USO DE MATRICES DE ALGINATO PARA CONTROLAR LA PROLIFERACIÓN CELULAR
Campo de la Invención La presente invención se refiere a matrices de alginato y sus usos en composiciones y aparatos para inhibir la proliferación celular. La presente invención también se refiere a formulaciones de alginato, construcciones y aparatos que tienen monocapas de células adheridas a los mismos y sus usos. Antecedentes de la Invención Los alginatos son bien conocidos como materiales versátiles para la encapsulación celular debido a su capacidad para formar gels altamente biocompatibles y fuertes bajo las condiciones fisiológicas en temperatura constante (Skják-Braak G, y T. Espevik Carbohydrates in Europe 1996; 14: páginas 19 a 25; y Strand BL, et al. Minerva Biotecnologica 2000; 12: páginas 223 a 233, las cuales están incorporadas a la presente descripción como referencia). El transplante de construcciones de tejidos basado en alginato puede ser útil en el tratamiento de un número grande de enfermedades. Los alginatos pueden ser utilizados para tapar las células dentro de microcuentas, protegiendo de este modo, las células contra el ataque inmune del huésped y el esfuerzo físico. (Skják-Braak G, y T. Espevik mencionado anteriormente; Strand BL, et al. mencionado anteriormente; Yang H, et al. Cell Encapsulation Technology and Therapeutícs. Boston, Birkháuser, 1999: páginas 3 a 17; Uludag H. et al. Adv Drug Deliv Rev 2000; 42: páginas 29 a 64; Orive G, et al. Nature Medicine 2003: 9: páginas 104 a 107; Emerich DF y HC Salzberg Cell Transplant 2001; 10: páginas 3 a 24; Sambanis A, Diabetes Technol Ther 2000; 2: páginas 81 a 89 y Lanza RP, y DK Cooper. Molecular Medicine Todav 1999; 4: páginas 39 a 45, las cuales están incorporadas a la presente descripción como referencia). Las células atrapadas dentro de las cuentas de alginato que excretan moléculas terapéuticas pueden ser utilizadas como bio-reactívos que se pueden implantar en el tratamiento de una gran variedad de enfermedades, incluyendo el cáncer, diabetes, la enfermedad de Parkinson, el dolor crónico y la falla del hígado. (Emerich DF y HC Salzberg mencionado anteriormente; Lanza RP, y DK Cooper mencionado anteriormente; Wang T, et al, Nat Biotechnol 1997; 15: páginas 358 a 362; Read T-A, et al. Nat Biotechnol 2001; 19: páginas 29 a 34; Cai J, et al. Hepatology 2002; 36: páginas 386 a 394; Canaple L, et al. Ann N Y Acad Sci 2001; 944: páginas 350 a 361; Glicklis R, et al. In: Ikada Y, Okano T (Eds). Tissue Engineering for Therapeutic Use. 1999: páginas 119 a 131; Emerich DF. Cell Transplant 2002; 11: páginas 1 a 3; Emerich DF, et al. Neurosci Biobehav Rev 1992; 16: páginas 437 a 447; Hagihara Y, et al. Cell Transplant 1997; 6: páginas 527 a 530; Risbud MV y RR Bhonde J Biomater Sci Polymer Edn 2001; 12: páginas 1243 a 1252, las cuales están incorporadas a la presente descripción como referencia). Por lo tanto, los alginatos ahora son utilizados ampliamente como materiales de inmovilización para la células o tejidos en el desarrollo de los sistemas bio-reactivos para el uso terapéutico. Los alginatos también han sido estudiados como materiales de bioestructura en otros tipos de aplicaciones médicas. Dependiendo del proceso de manufactura, los alginatos pueden tomar varias formas, tales como pastas, esponjas, fibras, bastones y tubos. Las esponjas de alginato están siendo estudiadas como materiales para el transplante de células (Miralles G, et al. Journal of Biomedical Materials Research 2001; 57: páginas 268 a 278; y Shapíro L y S. Cohén Biomaterials 1997; 18: páginas 583 a 590, cada una de las cuales está incorporada a la presente descripción como referencia) y la regeneración de los nervios (Sufan W, et al. Journal of Neurotrauma 2001; 18: páginas 329 a 338; Kataoka K, et al. J. Bíomed Mater Res 2001; 54: páginas 373 a 384; y Hashimoto T, et al. Exp Braín Res 2002; páginas 356 a 368, las cuales están incorporadas cada una a la presente descripción como referencia). Además, las pastas de alginato que contienen condrocitos han sido inyectadas en los niños como un tratamiento exitoso para los problemas del reflujo de la uretra (Diamond DA y AA Caldamone J Urol 1999; 162: páginas 1185 a 1188, las cuales están incorporadas a la presente descripción como referencia) y son promisorios los implantes de condrocitos en alginato gelificado en el sitio mediante la adición de una solución de gelificación directamente en los defectos del cartílago (Fragonas E, et al. Biomaterials 2000; 21: páginas 795 a 801, la cual está incorporada a la presente descripción como referencia). Para las aplicaciones que comprenden las células en contacto directo con la estructura de alginato, pueden ser cruciales las interacciones entre las células y la matriz de alginato. Además, con respecto a los sistemas bio-reactivos de alginato en particular, un obstáculo mayor puede ser la selección y disponibilidad de las fuentes de las células productoras. Como alternativa para el procesamiento de órganos frescos, rápidamente antes del uso médico, existen algunas ventajas en hacer proliferar las células in vitro como una fuente ilimitada para la producción de bio-reactivos. Dichas células pueden ser manipuladas genéticamente para que tengan mejores propiedades y la capacidad para producir productos terapéuticos. Generalmente, para las células atrapadas en alginato que están proliferando, la proliferación celular debe ser controlada de alguna manera. Se ha establecido que la proliferación celular dentro de la matriz de gel de alginato depende del tipo de la red de gel (Constantinidis I, et al. Biomaterials 1999; 20: páginas 2019 a 2027; y Stabler C, et al. Biomaterials 2001; 22: páginas 1301 a 1310, las cuales están incorporadas a la presente descripción como referencia), pero la proliferación también depende del tipo de célula (Rokstad AM, et al. Cell Transplant 2002; 11: páginas 313 a 324, la cual está incorporada a la presente descripción como referencia). Se ha mostrado que las células atrapadas en gel de alginato más débiles que tienen un contenido bajo de ácido gulurónico proliferan más rápidamente comparadas con las células atrapadas en células con contenido alto de ácido gulurónico, o sea más fuertes (Constantinidis I, et al. mencionado anteriormente; y Stabler C, et al. mencionado anteriormente). Como resultado de la proliferación celular y la formación de colonias dentro de la red de gel, las cuentas pueden interrumpirse y puede ocurrir la filtración de las células de las cuentas (Constantinidis I, et al. mencionado anteriormente; y Stabler CL, et al. Ann N Y Acad Sci 2002; 961 páginas 130 a 133, las cuales están incorporadas a la presente descripción como referencia). Por lo tanto, un problema particular cuando se utiliza la proliferación de células en cuentas de alginato, es que las células continúan proliferando y creciendo y la alteración de las cuentas y la filtración de las células que ocurre expone a las células al sistema inmune. Las células de animales son altamente especializadas para responder e interactuar con células adyacentes y matrices extracelulares. Dichas respuestas son controladas por genes específicos. Se ha demostrado que el colágeno, un componente mayor de la matriz extracelular normal, inhibe que las células entren en la apoptosis y por lo tanto, proporcionan un substrato para la supervivencia y diferenciación de células (O'Connor SM, et al. Neurosci Lett 2001; 304: páginas 189 a 193, la cual está incorporada a la presente descripción como referencia). Sin embargo, los mecanismos moleculares detrás de la interacción entre las células y la matriz de alginato son desconocidos. Aunque las células atrapadas pueden formar colonias similares a esteroides dentro de la red de gel, también se ha demostrado recientemente que las células pueden proliferar adheridas a la superficies de gel de alginato (Wang L, et al, Biomaterials 2003; 24: páginas 3475 a 3481, la cual está incorporada a la presente descripción como referencia). Se ha establecido, que las células de médula ósea de rata pueden proliferar en superficies de gel de alginato in viiro sin modificación química alguna del substrato de gel (Wang L, et al. mencionado anteriormente). En contraste con lo que se había observado anteriormente para la proliferación celular dentro de la matriz de alginato, Wang et al, también descubrió que existe un índice más alto de proliferación en los gels de alginato con un contenido alto de ácido gulurónico, comparado con el contenido bajo. Sin embargo, la carencia de capacidad de los mioblastos C2C12 para proliferar en superficies de alginato no modificadas químicamente también ha sido observada, mientras que las secuencias de péptidos RGD enlazadas al substrato de alginato permitieron la proliferación celular (Rowley JA et al. Journal of Biomedícal Materials Research 2003; 60: páginas 217 a 223; y Rowley JA, et al. Biomaterials 1999; 20: páginas 45 a 53, las cuales están incorporadas a la presente descripción como referencia). Sin embargo, estos trabajadores también han descubierto una mejor proliferación de mioblastos en los gels de alginato hechos con alginatos que contienen un alto contenido de ácido gulurónico. Otro problema común en las aplicaciones que comprenden los implantes de cuentas de alginato dentro de los animales es la proliferación de fibroblastos y macrófagos en la superficie de las cuentas seleccionadas (Vandenbossche GMR, et al, J Pharm Pharmacol 1993; 45: páginas 115 a 120; Rokstad AM, et al. Ann N Y Acad Sci 2001; 944: páginas 216 a 225; y Siebers U, et al. Journal of Molecular Medicine 1999; 77: páginas 215 a 218, las cuales están incorporadas a la presente descripción como referencia). Este problema ocurre también cuando son implantados otros cuerpos extraños, tales como aparatos. Por lo tanto, se necesita claramente un conocimiento mejor acerca de la proliferación celular y el comportamiento de la adición en contacto con la matriz de alginato. Existe la necesidad de proporcionar composiciones que comprenden