珠表面生长出来(图3)。此相对长的珠表面没有任何生长的起始时间令人惊讶。同时，在珠表面的生长时间短，如部分生长过度的珠的分数低所反映。这说明在珠表面上的一些起始机制和快速生长速率。这些观察结果的解释可能包括一些细胞适应机制，但也可能涉及凝胶网络中由钙释放引起的改变(Smidsrd O和G Skjk-Brk同上)。观察到被细胞覆盖的珠不将细胞转移到空珠表面说明需要凝胶表面的一些破坏或细胞和凝胶表面之间强烈的起始接触来进行生长启动。
Wang等(同上)也报道了在藻酸盐表面上的生长，他发现与古洛糖酸含量低相比，在古洛糖酸含量高的藻酸盐上生长得更好。他提出，两种类型的凝胶之间的凝胶结构和强度的不同可解释这种差异。也报道了RGD修饰的藻酸盐中的相似结果(RowleyJA和DJ Mooney DJ同上)。与古洛糖酸含量低的藻酸盐相比，在古洛糖酸含量高的藻酸盐上生长得更好，这也可能受古洛糖酸含量高的藻酸盐凝胶网络中存在的含量较高的钙可促进细胞粘附和生长得更强的事实影响。初步观察也显示与古洛糖酸含量低的藻酸盐相比，HEK 293 Endo细胞在由古洛糖酸含量高的藻酸盐制成的藻酸盐珠上生长得更快。
大家都观察到成纤维细胞和巨噬细胞在植入动物的空藻酸盐珠表面上的生长(Vandenbossche GMR等.同上；Rokstad AM等(2001)同上；Siebers U等同上)。在一些情况下，宿主对植入珠的反应很可能是藻酸盐表面作为宿主细胞的生长基材的效果，而不是对植入珠的不良免疫相关反应的启动。在藻酸盐凝胶中用锶作为胶凝离子会得到优点以避免细胞生长过度。之前在封装应用中已经提示了锶的用途，因为它具有良好的生物相容性和较高的凝胶强度(Wideroe H和S Danielsen.DieNaturwissenschaften 2001；88：224-228.44，纳入本文作为参考)，本文中显示锶抑制细胞增殖的数据提供了用此胶凝离子时的额外的意想不到的好处。锶珠的活/死分析清楚地显示，培养数月后珠中存在活细胞。
细胞在藻酸盐表面上的生长保持着令人感兴趣的作为支持细胞生长的架构材料的应用中的潜力(Wang L，同上；Alsberg E，等.Proc Natl Acad Sci USA 2002；99：12025-12030；和Loebsack A，等.Journal of Biomedical Materials Research2001；57：575-581，各自纳入本文作为参考)。细胞以单层在藻酸盐表面上生长可能用于控制增殖细胞的生长和避免坏死。粘附于藻酸盐凝胶结构表面的铺满的单层细胞可能用于制造生产系统或组织构建物的不同应用。作为球形层粘附的细胞可保持非常高的密度，而仍能良好地交换营养物质、废产物以及产物。然而，对于涉及植入外来细胞的封装应用而言，可能需要额外的保护粘附细胞的涂覆程序或大胶囊，以使该技术的应用更实用。同时，截留在被细胞覆盖的藻酸盐珠中的细胞由于缺乏营养必将死亡。
实施例2
介绍
基于生物聚合物的组织构建物的移植在许多疾病的治疗中具有光明前景。生物相容性生物聚合物可用于将细胞截留在微珠中，从而保护该细胞免受宿主的免疫攻击和物理性应力。与其它聚合物相比，藻酸盐尤其具有良好的固定剂特性，该特性是形成可在生理相对温度下开发和安置的热稳定凝胶的能力。截留在藻酸盐珠中排出治疗分子的细胞在体内可用作治疗各种疾病，包括癌症、糖尿病、帕金森病、慢性疼痛和肝功能衰竭的生物反应器。因此，藻酸盐现在在开发治疗用途的生物反应器系统中广泛用作细胞或组织固定材料。
作为在医疗应用前即刻处理新鲜器官的替代方法，也可用细胞体外生长作为生物反应器系统的连续来源。可通过熟知的技术遗传操作这些细胞，以产生治疗产物，从而成为新生物反应器系统的开发中吸引人的候选物。研究了固定在藻酸盐珠上的不同的建立细胞系，结果列于本文。
方法
