JP2010529858A

JP2010529858A - 幹細胞のためのペプチド結合細胞マトリックスおよびその使用法

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Publication number: JP2010529858A
Application number: JP2010512378A
Authority: JP
Inventors: エンゲルセンブリンチマン，ジャン; ビョルネベックフロンスダル，カトリーネ; エギルメルビク，ジャン
Original assignee: FMC Corp
Current assignee: FMC Corp
Priority date: 2007-06-13
Filing date: 2008-06-13
Publication date: 2010-09-02
Also published as: EP2152860A4; WO2008157324A3; US20120276066A1; CN101778936A; IL202583A0; AU2008266019A1; KR20100044173A; EP2152860A2; US20100239540A1; WO2008157324A2

Abstract

１つ以上の幹細胞を捕捉する変性アルギネート（共有結合によりそれに少なくとも１つの細胞付着ペプチドが結合している少なくとも１つのアルギネート鎖部分を含む）を含む生体構造物に関し、特定の表現型に幹細胞を分化するためには、三次元の環境で細胞の機能、増殖および分化に最適な条件をもたらす生体適合性のマトリックスの提供。またこのような生体構造物から単離された複数の幹細胞、さらに三次元の生体構造物内で幹細胞およびそれから分化された細胞により遺伝子発現で変化を誘導する方法の提供。
【選択図】図１

Description

本発明は、幹細胞、幹細胞を含む組成物、幹細胞の製法、細胞接着ペプチドを用いる幹細胞を含む組成物、および幹細胞を用いる方法および幹細胞を含む組成物に関する。

細胞遺伝子の発現、表現型および機能に影響する微環境の性質を認識することは、細胞のより良い理解に重要であり、さらに医学的応用のための人工的な組織を遺伝子工学で作るより良いアプローチを提供するのに重要である。それらの正常な環境において、哺乳動物の細胞は、周囲の細胞外のマトリックス、成長因子およびサイトカイン並びに周囲の細胞からなる複雑かつ動的な微環境内に埋め込まれている。細胞外のマトリックススカホールディングは、特異的な細胞表面受容体を経る細胞外マトリックスへの物理的な接続を含む。これらのなかで、インテグリンは、細胞外マトリックスへ細胞内の細胞骨格を接続するために関係する主要な貫膜受容体である。接着プロセスは、細胞の挙動、例えば成長、移動および分化における変化を導く細胞内シグナリング事象のカスケードを開始させる。天然の細胞外マトリックスから由来する物質例えばコラーゲンが、インテグリンを経る細胞付着を促進する天然の接着リガンドをもたらすために、それらは組織工学において生体材料を遺伝子工学で作る出発点であった。しかし、コラーゲンおよび他の生物学的材料の欠点は、それらの化学的および物理的性質をコントロールするわれわれの能力が限られていることである。しかし、細胞接着を開始する短いペプチド配列例えばアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）の発見は、これらの接着ペプチドがその上に接合できるポリマーの開発を可能にした。

この点で非常に見込みのある性質を有するポリマーの１つの群はアルギネートである。アルギネートは、生理学的に関連する温度で発達し硬化できる熱安定性ゲルを形成する独特な能力を有する海産の親水性バイオポリマーである。アルギネートは、１−４グリコシド結合のβ−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）およびα−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）残基の非架橋二元コポリマーの群である。２つのウロン酸モノマーの相対的な量およびポリマー鎖に沿うそれらの配列は、アルギネートの起源に応じて広く変化する。アルギネートは、海産の褐藻中の構造ポリマーであり、そしてまた或る細菌により生成される。ＲＧＤのようなペプチドがアルギネートへ共有結合し、そしてアルギネートから作られるゲル構造が細胞接着を支えることが立証されている。

組織工学における他の重要なファクターは、利用される細胞の起源である。未成熟の細胞が、特殊化した組織の完全に分化した細胞よりも、生体外で高度に増殖できることが見いだされている。完全に分化した細胞の生体外増殖とは対照的に、未成熟または元祖細胞は、生体外でいくつかの世代後に分化し機能するように誘導できる。それらは、またそれらが置かれた環境の関数として、特定の組織内で見いだされる特殊化された細胞の多くに分化する能力をもつように見える。そのため、幹細胞は、組織工学において最も好都合な細胞と思われる。