células en proliferación encapsuladas en alginato y métodos de uso de dichas composiciones, en las cuales es controlado el crecimiento y la proliferación de las células, evitando de este modo, la alteración de las cuentas, la filtración de las células y la respuesta inmune siguiente. Existe la necesidad de composiciones que comprendan células encapsuladas en alginato y métodos para utilizar dichas composiciones en donde las moléculas terapéuticas excretan las células. Existe la necesidad de composiciones que comprendan las células encapsuladas en alginato y métodos para utilizar dichas composiciones en el tratamiento de enfermedades. Existe una necesidad de proporcionar composiciones que se puedan implantar y aparatos y métodos para utilizar dichas composiciones y aparatos que se pueden implantar en los cuales es controlada la proliferación de células huésped no deseadas en la superficies de dichas composiciones y aparatos que se pueden implantar. Sumario de la Invención La presente invención se refiere a métodos para inhibir la proliferación de una pluralidad de células en proliferación. El método comprende el paso de mantener las células dentro de una matriz de alginato que comprende polímeros de alginato y Estroncio. La presente invención también se refiere a métodos para inhibir la proliferación celular en una composición en un cuerpo humano. Los métodos comprenden el paso de mantener la composición en el cuerpo humano. La composición comprende un gel de alginato que comprende Estroncio. La presente invención también se refiere a métodos para inhibir la proliferación celular en una composición en un animal durante 180 o más días. El método comprende el paso de mantener la composición en el cuerpo del animal durante 180 o más días. La composición comprende un gel de alginato que comprende Estroncio. La presente invención también se refiere a métodos para inhibir la proliferación celular en un aparato en un animal. Los métodos comprenden el paso de mantener el aparato dentro del animal. El aparato comprende un gel de alginato que contiene Estroncio. La presente invención también se refiere a aparatos que tienen en su superficie exterior una matriz de alginato que comprende Estroncio. La presente invención se refiere a un método para recubrir o cubrir la superficie exterior de una composición libre de células o aparato con una matriz de alginato. El método comprende el paso de cubrir o recubrir primero la composición libre de células o aparato o un componente de la misma, con una solución de alginato y sucesivamente o posteriormente aplicar la inmersión, submersión, rociado, atomización u otra técnica, y es formado un ion de reticulación divalente por medio del cual los polímeros de alginato del recubrimiento de la solución de alginato del aparato se llegan a reticular por parte de los iones de reticulación divalentes y un recubrimiento de la matriz de alginato del aparato. La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un cuerpo de alginato que comprende una sola capa de recubrimiento celular de la superficie exterior del cuerpo de alginato. El cuerpo de alginato comprende uno o más de Calcio, Bario, Zinc y Cobre.
La presente invención también se refiere a láminas de alginato que comprenden una sola capa de células en la superficie. Las láminas de alginato comprenden uno o más de Calcio, Bario, Zinc o Cobre. La presente invención también se refiere a métodos para preparar un tejido artificial. Los métodos comprenden hacer proliferar una pluralidad de láminas de células, comprendiendo cada una de las láminas de células una sola capa de células en una lámina que comprende una matriz de alginato que comprende polímero de alginato y uno o más de Calcio, Bario, Zinc o Cobre, apilar las láminas de células colocando el fondo de una lámina de células sobre las células de otra lámina de células y manteniendo las láminas de células apiladas bajo condiciones en las cuales la matriz de alginato de cada una de las láminas es disuelta y de esta manera, se pone en contacto directo una sola capa de células con por lo menos una sola capa de células para producir un tejido que tiene una pluralidad de capas de células. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 muestra una imagen de luz microscópica de células Endo HEK 293 encapsuladas en cuentas de alginato de calcio (izquierda) y estroncio (derecha) por aproximadamente 1.5 meses. La figura 2 muestra las imágenes de luz microscópica de las células MDCK atrapadas en cuentas de alginato de calcio (izquierda) y estroncio (derecha) después de aproximadamente 2.5 meses en cultivo. Todas las cuentas de alginato de calcio son completamente cubiertas con las células adheridas. Para las cuentas de alginato de estroncio, las células solas y los agregados de las células se pueden ver dentro de las cuentas. La figura 3 es una gráfica que muestra fracciones de las cuentas con la sobre-proliferación de células MDCK como una función del tiempo después de la encapsulación en cuentas de alginato de Calcio o Estroncio. También fue contado el número de cuentas de alginato de calcio con sobrepoblación incompleta. La figura 4 es una foto de microscopio de luz de las células Endo HEL 293 después de 4 semanas en cuentas de alginato PRONOVA UP L V G. Se pueden observar en el centro de la cuenta colonias grandes (esteroides) de células en proliferación. El centro del esteroide se convertirá eventualmente en necrotizado. Las cuentas del fondo de la derecha muestran células que proliferan en la superficie de la cuenta y debajo de la superficie. La figura 5 muestra una fotografía de cuentas de alginato de calcio (PRONOVA SLG) con las células MDCK. En una cuenta (del fondo) las células han cubierto completamente la superficie mientras que la proliferación en la otra superficie todavía no ha iniciado. La figura 6 muestra una fotografía de células MDCK en cuentas de alginato después de un período de 4 a 6 meses. Las células fueron atrapadas en alginato PRONOVA UP L V G al 1.8% en 50 mM CaCI2 (izquierda) y 50 mM SrCI2 (derecha). Para las células atrapadas en alginato de calcio el 100% de las cuentas están completamente cubiertas con la monocapa esférica de células, mientras que ninguna de las otras cuentas tienen células adheridas a sus superficies. Aparece algo de proliferación celular dentro de estas cuentas aunque las cuentas todavía están intactas. La figura 7 muestra una fotografía de la monocapa esférica de las células MDCK en cuentas de alginato de calcio atrapadas en cuentas de alginato más grandes. Descripción Detallada de la Invención La presente invención se origina de descubrimientos que demuestran que el tipo de catión divalente utilizado para producir una matriz de alginato, tiene un efecto en la proliferación de las células que se ponen en contacto con dicha matriz de alginato. Estos descubrimientos permiten el diseño y producción de composiciones específicas y aparatos que incluyen tipos específicos de matrices de alginato basados en el deseo de inhibir o apoyar la proliferación celular. Algunos aspectos de la presente invención proporcionan composiciones y aparatos y usos de los mismos, los cuales están asociados con matrices de alginato que inhiben la proliferación celular. Algunos aspectos de la presente invención proporcionan composiciones y aparatos y usos de los mismos que están asociados con matrices de alginato que promueven la proliferación celular controlada y de esta manera, se puede hacer proliferar las células y mantenerse en monocapas sencillas de células. De acuerdo con algunas modalidades del aspecto de la presente invención que comprende la inhibición de la proliferación celular, la proliferación de las células encapsuladas dentro de una matriz de alginato puede ser inhibida con el objeto de evitar problemas que están asociados con el mantenimiento de células en proliferación dentro de una matriz de alginato, particularmente en los problemas que se originan cuando son implantadas en un animal dichas células en proliferación encapsuladas en la matriz de alginato. De un modo similar, se puede inhibir la proliferación celular para evitar el sobre-crecimiento de un implante por las propias células del receptor sobre las composiciones y aparatos implantados que permanecen en el cuerpo de un recipiente por períodos de tiempo prolongados. La inhibición de la proliferación celular supera los problemas asociados con el uso de las composiciones y aparatos que se pueden implantar y proporciona composiciones, aparatos y métodos mejorados. Se ha descubierto que la presencia de Estroncio en las matrices de alginato inhibe la proliferación celular sin afectar la viabilidad de las células. Este descubrimiento proporciona métodos para inhibir la proliferación de la célula en proliferación dentro de dichas matrices por períodos de tiempo sorprendentemente largos, y métodos de inhibición de proliferación celular para evitar que se sobre-proliferen las células en composiciones y aparatos implantados, de modo que dichas composiciones y aparatos puedan ser mantenidos en el cuerpo del recipiente por períodos de tiempo sorprendentemente largos. En el caso de composiciones que se pueden implantar en los cuales las células que se pretende secreten materiales en el cuerpo del recipiente están encapsuladas en una matriz de alginato, la presencia del Estroncio inhibe la sobre-proliferación de las células en el cuerpo del recipiente, la cual si está presente puede evitar que el material sea secretado de las composiciones dentro del cuerpo del recipiente. Evitando la sobre-proliferación, la secreción de la composición puede continuar de manera ininterrumpida con el paso del tiempo. La prevención de la sobre-proliferación celular en las composiciones que comprenden células vivas encapsuladas en una matriz de alginato también permite que las células que se encuentran dentro de la matriz continúen el acceso a los nutrientes y materiales necesarios para la viabilidad continuada por períodos de tiempo sorprendentemente largos.