将体外正常培育为单层的来自不同建立细胞系的细胞截留到藻酸盐凝胶珠中，研究它们的生长行为。研究了以下细胞系：人HEK293Endo细胞(胚肾细胞，用于内皮抑制素生产)、人NHIK 3025细胞(原位宫颈癌)、犬MDCK细胞(衍生自成年雌性考克斯班尼犬的外观正常的肾)和小鼠C2C12细胞。首先将细胞与PRONOVA藻酸盐溶液混合，用静电珠发生器将其截留到选择尺寸的藻酸盐珠中。通过选择不同喷嘴和在约5kV/cm的静电势下操纵珠发生器制备范围在150-约600μm的不同尺寸的珠。在大多数实验中藻酸盐浓度为1.5或1.8％，在胶凝期间用甘露醇尽可能避免Na+的存在(不均一珠)。所用胶凝溶液大多数是50mM CaCl2或SrCl2，但也测试了BaCl2。胶凝后，将珠转移到单层细胞培养瓶中，加入正常细胞生长培养基。生长培养基每周换2-3次，定期将珠转移到新培养瓶中，以避免从珠中释放的细胞在培养瓶生长面上广泛生长。用光学或荧光显微镜或其它技术随时间跟踪珠和细胞生长。
结果和讨论
截留在藻酸盐珠中的细胞在长期体外培养中显示良好的活力，藻酸盐似乎对细胞没有不良影响。这与已发表的数据一致。同时，根据其它发表数据，观察到截留在藻酸盐凝胶中的细胞继续在凝胶中增殖。细胞在珠的大部分中形成集落，甚至长出珠外。图4显示截留在藻酸盐珠中约1个月后的HEK293 Endo细胞。如图所示，在珠中形成大球，细胞也长出珠外。珠外的一些细胞仍然粘附于珠表面或长出珠外成为细胞聚集体。细胞在藻酸盐珠内的增殖依赖于藻酸盐凝胶(即所用藻酸盐类型以及胶凝条件)。通常产生强度差的凝胶网络的古洛糖酸(G)含量低的藻酸盐中更容易进行细胞增殖。对于截留在高G藻酸盐中的细胞，第一天的细胞增殖非常有限。在一些起始生长延迟后(一般是2-3周)，细胞开始较快生长。这可能是由于在细胞生长培养基中胶凝离子(Ca2+)含量低的缘故，凝胶网络随时间减弱的结果。因此，胶凝离子从凝胶网络中丢失，从而使细胞增殖更容易。
显然，细胞在藻酸盐凝胶中增殖可能是涉及珠(或其它结构)植入人体或动物体的应用的一个问题，因为这种细胞增殖可能引起珠降解。也可预计细胞在体内开始生长出珠外，如果这样，外来细胞将暴露给宿主的免疫系统。此问题的解决如下。
研究了不同细胞系在藻酸钙珠中的生长行为，观察到在藻酸盐珠内及其表面上不同细胞的生长模式有一些明显差异。具体说，发现与研究的其它细胞系相比，MDCK细胞的生长模式的不同程度令人惊讶。观察到MDCK细胞在珠表面上生长为覆盖珠的球形单层，不在溶液中形成大的细胞聚集体。图5显示了两种藻酸盐珠的图片，一种珠被完整的球形单层细胞覆盖，另一种珠表面上没有生长。一般在生长期间能看到被细胞完全覆盖或未被细胞覆盖的珠。这说明，各珠的集落形成一旦开始后是快速的过程(约1-2天)。然而，细胞开始长出后几天，100％的珠被细胞完全覆盖。与研究的其它细胞系不同，MDCK细胞在珠表面上生长为规则的球形单层，没有产生或多或少地粘附于表面的大细胞聚集体。珠被细胞覆盖后，在珠外没有看到进一步的生长(铺满)。然而，观察到从珠上脱落的细胞能够增殖成正常单层，粘附于细胞培育表面。通过荧光技术和成像，显示球形单层中的细胞可存活5个月以上(整个测试期间)，而位于珠内的细胞大多数死亡。然而，出现一些增殖来替代从珠表面脱落的单个细胞是可能的。以球形单层粘附于藻酸钙珠的MDCK细胞处于生长抑制状态，在珠中或珠表面上没有任何扩张性增殖。
令人惊讶的是，发现似乎细胞仅在藻酸钙凝胶表面上生长，而不在用锶作为胶凝离子制备的凝胶上生长。截留在锶珠中的细胞甚至在培养几个月后也根本不在凝胶表面生长，而平行的钙珠中，细胞在一个月以内就完全覆盖了珠(图6)。对此的一种解释可能是细胞在藻酸钙表面上的生长直接是钙依赖的。对于截留在藻酸盐珠中的细胞而言，使用锶似乎比钙好，因为珠内的细胞增殖更加受限，也因为细胞在该珠表面不生长。然而，锶珠中的细胞活力仍然良好。
可将被球形单层细胞覆盖的藻酸盐珠再次截留到较大藻酸盐珠或其它凝胶结构(包括用其它生物材料和/或装置封装或包含)中，以进一步保护细胞(图7)。珠可涂有一层或多层藻酸盐或其它生物聚合物材料。因此，这种控制细胞生长的原理可用于制造体内或其它应用的生产系统的不同应用。以球形单层粘附的细胞可具有非常高的细胞数量/珠体积浓度，细胞也可良好地进行营养物交换和产生物质。
通常观察到植入动物的藻酸钙珠被来自宿主的细胞(淋巴细胞、成纤维细胞等)完全覆盖。这最终导致截留细胞因为缺少营养物质而死亡。根据生长细胞的体外观察结果，在珠表面的这种生长是离子依赖的，可能不涉及宿主的不良(免疫)反应。用锶胶凝的纯藻酸盐珠将不被成纤维细胞覆盖，因此也“较生物相容”。熟知细胞粘附蛋白是钙依赖性的(钙调蛋白等)。因此，可能与凝胶网络相关的钙通过与钙结合蛋白结合促进细胞粘附。