En las modalidades en las cuales la composición es una matriz de alginato que encapsula las células en proliferación, la presencia del Estroncio inhibe la proliferación de las células encapsuladas, las cuales también es sabido que ocasionan muchos problemas que evitan el uso de largo plazo de dichas composiciones. Como se usa en la presente descripción, "células en proliferación" significa células que tienen la capacidad de la división celular continua y repetida bajo las condiciones en las cuales son mantenidas en la ausencia del Estroncio que está presente un nivel efectivo para inhibir la proliferación celular. La inhibición de la proliferación continua de células evita la alteración de la integridad de la matriz y la filtración posterior de las células dentro del cuerpo. Por consiguiente, algunas modalidades de la presente invención proporcionan métodos que permiten que las composiciones que contienen las células en proliferación sean mantenidas en el cuerpo del recipiente por períodos de tiempo sorprendentemente largos, sin la alteración de la matriz, ni la filtración de las células. La inhibición de la proliferación de las células por las matrices de alginato que contienen Estroncio permite los métodos para inhibir la sobre-proliferación celular en aparatos y composiciones implantadas, superando de este modo los problemas asociados con el uso de aparatos y composiciones implantados. Se proporcionan aparatos mejorados y métodos de uso mejorados de los aparatos. Se proporcionan aparatos mejorados, tales como aquellos que tienen matrices de alginato que contienen Estroncio en la superficie exterior y métodos de uso en dichas composiciones. Estos aparatos son particularmente útiles debido a que su uso se caracteriza por una inhibición de la sobre-proliferación celular asociada con muchos aparatos implantados y los problemas y resultados no deseables de dicha sobre-proliferación celular. Las composiciones mejoradas incluyen aquellas que comprenden células encapsuladas dentro de una matriz de algínato, como se describieron anteriormente, así como también se proporcionan composiciones libres de células, tales como aquellas que comprenden o consisten de matrices de alginato y métodos de uso de dichas composiciones. En algunas modalidades, las composiciones comprenden una matriz de alginato que encapsula un fármaco o proteína que es secretada de las composiciones implantadas dentro del cuerpo. En algunas modalidades, se pueden utilizar composiciones como agentes de volumen, las cuales pueden ser utilizadas, por ejemplo, para proporcionar un material biocompatible que puede ocupar espacio cuando es necesario para proporcionar un apoyo o que se llegue a integrar con aparatos y tejidos. De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención, se proporcionan métodos para la inhibición de proliferación de una pluralidad de células en proliferación. Los métodos comprenden los pasos de mantener las células en proliferación dentro de una matriz de alginato que comprende polímeros de alginato y Estroncio. En algunas modalidades preferidas, las células encapsuladas son mantenidas dentro del cuerpo de un animal. En algunas modalidades, el animal es un mamífero, preferentemente un humano, un roedor, tal como un ratón o una rata o un bovino, ovino, equino, canino o felino. En algunas modalidades, el animal es un pez o una especie aviaria. En algunas modalidades, las células son mantenidas dentro de la matriz de alginato durante por lo menos 7 días, preferentemente por lo menos 30 días, y en algunas modalidades por lo menos 60 días, en algunas modalidades por lo menos 90 días, más preferentemente por lo menos 180 días y más preferentemente un año o más. En las modalidades preferidas, las células dentro de la matriz de alginato son mantenidas en el cuerpo de un animal durante por lo menos 7 días, preferentemente por lo menos 30 días, en algunas modalidades por lo menos 60 días, en algunas modalidades por lo menos 90 días, más preferentemente por lo menos 180 días y más preferentemente un año o más. En algunas modalidades, las células dentro de la matriz de alginato son mantenidas dentro de un aparato que se puede implantar tal como un contenedor que puede ser mantenido en el cuerpo de un animal. En algunas modalidades, las células dentro de la matriz de alginato que son mantenidas dentro de los aparatos que se pueden implantar, pueden ser mantenidas durante por lo menos 7 días, preferentemente por lo menos 30 días, en algunas modalidades por lo menos 60 días, en algunas modalidades por lo menos 90 días, más preferentemente por lo menos 180 días y más preferentemente un año o más. En algunas modalidades, las células en proliferación dentro de la matriz de alginato son adheridas como una monocapa a la superficie exterior de un cuerpo de alginato encapsulado dentro de la matriz de alginato. En algunas modalidades, ese cuerpo de alginato comprende polímeros de alginato y Calcio. En algunas modalidades, el cuerpo de alginato comprende polímeros de alginato y uno o más de Calcio, Bario, Zinc y Cobre. De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención, métodos para inhibir la proliferación celular en la superficie exterior de una composición que comprende una pluralidad de células en un cuerpo humano durante 7 o más días. El método comprende el paso de mantener la composición en el cuerpo humano durante siete o más días en donde la composición comprende una pluralidad de células encapsuladas en una matriz de alginato que comprende Estroncio. Las células pueden ser células en proliferación, células que no están proliferando o una combinación de ambas. En algunas modalidades, la composición es mantenida en el cuerpo de un humano durante un año más. De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención, métodos para inhibir la proliferación celular en la superficie exterior de una composición que comprende una pluralidad de células en un cuerpo de un animal durante por lo menos 180 días. El método comprende el paso de mantener la composición en el cuerpo del animal durante siete o más días, en donde la composición comprende una pluralidad de células encapsuladas en una matriz de alginato que comprende Estroncio. Las células pueden ser células en proliferación, células que no están proliferando o una combinación de ambas. En algunas modalidades, la composición es mantenida en el cuerpo de un animal durante un año o más. En algunas modalidades en las cuales las células son encapsuladas dentro de matrices de alginato, las matrices generalmente son esteroides. En algunas modalidades, las matrices son de forma irregular. Generalmente, la matriz de alginato puede ser lo suficientemente grande para acomodar números efectivos de células, mientras que son lo suficientemente pequeñas, de modo que el área de superficie de la superficie exterior de la matriz sea lo suficientemente grande en relación con el volumen dentro de la matriz. Como se usa en la presente descripción, el tamaño de la matriz de alginato es generalmente presentado para esas matrices que son esencialmente esteroides y el tamaño es expresado como la medición transversal más grande. En el caso de una matriz esférica, dicha medición transversal sería el diámetro. En algunas modalidades, la matriz de alginato es un esteroide y su tamaño es entre aproximadamente 20 y aproximadamente 1000 µm. En algunas modalidades, el tamaño de la matriz de alginato es menor de 100 µm, por ejemplo, entre 20 y 100 µm, y en algunas modalidades el tamaño de la matriz de alginato es mayor de 800 µm, por ejemplo, entre 800 y 1000 µm. En algunas modalidades, el tamaño de la matriz de alginato es de aproximadamente 100 µm, en algunas modalidades, el tamaño de la matriz de alginato es de aproximadamente 200 µm, en algunas modalidades, el tamaño de la matriz de alginato es de aproximadamente 300 µm; en algunas modalidades, el tamaño de la matriz de alginato es de aproximadamente 400 µm, en algunas modalidades, el tamaño de la matriz de alginato es de aproximadamente 500 µm; en algunas modalidades, el tamaño de la matriz de alginato es de aproximadamente 600 µm; y en algunas modalidades de aproximadamente 700 µm. En algunas modalidades en las cuales las células son encapsuladas dentro de la matriz de alginato, las células encapsuladas son células de mamífero, preferentemente células de humano. En algunas modalidades en las cuales las células encapsuladas no son células en proliferación, la células que no están en proliferación pueden ser seleccionadas del grupo consistente de, pero sin limitarse a: isletas pancreáticas, células hepáticas, células neurales, células de la corteza renal, células del endotelio vascular, células de la tiroides y paratiroides, células adrenales, células del timo, células del ovario y otros tipos de células de origen primario. En algunas modalidades en las cuales las células encapsuladas son células en proliferación, las células en proliferación pueden ser derivadas de las líneas celulares establecidas, tales como, pero sin limitarse a, por ejemplo, líneas celulares HEK 293, MDCK y C2C12. En algunas modalidades, las células encapsuladas comprenden un vector de expresión que codifica una o más proteínas que son expresadas cuando las células son mantenidas. En algunas modalidades, la proteína es una citocina, un factor de crecimiento, insulina, un inhibidor de genes de angiogénesis, tal como angiostatina o endostatina. Proteínas con peso molecular más bajo, de aproximadamente 60-70 kD, son particularmente candidatos buenos, debido a la porosidad de la red de gel. En algunas modalidades, las células encapsuladas son adheridas como una monocapa a la superficie exterior de un cuerpo de alginato encapsulado dentro de la matriz de alginato. En algunas modalidades, ese cuerpo de algínato comprende polímeros de alginato y Calcio. De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención, se proporcionan métodos para inhibir la proliferación celular en la superficie exterior de una composición libre de células en un cuerpo de un animal por siete o más días. El método comprende el paso de mantener la composición libre de células en el cuerpo del animal, en donde la composición comprende una matriz de alginato que comprende Estroncio. En algunas modalidades, la composición libre de células comprende un fármaco encapsulado dentro de la matriz de alginato. En algunas modalidades, la composición libre de células comprende una proteína encapsulada dentro de la matriz de alginato. En algunas modalidades, la composición libre de células es un implante de volumen de tejido. En algunas modalidades, la composición libre de células es un implante de volumen de tejido que consiste esencialmente de polímeros de alginato y Estroncio. De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención, se proporcionan métodos para inhibir la proliferación celular en la superficie exterior de un aparato en un cuerpo de un animal. El método comprende el paso de mantener el aparato en el cuerpo del animal, en donde la matriz de alginato que comprende Estroncio es depositada en la superficie exterior del aparato. En algunas modalidades, el aparato es seleccionado del grupo consistente de: un stent, un marcapaso cardíaco, un catéter, un prostético que se puede implantar, un tornillo quirúrgico, un cable quirúrgico, un implante de volumen de tejido, un implante inhibidor del reflujo del esófago, un implante inhibidor de incontinencia, un implante inhibidor de reflujo renal, un contenedor adecuado para sostener la células que son depositadas en el exterior de una superficie y/o encapsuladas dentro de la matriz de alginato, tal como un aparato sólido o microcápsula, un implante de pecho, un implante de barba, un implante de mejilla, un implante pectoral, un implante de glúteos y un implante dental. En algunas modalidades, las composiciones libres de células o aparatos son mantenidas dentro del cuerpo de un mamífero, preferentemente un humano, un roedor, tal como un ratón o una rata, un bovino, un ovino, un equino y especies caninas o felinas. En algunas modalidades, el animal es un pez o una especie aviaria. En algunas modalidades, el aparato es mantenido en el cuerpo de un animal por un tiempo de por lo menos 7 días, preferentemente de por lo menos 30 días, más preferentemente de por lo menos 60 días, más preferentemente de por lo menos 90 días, más preferentemente de por lo menos 180 días y más preferentemente de un año o más. La presente invención también se refiere a aparatos que se pueden implantar que tienen una matriz de alginato que comprende Estroncio depositada en la superficie exterior. En algunas modalidades, el aparato es seleccionado del grupo consistente de: un stent, un marcapaso cardíaco, un catéter, un prostético, un tornillo quirúrgico, un cable quirúrgico, un implante de volumen de tejido, un implante inhibidor de reflujo del esófago, un implante inhibidor de incontinencia, un implante de reflujo renal, un contenedor adecuado para sostener la células que son depositadas en el exterior de una superficie y/o encapsuladas dentro de una matriz de alginato, tal como un aparato sólido o microcápsula, un implante de mama, un implante de barba, un implante de mejilla, un implante pectoral, un implante de glúteos o un implante dental. La presente invención se refiere a un método para recubrir o cubrir la superficie exterior de una composición libre de células o aparato con una matriz de alginato comprendiendo el primer paso cubrir o recubrir primero la composición libre de células o aparato o un componente de la misma, con una solución de alginato y sucesivamente o posteriormente aplicar mediante inmersión, submersión, rociado, atomización u otra técnica, un ion de reticulación divalente, tal como Calcio, Bario, Cobre, Zinc o Estroncio en donde los polímeros de alginato de la solución del recubrimiento de la solución de alginato del aparato se llegan a reticular por los iones de reticulación divalente y se forma por medio del mismo un recubrimiento de la matriz de alginato. En dichas modalidades, la solución de alginato utilizada para el recubrimiento o cobertura inicial sería de suficiente viscosidad para recubrir o cubrir efectivamente la composición libre de células o aparato. En algunas modalidades, la cobertura o recubrimiento inicial es reticulado además en una condición hidratada (húmeda). En algunas modalidades, la cobertura o recubrimiento inicial es secado primero antes de la reacción con el ion de reticulación. Estos diferentes aspectos de la presente invención que comprenden la inhibición de la proliferación celular cada uno proporciona matrices de alginato que comprenden Estroncio. En algunas modalidades, la matriz de alginato es inicialmente libre esencialmente de uno o más de Calcio, Bario, Zinc y Cobre. En algunas modalidades preferidas, los cationes divalentes de la matriz de algínato consisten de Estroncio. En algunas modalidades preferidas, la matriz de alginato consiste esencialmente de polímeros de alginato y Estroncio. En algunas modalidades, los polímeros de alginato de la matriz de alginato contienen más de 50% de ácido a-L-gulurónico. En algunas modalidades, los polímeros de alginato de la matriz de alginato contienen más del 60% de ácido a-L-gulurónico. En algunas modalidades, los polímeros de algínato de la matriz de alginato contienen del 60% al 80% de ácido a-L-gulurónico. En algunas modalidades, los polímeros de alginato de la matriz de algínato contienen del 65% al 75% de ácido a-L-gulurónico. En algunas modalidades, los polímeros de alginato de la matriz de alginato contienen más de 70% de ácido a-L-gulurónico. En algunas modalidades, los polímeros de alginato de la matriz de alginato tienen un peso molecular promedio de 20 a 500 kD. En algunas modalidades, los polímeros de alginato de la matriz de alginato tienen un peso molecular promedio de 50 a 500 kD. En algunas modalidades, los polímeros de algínato de la matriz de alginato tienen un peso molecular promedio de 100 a 500 kD. En algunas modalidades, la matriz de alginato está libre de aminoácidos policatiónicos. Se ha descubierto que las células adheridas a la superficie de las matrices de alginato pueden ser mantenidas como una monocapa utilizando matrices de alginato que comprenden uno o más de Calcio, Zinc y Bario. Este descubrimiento proporciona aspectos de la presente invención los cuales se relacionan con los cuerpos de alginato formados de matrices de alginato y láminas de matrices de alginato que tienen monocapas de células adheridas a su superficie y a métodos para utilizar dichos cuerpos de alginato y láminas de alginato. Se ha descubierto que las células adheridas a dichos cuerpos de alginato y láminas de alginato pueden ser mantenidos de una forma estable como monocapas. Los cuerpos de alginato y las láminas de alginato proporcionan una plataforma estable en la cual mantener, propagar y manipular las células. Los cuerpos de alginato y las láminas de alginato pueden comprender una pluralidad de células que no son proliferativas adheridas a las superficies en la forma de una monocapa, permitiendo para facilidad de manipulación, el mantenimiento eficiente, una dispersión más regular en un volumen y la prevención del agrupamiento de dichas células. Además, dichos cuerpos de alginato y láminas de alginato pueden ser utilizados para mantener las células en una densidad muy alta, permitiendo todavía el intercambio de nutrientes que mantienen las células viables y aumentando de este modo, la eficiencia de excreción de productos terapéuticos. La proliferación y el mantenimiento de las monocapas de células en las superficies de alginato es fácil para proporcionar formas específicas de composiciones de célula/matriz. Además, mediante la proliferación de las células en la forma de monocapas, las células pueden ser acomodadas de un modo óptimo para permitir que las células permanezcan viables en concentraciones muy altas. En algunas modalidades, las células son incorporadas o utilizadas de otro modo en relación con los aparatos y macrocápsulas. Manteniendo las células como una monocapa en una superficie de alginato, las células pueden ser acomodadas de una manera óptima dentro del aparato o macrocápsula. Esto puede ser particularmente útil en aparatos en donde el volumen es pequeño y la optimización de la densidad de la célula es crítica. Los cuerpos de alginato y las láminas de alginato que comprenden una pluralidad de células en proliferación tienen las mismas ventajas que las células que no son proliferativas, con la ventaja adicional de permitir una propagación más controlada de las células como una monocapa. En algunas modalidades, las composiciones comprenden un cuerpo de alginato que comprende una sola capa de células en la superficie exterior del cuerpo de alginato, en donde el cuerpo de alginato comprende uno o más de Calcio, Bario, Zinc y Cobre. En algunas modalidades, el cuerpo de alginato generalmente es de forma esferoide y tamaño y el cuerpo de alginato es entre menos de 600 µm, en algunas modalidades menos de 500 µm y menos de 400 µm en algunas modalidades, en algunas modalidades menos de 300 µm, en algunas modalidades menos de 200 µm y en algunas modalidades menos de 100 µm. En algunas modalidades, las células son células de mamífero, preferentemente células humanas. En algunas modalidades, las células son células que no son proliferativas, preferentemente células seleccionadas del grupo consistente de, pero sin limitarse a, células madre, isletas pancreáticas, células hepáticas, células neurales, células de la corteza renal, células del endotelio vascular, células de la tiroides y paratiroídes, células adrenales, células del timo y células del ovario. En algunas modalidades, las células son células en proliferación, tales como células derivadas de líneas celulares establecidas, por ejemplo, las líneas celulares HEK 293, MDCK y C2C12. En algunas modalidades, las células comprenden un vector de expresión que codifica una proteína que es expresada cuando las células son mantenidas. En algunas modalidades, la proteína es una citocina, un factor de crecimiento, insulina o un inhibidor de angiogénesis, tal como angiostatina o endostatína. En algunas modalidades, ese cuerpo de alginato es encapsulado dentro de la matriz de alginato, tal como una matriz de alginato que comprende polímeros de alginato y Estroncio. En algunas modalidades, la monocapa se hace proliferar utilizando células proliferativas que son convertidas entonces a una condición que no es diferenciada terminalmente u otra condición que no es proliferativa. En algunas modalidades, los cuerpos de alginato con monocapas de células adheridas a los mismos están contenidos dentro de un aparato que se pude implantar. En algunas modalidades de la presente invención, las células encapsuladas que están contenidas dentro de una matriz de alginato que comprende polímeros de alginato y Estroncio son incorporadas en un aparato que se puede implantar, el cual es opcionalmente recubierto con una matriz de alginato que comprende polímeros de alginato y Estroncio. En algunas de dichas modalidades, las células dentro de la matriz de alginato son adheridas como una monocapa en la superficie exterior de un cuerpo de alginato el cual preferentemente comprende polímero de alginato y Calcio, Bario, Zinc, Cobre y/o Magnesio. Las células utilizadas en dichas modalidades preferentemente son células seleccionadas del grupo consistente de: células