小结
观察到体外培育的细胞在藻酸盐凝胶表面快速生长。藻酸盐凝胶表面上的细胞生长是胶凝离子依赖性的。细胞仅在藻酸钙凝胶上生长而不在锶凝胶上生长。细胞的生长模式因不同细胞系而不同，起始生长必然涉及凝胶表面的破裂或细胞隆起，以进行锚定依赖性细胞生长。一些细胞如MDCK细胞以球形单层完全覆盖珠。当开始起始生长时，该珠在短时间内被细胞覆盖。生长为球形单层阻止了细胞在珠中的进一步生长(缺乏营养物质)。以球形单层完全覆盖珠的细胞由于抑制的缘故停止了表面上的增殖，因为没有更多的生长空间。此生长似乎与正常体外培养表面上的生长遵循相同原理(即铺满)。
细胞在藻酸钙、而非锶凝胶表面选择性生长说明胶凝离子在细胞与珠表面的粘附中起到重要作用，但也可能涉及凝胶结构本身的改变。来自凝胶网络的钙可能影响锚定依赖性蛋白(钙调蛋白等)。在藻酸盐表面上的细胞生长可用于组织培养应用。藻酸盐凝胶可形成不同形状，细胞在它上面生长的装置可用于组织构建和用于移植物中。在细胞再生长后，也可能去除藻酸盐凝胶，因此，此方案可作为组织工程工艺的一部分，用于使完整细胞层脱附。
与钙凝胶相比，在证明通常珠强度较高的锶凝胶中珠内细胞生长被抑制。类似地，锶珠上细胞生长被抑制。在藻酸锶和藻酸钡珠中细胞增殖被抑制。
为了防止细胞(宿主成纤维细胞和巨噬细胞(macrophate)等)在珠上不需要地生长，覆盖有球形单层细胞的珠可进一步包被，或对其进行二次封装，以保护珠(即物理保护或免疫保护)。这可用作细胞浓度高并因而具有提高的生产能力、并且可在控制生长的同时使细胞长时间保持存活的优化生产系统。
可对植入人或动物的藻酸盐珠进行免疫排斥。已观察到植入的藻酸盐珠被生长细胞(淋巴细胞、成纤维细胞等)所覆盖。此观察结果说明，宿主细胞在体内藻酸盐珠上的粘附和生长不总是由免疫反应引起，因为含钙凝胶表面可以是细胞粘附和增殖的锚定基材。因此，通过将锶掺入含有细胞的藻酸盐基质抑制了植入珠的细胞生长过度。另一种方法是将在外表面上生长着单层固定细胞的钙珠掺入锶胶凝的基质内。
Claims (34)
1.一种抑制多数增殖细胞增殖的方法，所述方法包括将所述细胞维持在含有藻酸盐聚合物和锶的藻酸盐基质中的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述细胞维持在动物体内。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，维持所述细胞至少7天。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，维持所述细胞至少1年。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，藻酸盐基质中的二价阳离子由锶组成。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞包含编码在维持细胞时表达的蛋白质的表达载体。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，藻酸盐基质是球形，横截面为约20-1000μm。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，藻酸盐基质中的细胞以单层粘附于封装在藻酸盐基质内的藻酸盐体的外表面。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，藻酸盐体包含藻酸盐聚合物以及钙、钡、锌和铜中的一种或多种。
10.一种抑制宿主细胞在人体内的可植入组合物上生长7天或更多天的方法，该方法包括将可植入组合物维持在人体内7天或更多天的步骤，其中所述可植入组合物包含含锶的藻酸盐基质。
11.一种抑制细胞在动物体内的可植入组合物上生长180天或更多天的方法，该方法包括将可植入组合物维持在动物体内180天或更多天的步骤，其中所述可植入组合物包含含锶的藻酸盐凝胶。
12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述可植入组合物包含封装在藻酸盐基质中的细胞、生理学活性化合物、蛋白质或肽。