madre, isletas pancreáticas, células hepáticas, células neurales, células de la corteza renal, células del endotelio vascular, células de la tiroides y paratiroides, células adrenales, células del timo, células del ovario, células HEK 293, células MDCK y células C2C12. En algunas modalidades, las células comprenden un vector de expresión que codifica una proteína, tal como por ejemplo, una citocina, un factor de crecimiento, insulina o un inhibidor de angiogénesis, tal como angiostatína o endostatina que es expresado cuando se mantienen las células. En algunas modalidades de la presente invención, el aparato que se puede implantar comprende células productoras de insulina encapsuladas, tales como células de isleta pancreática, que están contenidas dentro de la matriz de alginato que comprende polímeros de alginato y Estroncio, y son utilizadas para tratar a personas que sufren de diabetes. El aparato, el cual permite la transferencia de materiales entre su interior y exterior es implantado y mantenido en el individuo y las células dentro del aparato producen y liberan insulina, la cual viaja en el cuerpo del individuo. En una de dichas modalidades, el aparato que se puede implantar está recubierto con una matriz de alginato que comprende polímeros de alginato y Estroncio. En algunas de dichas modalidades, las células productoras de insulina que están contenidas dentro de la matriz de alginato son adheridas en la forma de una monocapa en la superficie exterior de un cuerpo de alginato el cual preferentemente comprende polímeros de alginato y Calcio, Bario, Zinc, Cobre y/o Magnesio. En algunas modalidades, las composiciones comprenden una lámina de alginato que comprende una sola capa de células en la superficie de la lámina de alginato, en donde la lámina de alginato comprende Calcio. En algunas modalidades las células son células de mamífero, preferentemente células humanas. En algunas modalidades, las células son células no proliferativas, preferentemente células seleccionadas del grupo consistente de, pero sin limitarse a: células madre, isletas pancreáticas, células hepáticas, células neurales, células de la corteza renal, células del endotelio vascular, células de la tiroides y paratiroides, células adrenales, células del timo y células del ovario. En algunas modalidades, las células son células proliferativas, tales como células derivadas de líneas celulares establecidas, por ejemplo, pero sin limitarse a, líneas celulares HEK 293, MDCK, y C2C12. En algunas modalidades, las células comprenden un vector de expresión que codifica una o más proteínas que son expresadas cuando las células son mantenidas. En algunas modalidades se proporcionan métodos para preparación de tejidos artificiales. Una pluralidad de láminas de células son cultivadas en las cuales las láminas de células comprenden cada una, una sola capa de células en una lámina que comprende una matriz de alginato que comprende polímero de algínato y Calcio. Las láminas de células son apiladas colocando el fondo de una lámina de células en la parte superior de otra lámina de células. Las láminas de células apiladas son mantenidas bajo condiciones en las cuales la matriz de alginato de cada lámina son disueltas de este modo, se pone en contacto directo una sola capa de células con al menos otra sola capa de células para producir un tejido que tiene una pluralidad de capas de células. En algunas modalidades, la pluralidad de láminas de células comprende una pluralidad de láminas de células del epitelio. En algunas modalidades, la pluralidad de láminas de células comprende además una o más láminas de células de fibroblastos. En algunas modalidades, la pluralidad de láminas de células comprende una pluralidad de láminas de células de hepatocitos. En algunas modalidades, la pluralidad de láminas de células comprende una o más láminas de células de isletas. En algunas modalidades, las células aquí utilizadas son células madre. De acuerdo con algunas modalidades, las células del epitelio son construidas como piel artificial. Las capas de células del epitelio (queratinocitos u otras) son agregadas a las capas de tejidos de tejido conectivo (fibroblastos), para ser utilizadas para reemplazo de la piel dañada en pacientes. Estos diferentes aspectos de la presente invención que comprenden mantener las células como una monocapa en un cuerpo de alginato o lámina proporcionan matrices de alginato que comprenden uno o más de Calcio, Bario, Zinc y Cobre. En algunas modalidades, la matriz de alginato está esencialmente libre de Estroncio. En algunas modalidades preferidas, los cationes dívalentes en la matriz de alginato consisten de Calcio. En algunas modalidades preferidas, la matriz de alginato consiste esencialmente de polímeros de alginato y Calcio. En algunas modalidades, los polímeros de alginato de la matriz de alginato son mayores de 50% de monómeros de ácido a-L-gulurónico. En algunas modalidades, los polímeros de alginato de la matriz de alginato contienen más del 60% de ácido a-L-gulurónico. En algunas modalidades, los polímeros de alginato de la matriz de alginato son de entre el 60% y el 80% de ácido a-L-gulurónico. En algunas modalidades, los polímeros de alginato de la matriz de alginato contienen más del 70% de ácido a-L-gulurónico. En algunas modalidades, los polímeros de alginato de la matriz de alginato contienen entre el 65% y el 75% de ácido a-L-gulurónico. En algunas modalidades, los polímeros de alginato de la matriz de alginato tienen un peso molecular promedio de 20 a 500kD. En algunas modalidades, los polímeros de alginato de la matriz de alginato tienen un peso molecular promedio de 50 a 500kD. En algunas modalidades, los polímeros de alginato de la matriz de alginato tienen un peso molecular promedio de 100 a 500kD. En algunas modalidades, la matriz de alginato está libre de aminoácidos policatiónicos. EJEMPLOS Ejemplo 1 En este trabajo hemos estudiado cultivos celulares atrapados en cuentas de alginato y observado su crecimiento dentro de las cuentas y en la superficie de las cuentas durante algún tiempo. Hemos descubierto que la proliferación de las células puede ocurrir en la superficie de las cuentas y que las células pueden cubrir las cuentas como monocapas esféricas y además, que este proceso depende del ion de gelificación. Estas observaciones pueden tener implicaciones de entendimiento de los mecanismos detrás de las interacciones entre las células y la matriz de alginato. Materiales y métodos Culfivos celulares y procedimienío de encapsulación Se utilizaron células Endo HEK 293 Humanas (células de riñon del embrión, transfectadas para la producción de endostatina) y células caninas MDCK (derivadas de un riñon aparentemente normal de un cocker spaniel hembra adulto). Las células fueron cultivadas de manera rutinaria como cultivos de células de monocapas y se volvieron a cultivar tres veces por semana. En cada experimento, las células fueron tripsinizadas, mezcladas con soluciones de alginato PRONOVA SLG 20 al 1.8% y atrapadas en cuentas de alginato utilizando un generador de cuentas electrostático como se describió anteriormente en la publicación de Klokk TI, y JE Melvick, en J Microencapsulation 2002; 19: páginas 415-424, la cual está incorporada en la presente descripción como referencia. Se hicieron cuentas de un tamaño de aproximadamente 400 µm utilizando una boquilla de diámetro exterior de 0.35 mm y operando el generador de cuentas en un potencial electrostático de aproximadamente 6 kV/cm con una distancia entre la punta de la boquilla y el baño de gelificación de aproximadamente 1 cm. Se evitó la presencia de iones de sodio durante la gelificación tanto como fue posible utilizando manitol como el osmólito con el objeto de obtener cuentas que no fueran homogéneas con mejores propiedades (Strand BL, et al. Biotechnol Bioeng 2003; 82: páginas 386 a 394, la cual está incorporada en la presente descripción como referencia). Las soluciones de gelificación utilizadas contenían 50 mM de CaC12, SrCI2 ó BaCI2. Después de la gelificación las cuentas fueron transferidas a los matraces de cultivo celular y agregadas al medio de proliferación celular normal. El medio de proliferación fue cambiado de 2 a 3 veces por semana y las cuentas también fueron transferidas regularmente a matraces nuevos con el objeto de evitar la proliferación extensa de células liberadas de las cuentas en la superficie de proliferación del matraz. Las cuentas y las células cultivadas fueron seguidas en el tiempo, utilizando microscopios de luz y fluorescencia. Tinción viva/muería de células aírapadas La detección de las células vivas y muertas fue realizada utilizando un Equipo LIVE/DEAD de
Viabilidad/Citotoxicidad (Molecular Probes, Oregon, EUA). La tinción de las células se realizó como se describe en el procedimiento del equipo. La fluorescencia verde es detectada de la calceína convertida en esterasa intracelular como un indicador de las células vivas, mientras que la fluorescencia roja es detectada de la tinción de etidio simultánea de células muertas (membrana de células de filtración). Las cuentas de alginato con el contenido de las células fueron observadas medíante el microscopio de elaboración de imagen confocal. Resultados Las células Endo HEK 293 Humanas y las células MDCK caninas fueron encapsuladas en cuentas de alginato con calcio y estroncio sin material de recubrimiento y observadas visualmente bajo la luz del microscopio durante un tiempo. El comportamiento de proliferación de las dos líneas celulares fue claramente diferente. Después de solamente unos cuantos días, la proliferación celular podría ser observada dentro de las cuentas y esto fue claramente más pronunciado para las células Endo HEK 293. Se desarrollaron agregados de células grandes dentro de las cuentas y después de menos de un mes se pudo observar la proliferación de las células fuera de las cuentas. La figura 1 muestra imágenes de las células Endo HEK 293 después de 1.5 meses de cultivo, tanto en cuentas de alginato de estroncio como de calcio. La proliferación de las células dentro de las cuentas dependió claramente del ion de gelificación, así como la carga de células dentro de las cuentas que fue menor con los iones de estroncio. En ambos cultivos ocurrió la filtración de células como colonias de células adheridas al fondo de los matraces de cultivo y se originaron tres colonias en las mismas. Sin embargo, en las cuentas de alginato de calcio, las células también podían proliferar en la superficie de algunas de las cuentas y podrían ser observados los agregados de células más o menos adheridos de manera suelta a las cuentas. Sin embargo, nada de dicha sobreproliferación celular se observó en las cuentas de alginato de estroncio.
Para las células MDCK atrapadas en las cuentas de alginato el índice de proliferación fue considerablemente más lento que para las células Endo HEK 293. En este experimento (figura 2) se atraparon células en una concentración de 2 x 106 células/ml en cuentas de 350 µm, ya sea para el alginato de calcio o de estroncio. La proliferación celular podría ser observada dentro de ambos tipos de cuentas después de algunos días y esto fue más pronunciado para las cuentas de calcio. Algunas células MDCK también escaparon de ambos tipos de cuentas y originaron colonias en la superficie de los matraces de cultivo. También estas células obtuvieron una diferencia mayor que la proliferación de células en la superficie de las cuentas entre las cuentas de alginato de calcio y estroncio. En la figura 2 se muestran imágenes de dos cuentas de gel de alginato con contenido de células MDCK después de aproximadamente 2.5 meses de cultivo. En esta etapa, todas las cuentas de alginato de calcio estaban completamente cubiertas de células mientras que ninguna de las cuentas de estroncio mostró sobreproliferación de célula alguna. El comportamiento de proliferación de la superficie de las cuentas fue claramente diferente en los dos tipos de células, así como que las células MDCK cubrieron las células como monocapas en la superficie de la cuenta de calcio en contraste con las células Endo HEK 293, en donde las células también estaban proliferando como agregados grandes más o menos adheridos sueltamente a la superficie de la cuenta. La sobreproliferación de las células en las cuentas podría ser observada fácilmente a la luz del microscopio. Contando un número limitado de cuentas se caracterizó el patrón de proliferación para las células en la superficie de las cuentas (figura 3). También se observó si las cuentas estaban completamente o solo parcialmente cubiertas de células. Como se puede observar en la figura 3, la proliferación de las células en las cuentas de alginato de calcio ocurrió después de aproximadamente 3 semanas y la fracción de las cuentas con células adheridas aumentó rápidamente hasta que todas las cuentas fueron cubiertas por células aproximadamente 40 días después de la encapsulación. Durante el experimento, en un momento, solamente hasta aproximadamente el 25% de las cuentas de alginato de sodio estaban cubiertas completamente con las células. Esto fue consistente con una sobreproliferación de células rápidas tan pronto como comenzó la proliferación en la superficie de las cuentas. Hemos observado en experimentos separados las cuentas por más de cinco meses. Se observó que las cuentas de alginato de calcio todavía estaban cubiertas con monocapas completas esféricas de células MDCK mientras que ninguna de las cuentas de estroncio mostró proliferación celular alguna en la superficie.
También se probó si las células de las cuentas cubiertas con células podían transferirse y adherirse a cuentas vacías agregando nuevas cuentas vacías al cultivo celular. Las cuentas fueron observadas durante varias semanas sin indicación alguna de transmisión celular a la nuevas cuentas (no se muestran en la foto). La proliferación de las células dentro y en la superficie de las cuentas también fue estudiada mediante la tinción "viva/muerta" de la célula en técnicas de elaboración de imagen confocal. En este experimento, se emite la fluorescencia verde de la calceína convertida en esterasa intracelular en las células vivas, mientras que la fluorescencia roja es de la tinción de etidio de células muertas (membranas de células de filtración). Las imágenes de fluorescencia confocal fueron mostradas como secciones en todas las cuentas. Por lo tanto, solamente una fracción de las células fluorescentes dentro de las cuentas fueron mostradas en la imágenes (no se mostraron en la fotografía). Para la cuenta de alginato de calcio, se puede observar una monocapa esférica de células viables mientras que las células del centro de las cuentas están muertas. La razón para la necrosis dentro de la cuenta es probablemente explicada por el agotamiento del oxígeno y otros nutrientes como resultado del consumo de la monocapa esférica de células. En contraste, las cuentas de alginato de estroncio no fueron cubiertas con células y contenían células viables. Sin embargo, se deberá observar que también originaron las colonias grandes de células dentro de las cuentas de estroncio los agregados de células con centros necróticos con el paso del tiempo. Explicación Se utilizaron grados médicos bien definidos de alginatos los cuales tienen un nivel muy bajo de impurezas (Dornish JM, et al. Ann N Y Acad Sci 2001; 944: páginas 388 a 397 y Skaugrud 0, et al. Biotechnol Genet Eng Rev 1999; 16: páginas 23 a 40, las cuales están incorporadas a la presente descripción como referencia). Por lo tanto, es muy poco probable que las endotoxinas y otras impurezas, las cuales están generalmente presentes en cantidades más grandes o desconocidas de la mayor parte de los alginatos comunes, pueden haber tenido influencia alguna en las observaciones hechas (Skaugrud 0, et al. mencionado anteriormente). El patrón de proliferación de células dentro de la red de gel de alginato fue claramente diferente entre las dos líneas celulares (figura 1 y 2). Aunque las células MDCK mostraron una proliferación más rápida en los cultivos de monocapas, la proliferación dentro de la red de gel fue más lenta comparada con las células Endo HEK 293. Diferencias similares habían sido también reportadas anteriormente (Rokstad AM, et al.
mencionado anteriormente). Sin embargo, la resistencia más alta de la red de gel de Estroncio, mantuvo la integridad de la cuenta en las líneas celulares encapsuladas por un tiempo más largo comparadas con las cuentas de Calcio. La resistencia de la microestructura de la red de alginato es probablemente la que influye directamente en el índice de proliferación de las células (Rokstad AM, et al., mencionado anteriormente y Stabler CL y A Sambanis, mencionado anteriormente). La resistencia de la red de gel también puede cambiar con el tiempo como resultado de la proliferación celular, pero también como resultado del intercambio de iones entre el gen y el medio de cultivo (Rokstad AM, et al., mencionado anteriormente; Smidsr0d O y G Skják-Braek. TIBTECH 1990; 8: páginas 71 a 78; y Read T-A, et al. Int J Devl Neuroscience 1999; 17: páginas 653 a 663, las cuales están incorporadas a la presente descripción como referencia). También se ha sido sugerido la presencia de mecanismos enzimáticos para la degradación de la red de gel (Rokstad AM, et al., mencionado anteriormente). Comparado con el gel de alginato de Calcio, un gel de alginato de Estroncio será menos susceptible a la degradación durante el tiempo en una solución con una baja concentración de iones de gelificación. En la liberación de las células de las cuentas diferentes, es probable que ocurra como resultado de la alteración de alguna de las cuentas, pero también como resultado de la proliferación celular y el movimiento a través de la red. El patrón de proliferación de las células de las dos líneas celulares en la superficie de las cuentas también fue altamente diferente. Mientras que las células Endo HEK 293 se estaban proliferando más o menos adheridas a las cuentas (figura 1), las células MDCK cubrieron las cuentas como una monocapa esférica completa (figura 2). Claramente las células MDCK fueron adheridas fuertemente a la superficie de las cuentas de alginato de calcio, tal y como lo demuestra la elaboración de imagen confocal. La adhesión estrecha a la superficie de la cuenta de calcio sugiere un anclaje dependiente de la proliferación que comprende mecanismos de enlace específicos. Además, la falta de proliferación en la superficie de gel de Estroncio sugiere que es crucial la presencia de iones de gelificación específicos dentro de la red de gel. Esto puede estar directamente relacionado con la presencia de iones de gelificación solos o diferencias en la estructura del gel. La importancia de los iones de gelificación es soportada por la publicación de Attramdal A. en Journal of Peridontal Research 1969; 4: páginas 281 a 285, la cual está incorporada a la presente descripción como referencia, en la cual se observó que los iones de Estroncio en contraste con los iones de Calcio, no soportaban el enlace de las células a una superficie de vidrio. Ahora también es bien conocido que el enlace normal de la célula a matrices o células extracelulares depende de las proteínas de la membrana, tales como las integrinas y cadherinas. Además, también se conoce que dichas proteínas de enlace de la membrana de las células depende de cationes divalentes para el enlace al substrato (Hynes RO. Cell 2002; 110: páginas 673 a 687, la cual está incorporada a la presente descripción como referencia). Aunque no se desea limitar la invención a cualquier teoría en particular, es una explicación plausible que los mecanismos de anclaje dependientes del ion divalente están involucrados en el enlace de las células a la superficie de gel de Calcio. Aunque las propiedades químicas de los iones de Estroncio son similares a la de los iones de Calcio, los mecanismos de enlace de las células no pueden ser soportados por la red de gel de Estroncio. Después de más de cinco meses, no se observaron células adheridas a las cuentas de estroncio mientras que las células viables todavía estaban cubriendo completamente todas las cuentas de calcio. La proliferación de las células MDCK en las superficies de las cuentas de alginato de calcio comenzó después de aproximadamente 3 semanas (figura 3). Todo este tiempo de iniciación relativamente largo sin proliferación alguna en la superficie de las cuentas es sorprendente. También, el período de proliferación en la superficie de las cuentas es corto, tal y como lo refleja la fracción baja de cuentas con sobreproliferación parcial. Esto sugiere algún mecanismo de iniciación y un índice rápido de proliferación en la superficie de