13.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述可植入组合物包含含有编码蛋白的表达载体的细胞。
14.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述藻酸盐基质是球形，横截面为约20-1000μm。
15.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，藻酸盐基质中的细胞以单层粘附于封装在藻酸盐基质内的藻酸盐体的外表面。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述藻酸盐体包含藻酸盐聚合物以及钙、钡、锌和铜中的一种或多种。
17.一种可植入装置，所述装置的外表面上包含藻酸盐凝胶，其中所述藻酸盐凝胶包含锶。
18.如权利要求17所述的可植入装置，其特征在于，所述可植入装置选自：移植片固定模、心脏起搏器、导管、可植入修复假体、外科用螺钉、外科用金属线、组织填充移植物、食道回流抑制性移植物、失禁抑制性移植物、乳房移植物、颌移植物、颊移植物、胸移植物和臀肌移植物。
19.一种在个体内抑制宿主细胞在如权利要求17或18所述的可植入装置上生长的方法，该方法包括将可植入装置维持在个体中的步骤。
20.一种包含藻酸盐体的组合物，所述藻酸盐体的外表面上包被着单层细胞，其中藻酸盐体包含钙、钡、锌和铜中的一种或多种。
21.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，将所述藻酸盐体封装在藻酸盐或其它聚合物基质中。
22.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，将所述藻酸盐体封装在大胶囊或其它容器装置中。
23.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述细胞包含编码蛋白质的表达载体。
24.一种制备人造组织的方法，所述方法包括以下步骤：
培养多个细胞片层，所述各细胞片层在包含含有藻酸盐聚合物和钙的藻酸盐基质的片层上包含单层细胞；
通过将一细胞片层的底部置于另一细胞片层的细胞上来堆积细胞片层；
将堆积的细胞片层维持在使各片层的藻酸盐基质溶解的条件下，从而使各单层细胞至少与另一层单层细胞直接接触，产生具有多层细胞的组织。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述多个细胞片层包含一层或多层成纤维细胞和/或多层上皮细胞和/或多层角质形成细胞。
26.一种用藻酸盐基质涂覆或覆盖无细胞组合物或装置的外表面的方法，所述方法包括以下步骤：
用藻酸盐溶液覆盖或涂覆无细胞组合物或装置或其组件，和
继续或随后通过浸没、沉入、喷洒、雾化或其它技术施加二价交联离子。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述二价交联离子是钙、钡、铜、锌或锶。
28.一种可植入装置，所述装置包含封装在藻酸盐基质中的细胞，其中所述藻酸盐基质包含藻酸盐聚合物和锶。
29.如权利要求28所述的可植入装置，其特征在于，所述可植入装置包被着含有藻酸盐聚合物和锶的藻酸盐基质。
30.如权利要求28或29所述的可植入装置，其特征在于，所述细胞以单层粘附于藻酸盐体的外表面。
31.如权利要求28-30中任一项所述的可植入装置，其特征在于，所述细胞选自：干细胞、郎格罕氏岛、肝细胞、神经细胞、肾皮质细胞、血管内皮细胞、甲状腺和副甲状腺细胞、肾上腺细胞、胸腺细胞、卵巢细胞、HEK293细胞、MDCK细胞和C2C12细胞。
32.如权利要求28-31中任一项所述的可植入装置，其特征在于，所述细胞是胰岛素生产细胞。
33.一种治疗患有糖尿病的个体的方法，所述方法包括将如权利要求28-32中任一项所述的可植入装置植入所述个体体内的步骤。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述可植入装置涂覆有含有藻酸盐聚合物和锶的藻酸盐基质。
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