las cuentas. La explicación de estas observaciones podría comprender posiblemente algunos mecanismos de adaptación celular, pero posiblemente puede estar también relacionado con los cambios en la matriz de gel como resultado de la liberación de Calcio (Smidsr0d O y G. Skják-Braek, mencionado anteriormente). La observación de que las cuentas cubiertas con células no transfirieron las células a las superficies de las cuentas vacías, índica alguna alteración en la superficie del gel o un contacto inicial fuerte entre la célula y la superficie del gel que es necesario con el objeto de permitir el inicio de la proliferación. La proliferación de las superficies de alginato también ha sido reportada por Wang et al., mencionado anteriormente quien descubrió una proliferación mejor en el alginato con un contenido alto de ácido gulurónico comparado con un contenido bajo. Esto sugiere que la diferencia en la estructura del gel y la resistencia entre los dos tipos de gels podría explicar la diferencia. También han sido reportados resultados similares para el alginato modificado por RGD (Rowley JA y DJ Mooney DJ mencionado anteriormente). Una proliferación mejor en un contenido alto de ácido gulurónico en el alginato comparado con un alginato con un contenido bajo de ácido gulurónico, también puede ser influenciado por el hecho de que un contenido más alto de Calcio presente en la red de gel de alginato con un contenido alto de ácido gulurónico puede promover mejor el enlace de las células y la proliferación más fuerte. (Las observaciones preliminares también muestran una proliferación más rápida de las células Endo HEK 293 en las cuentas de alginato hechas de un alginato con un contenido alto de ácido gulurónico comparado con un alginato con un contenido bajo de ácido gulurónico. La proliferación de fibroblastos y macrófagos en la superficie de las cuentas de alginato vacías implantadas en los animales también ha sido observada comúnmente (Vandenbossche GMR, et al. mencionado anteriormente; Rokstad AM, et al (2001), mencionado anteriormente; Siebers U, et al., mencionado anteriormente). La respuesta del huésped hacia las cuentas implantadas en algunos casos puede ser más bien el efecto de la superficie de alginato como un substrato de proliferación para células del huésped, en vez del inicio de reacciones adversas relacionadas con el sistema inmunológico hacia las cuentas. El uso de Estroncio como el gel del ion de gelificación en las células de gel de alginato, entonces daría una ventaja con el objeto de evitar la sobreproliferación de células. El uso del Estroncio había sido sugerido anteriormente en aplicaciones de encapsulación debido a la buena biocompatibilidad y a la resistencia más alta del gel. (Wideroe H y S Danielsen. Díe Naturwissenschaften 2001; 88: páginas 224 a 228.44, la cual está incorporada a la presente descripción como referencia), y los datos de esta descripción que muestran la proliferación de células inhibidas por el Estroncio proporciona beneficios adicionales inesperados cuando se utiliza este ion de gelificación. El análisis de células vivas/muertas de las cuentas de Estroncio claramente mostró la presencia de células viables dentro de las cuentas después de meses en cultivo. La proliferación de células en superficies de alginato mantiene un potencial interesante en aplicaciones como material de plataforma que soporta la proliferación celular (Wang L,, mencionado anteriormente; Alsberg E, et al. Proc Nati Acad Sci EUA 2002; 99: páginas 12025 a 12030; y Loebsack A, et al. Journal of Bíomedical Materials Research 2001; 57: páginas 575 a 581, las cuales están incorporadas cada una a la presente descripción como referencia). La proliferación de las células como monocapas en la superficie de algínato podría ser utilizada posiblemente para controlar la proliferación de las células en proliferación y evitar la necrosis. El uso de monocapas confluentes de células adheridas a la superficie de las estructuras de gel de alginato tiene el potencial de ser utilizado en aplicaciones diferentes y en la fabricación de sistemas productores o construcciones de tejidos. Las células adheridas como capas esféricas se pueden mantener en una muy alta densidad mientras que todavía permite una buena disponibilidad para el intercambio de nutrientes, productos de desperdicio, así como substancias productoras. Sin embargo, para aplicaciones de encapsulación que comprenden el implante de células extrañas, procedimientos de recubrimiento adicional o la protección de macrocápsulas de células adheridas, pueden ser necesarias para utilizar la tecnología de una manera más práctica. También, las células atrapadas dentro de las cuentas de alginato cubiertas con células como resultado carecerán de nutrientes y necesariamente morirán. Ejemplo 2 Introducción El transplante de construcciones de tejidos basados en biopolímero mantiene un futuro promisorio en el tratamiento de un número grande de enfermedades. Los biopolímeros biocompatíbles pueden ser utilizados para tratar las células dentro de microcuentas, protegiendo de este modo las células contra el ataque inmune del huésped y el esfuerzo físico. Comparados con otros polímeros, los alginatos en particular, tienen buenas propiedades como agentes de inmovilización, una propiedad la cual reside en la capacidad para formar gels estables al calor que se pueden desarrollar y ajustar a las temperaturas fisiológicamente importantes. Las células atrapadas en las cuentas de alginato que excretan moléculas terapéuticas pueden ser utilizadas como bio-reactivos in vivo en el tratamiento de una gran variedad de enfermedades, incluyendo el cáncer, diabetes, enfermedad de Parkinson, dolor crónico y falla del hígado. Por lo tanto, los alginatos ahora son altamente utilizados como materiales de inmovilización para células o tejidos en el desarrollo de sistemas bío-reactivos para el uso terapéutico. También puede ser utilizada como una alternativa para el procesamiento de órganos frescos rápidamente antes del uso médico, la proliferación de células in viíro como una fuente continua de sistemas bio-reactivos. Dichas células pueden ser manipuladas genéticamente a través de técnicas bien conocidas para producir productos terapéuticos y por lo tanto, son candidatos atractivos en el desarrollo de nuevos sistemas bio-reactivos. Las diferentes líneas celulares establecidas inmovilizadas en cuentas de alginato han sido estudiadas y los resultados se presentan en la presente descripción. Métodos Las células de diferentes líneas establecidas generalmente cultivadas como monocapas in viiro fueron atrapadas en cuentas de gel de alginato y se estudió su comportamiento de proliferación. Se estudiaron las siguientes líneas celulares; células Endo HEK 293 Humanas (células de riñon del embrión, transfectadas para la producción de endostatína), células NHIK 3025 humanas (carcinoma cervical in situ), células caninas MDCK (derivadas de un riñon aparentemente normal de un cocker spaniel hembra adulto) y células de ratón C2C12. Las células primero fueron mezcladas con soluciones de alginato PRONOVA y atrapadas en cuentas de alginato del tamaño seleccionado utilizando un generador de cuentas electrostático. Se hicieron cuentas de diferentes tamaños en un rango de entre aproximadamente 150 y aproximadamente 600 µm seleccionando diferentes boquillas y operando el generador de cuentas en un potencial electrostático de aproximadamente 5 kV/cm. La concentración de alginato fue en la mayor parte de los experimentos del 1.5 ó 1.8%, y la presencia de Na+ durante la gelifícación fue evitada tanto como fue posible utilizando manitol (cuentas que no son homogéneas). La solución de gelificación utilizada fue en su mayor parte de 50 mM de CaCI2 ó SrCI2, pero también se probó el BaCI2. Después de la gelificación, las cuentas fueron transferidas en matraces de cultivo de células de monocapas y se agregó un medio de proliferación celular normal. El medio de proliferación fue cambiado de 2 a 3 veces por semana y las cuentas fueron transferidas regularmente en matraces nuevos con el objeto de evitar la proliferación extensa de células liberadas de las cuentas en la superficie de proliferación del matraz. Las cuentas y las células proliferadas fueron seguidas con el tiempo utilizando el microscopio de luz y otras técnicas. Resultados y Explicación Las células atrapadas en cuentas de alginato mostraron una buena viabilidad durante un cultivo de largo plazo in vitro y parecieron no tener un efecto adverso del alginato en las células. Esto es consistente con los datos ya publicados. También de acuerdo con otros datos publicados se observó que las células atrapadas en gels de algínato continuaron proliferando dentro del gel. Las células colonizaron las partes grandes de las cuentas y hasta proliferaron fuera de las cuentas. La figura 4, muestra las células Endo HEK 293 aproximadamente un mes después de atraparlas en las cuentas de alginato. Como se puede observar, se formaron esferoides grandes dentro de las cuentas y las células también proliferaron fuera de las cuentas. Algunas de las células fuera de las cuentas permanecieron adheridas a la superficie de la cuenta o proliferaron fuera de las cuentas como agregados celulares. La proliferación de las células dentro de las cuentas de alginato dependió del gel de alginato (es decir, el tipo de alginato utilizado, así como las condiciones de gelíficación). Generalmente, los alginatos con bajo contenido de ácido gulurónico (G), el cual produce una red de gel más débil, permitieron más rápidamente la proliferación de las células. La proliferación de la célula fue muy limitada durante los primeros días para las células atrapadas en algínato con alto G. Después de alguna demora de la proliferación inicial (generalmente de 2 a 3 semanas) las células empezaron a proliferar más rápidamente. Esto puede ser el resultado del debilitamiento de la red de gel durante el tiempo, debido al contenido bajo de iones de gel (Ca2+) en el medio de cultivo celular. Por lo tanto, se pierden los iones de gelificación de la red de gel y permiten una proliferación más fácil de las células. La proliferación de las células dentro de los gels de alginato puede ser obviamente un problema para aplicaciones que comprenden el implante de cuentas (u otras estructuras) en humanos o animales, ya que dicha proliferación de células puede ocasionar la degradación de las cuentas. También se puede esperar que las células comiencen a proliferar fuera de las cuentas in vivo, y de ser así, se expondrán células de origen extraño al sistema inmune del huésped. Este problema puede ser solucionado de la manera siguiente. El comportamiento de proliferación de las diferentes líneas celulares en cuentas de alginato de calcio ha sido estudiado y se han observado algunas diferencias claras en el patrón de proliferación de células diferentes dentro y sobre la superficie de cuentas de alginato. En particular, se descubrió que las células MDCK seguían un patrón de proliferación sorprendentemente diferente comparado con otras líneas celulares estudiadas. Se observó que las células MDCK proliferaban en la superficie de las cuentas como monocapas esféricas que cubren las cuentas y sin formación de agregados celulares grandes en la solución. La figura 5 muestra fotografías de dos cuentas de alginato, una cubierta con una monocapa completamente esférica de células y una cuenta sin proliferación en la superficie. Fue típico observar cuentas, ya sea completamente cubiertas o sin cubrir con células durante el período de proliferación. Esto implicó que la colonización de cada una de las cuentas fue un proceso rápido tan pronto como había sido iniciado (aproximadamente de uno a dos días). Sin embargo, algunos días después del inicio de la proliferación de células, el 100% de las cuentas estaban completamente cubiertas de células. En contraste con las otras líneas celulares estudiadas, las células MDCK se estaban proliferando en la superficie de las cuentas como una monocapa esférica regular y sin agregados celulares grandes más o menos adheridos a la superficie. Después de que las cuentas fueron cubiertas con células no hubo proliferación celular observada en el exterior de las cuentas (confluencia). Sin embargo, se observó que las células que se caían de las cuentas podían proliferar como monocapas normales adheridas a la superficie del cultivo celular. Con técnicas de fluorescencia y elaboración de imagen confocal, las células de la monocapa esférica mostraron que eran viables por más de 5 meses (la duración completa probada) mientras las células localizadas dentro de las cuentas casi todas estaban muertas. Sin embargo, era posible que ocurriera alguna proliferación para reemplazar las células sueltas que caían de la superficie de las cuentas. Las células MDCK adheridas a las cuentas de alginato de calcio como monocapas esféricas estaban en una condición de proliferación inhibida sin proliferación expansiva alguna dentro de las cuentas o en la superficie de las cuentas. Se descubrió sorpresivamente que las células solamente parecían proliferar en la superficie de las cuentas de los gels de alginato de calcio y no en gels preparados con estroncio como el ion de gelificación. Las células atrapadas en las cuentas de estroncio no proliferaron en la superficie del gel aún después de varios meses en cultivo mientras que en las cuentas de calcio paralelas, las células cubrieron completamente las cuentas en menos de un mes (figura 6). Una explicación de esto puede ser que la proliferación de las células en la superficie de alginato de calcio depende directamente del calcio. Para las células atrapadas dentro de las cuentas de alginato, el uso del estroncio pareció ser mejor que el calcio, ya que la proliferación de las células dentro de las cuentas fue mucho más limitada y debido a que las células no proliferaron a la superficie de las cuentas. Sin embargo, todavía fue buena la viabilidad de las células dentro de las cuentas de estroncio. Las cuentas de alginato cubiertas con monocapas esféricas de células pueden ser sometidas a un segundo atrapamiento en cuentas de alginato más grandes u otras estructuras de gels (incluyendo la encapsulacíón, o contención utilizando otros biomateriales y/o aparatos) para la protección adicional de las células (figura 7). Las cuentas pueden ser recubiertas con una o más capas de alginato u otros materiales de bíopolímero. Por lo tanto, este principio del control de la proliferación celular puede ser utilizado en diferentes aplicaciones en la fabricación de sistemas productores para el uso in vivo u otras aplicaciones. De las células adheridas como monocapas esféricas se puede mantener un número muy alto de células a la concentración del volumen de la cuenta y las células también pueden dar una buena disponibilidad para el intercambio de nutrientes y substancias de producción. Generalmente se observa que las cuentas de alginato de calcio implantadas en animales llegan a quedar completamente cubiertas con células (linfocítos, fibroblastos etc.) del huésped. Esto conduce finalmente a la muerte de las células atrapadas debido a la carencia de nutrientes. Basados en las observaciones in vitro de las células en cultivo, esta proliferación de la superficie de las cuentas depende del ion y probablemente no está relacionada con reacciones adversas (inmunológicas) del huésped. Las cuentas de alginato puro gelificadas con estroncio serán cubiertas con fibroblastos y por lo tanto, también serán "más biocompatibles". Es bien conocido que las proteínas de enlace de las células dependen del calcio (cadherinas y otras). Por lo tanto, es posible que el calcio asociado con la red de gel promueva el enlace de la célula a través de la asociación con las proteínas de enlace de calcio. Resumen Se observó que las células cultivadas in vitro proliferaban rápidamente en la superficie de un gel de alginato. Las células cultivadas en una superficie de gel de alginato eran dependientes del ion de gelificación. Las células solamente proliferaron en gels de algínato de calcio y no en gels de estroncio. El patrón de proliferación para las células varió entre las diferentes líneas celulares y la proliferación inicial debe también estar relacionada con una ruptura de la superficie de gel o protuberancias de células que permiten la proliferación de las células dependiente del anclaje. Algunas células, tales como las células MDCK, cubrieron las cuentas completamente como una monocapa esférica. Cuando inició la proliferación inicial, las cuentas fueron cubiertas con células dentro de un período de tiempo corto. La proliferación como monocapas esféricas se detuvo adicíonalmente en la proliferación de células dentro de las cuentas (falta de nutrientes). Las células que cubren las cuentas completamente como una monocapa esférica dejaron de proliferar en una superficie debido a la inhibición, ya que no existía más espacio para proliferar. La proliferación pareció seguir el mismo principio que en la proliferación en las superficies de cultivo in viiro normales (es decir, confluencia). La proliferación selectiva de células en la superficie de los gels de alginato de calcio y no en el estroncio, sugiere que los iones de gelificación jueguen un rol importante en el enlace de las células a las superficies de las cuentas, pero también cambia en la estructura del gel mismo que puede estar involucrada. El calcio de la red de gel puede afectar las proteínas que dependen del anclaje (cadherínas y otras). La proliferación de células en superficies de alginato puede ser utilizada en aplicaciones de cultivo de tejidos. Los gels de alginato pueden ser formados de diferentes formas y los aparatos con células cultivándose con los mismos podrían ser utilizados para la construcción de tejidos y en injertos. El gel de alginato posiblemente también podría ser quitado de la nueva proliferación de las células y este procedimiento entonces podría ser utilizado para separar capas de células intactas como parte del proceso del diseño de tejidos. Comparado con los gels de calcio, las células que proliferan dentro de las cuentas fueron inhibidas en los gels de estroncio que también demostraron una resistencia de la cuenta más alta en general. De un modo similar, fue inhibida la proliferación de las células en las cuentas de estroncio. Se inhibió la proliferación de las células en el estroncio y las cuentas de algínato de bario. Con el objeto de evitar que proliferen las células no deseadas sobre las cuentas (fibroblastos y macrófagos del huésped etc), las cuentas cubiertas con monocapas esféricas de células pueden ser recubíertas además o sometidas a una encapsulación doble para la protección de las cuentas (es decir, la protección física o la inmunoprotección). Esto puede ser utilizado como un sistema productor optimizado teniendo de este modo, las concentraciones altas de células una capacidad mejorada de producción y las células se pueden mantener viables por un tiempo largo mientras que es controlada la proliferación. Las cuentas de alginato implantadas en humanos o anímales pueden ser sometidas al rechazo inmunológico. Se ha observado que las cuentas de alginato implantadas llegan a estar cubiertas con células que proliferan (linfocítos, fibroblastos etc.). Las observaciones presentes indican que el enlace y la proliferación de células huésped en cuentas de alginato in vivo no siempre son necesariamente ocasionados por una reacción inmunológica, como la superficie del gel que contiene el calcio puede ser un substrato de anclaje para el enlace de células y la proliferación. Por lo tanto, se ¡nhibide la sobreprolíferación de células en las cuentas implantadas incorporando estroncio dentro de la matriz de alginato que contiene las células. Una manera adicional sería incorporar cuentas de calcio que tienen células proliferadas en la superficie exterior como una monocapa inmovilizada dentro de la matriz gelíficada con estroncio.