ＵＳ０９／１４７９００ＵＳ５８１７７５０

Ｅ．Ａｌｓｂｅｒｇら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵ．Ｓ．Ａ．９９；１２０２５（２００２）。Ｎ．Ｇ．Ｇｅｎｅｓら、ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、４２２；１６１（２００４）。Ｊ．Ｅ．Ｇｒｉｍｍｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．ＨｅａｄＮｅｃｋＳｕｒｒｇ．１３０；１１９１（２００４）。Ｐ，Ｋ．Ｋｒｅｅｇｅｒら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２７；７１４（２００６）。Ｗ．Ｆ．Ｌｉｕら、ＭａｔｅｒｉａｌｓＴｏｄａｙ、８；２８（２００５）。Ａ．Ｌｏｅｂｓａｃｋら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＭａｔｅｒｉａｌｓＲｅｓｅａｒｃｈ，５７；５７５（２００１）。Ｊ．Ｊ．Ｍａｒｌｅｒら、ＰｌａｓｔｉｃａｎｄＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅＳｕｒｇｅｒｙ、１０５；２０４９（２０００）。Ｊ．Ａ．Ｒｏｗｌｅｙら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０；４５（１９９９）。Ｊ．Ａ．Ｒｏｗｌｅｙら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＭａｔｅｒｉａｌｓＲｅｓｅａｒｃｈ，５７；５７５（２００３）。ＣａｐｌａｎＡｌ、ＪＯｒｔｈｏｐＲｅｓ、１９９１；９；６４１。ＰｉｔｔｅｎｇｅｒＭＦら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９、２８４；１４３。ＺｕｋＰＡら、ＭｏｌＢｉｏｌＣｅｌｌ、２００２；１３；４２７９。ＬａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙＵら、ＢｌｏｏｄＲｅｖ，２００５；１９；２９。ＤｏｍｉｎｉｃｉＭら、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、２００６；８；３１５。ＹａｍａｄａＫＭら、Ｃｅｌｌ、２００７；１３０；６０１。ＢｏｑｕｅｓｔＡＣら、ＭｏｌＢｉｏｌＣｅｌｌ、２００５；１６；１１３１。ＧｅｎｔｌｅｍａｎＲＣら、ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ、２００４；５；Ｒ８０。ＷｕＺら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＳｔａｔｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、２００４；９９；９０９。ＳｍｙｔｈＧＫ，ＳｔａｔｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、２００４；３。ＧａｕｔｉｅｒＬら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００４；２０；３０７。ＢｅｎｊａｍｉｎｉＹら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＲｏｙａｌＳｔａｔｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ，１９９５；５７。ＦｒｉｓｃｈＳＭら、ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌ，１９９７；９；７０１。ＢｏｑｕｅｓｔＡＣら、ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ，２００６；３２５；３５。ＲｏｔｈＳら、Ｃｅｌｌ、１９９５；８１；９６７。ＴａｋｉｋａｗａＯ、ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｍ，２００５；３３８；１２。ＭｅｉｓｅｌＲら、Ｂｌｏｏｄ、２００４；１０３；４６１９。ＡｒｎａｏｕｔＭＡら、ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌ，２００２；１４；６４１。ＧｉｌｍｏｒｅＡＰ、ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒ，２００５；１２Ｓｕｐｐｌ２；１４７３。ＭａｒｋｕｓｅｎＪＦら、ＴｉｓｓｕｅＥｎｇ、２００６；１２；８２１。ＳｃｈｎａｂｅｌＭら、ＯｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓＣａｒｔｉｌａｇｅ，２００２；１０；６２。

最近の技術は、単層培養として生体外での幹細胞の培養を可能にする。しかし、特定の表現型に幹細胞を分化するためには、三次元の環境で細胞の機能、増殖および分化に最適な条件をもたらす生体適合性のマトリックスが望まれている。

本発明は、１つ以上の幹細胞を捕捉する変性アルギネートを含む生体構造物に関する。変性アルギネートは、共有結合によりそれに少なくとも１つの細胞付着ペプチドが結合している少なくとも１つのアルギネート鎖部分を含む。
本発明は、またこのような生体構造物から単離された複数の幹細胞に関する。
本発明は、さらに三次元の生体構造物内で幹細胞およびそれから分化された細胞により遺伝子発現で変化を誘導する方法に関する。三次元の生体構造物は、共有結合によりそれに少なくとも１つの細胞付着ペプチドが結合している少なくとも１つのアルギネート鎖部分を含む変性アルギネートを含む。方法は、生体構造物内で幹細胞およびそれから分化された細胞を捕捉する段階を含む。

本発明は、また複数の幹細胞を作る方法に関する。この方法は、ドナーから１つ以上の幹細胞を得る段階、幹細胞が単層として成長し増殖する条件下でドナーから得られた幹細胞を維持する段階を含む。幹細胞は、次に共有結合によりそれに少なくとも１つの細胞付着ペプチドが結合している少なくとも１つのアルギネート鎖部分を含む変性アルギネートを含む生体構造物に捕捉され、次に該生体構造物から単離される。

本発明は、さらに、このような方法により作られた複数の幹細胞に関する。
本発明は、また、変性疾患例えば神経障害、または神経損傷を含む損傷を有する個人に該幹細胞を投与することにより該個人を治療する方法に関する。この方法は、幹細胞が増殖する条件下で共有結合によりそれに少なくとも１つの細胞付着ペプチドが結合している少なくとも１つのアルギネート鎖部分を含む変性アルギネートを含む生体構造物中で幹細胞を培養する段階、次に変性疾患例えば神経障害、または神経損傷を含む損傷を有する個人に有効な量でしかも該個人へ治療上の効果をもたらすのに有効な部位で幹細胞を投与する段階を含む。

共有結合で結合したＲＧＤ配列を有するかまたは有しないアルギネートから作られたアルギネートビーズ中に捕捉後、種々の時間で死滅した脂肪由来の幹細胞のフラクションのデータを示す。死滅した細胞のフラクションは、また１０倍に増大した細胞密度を有するアルギネートビーズで記録された（閉じた記号）。平均の標準誤差は、記号を越えたときに示される。共有結合で結合したＲＧＤ配列を有するかまたは有しないアルギネートから作られたアルギネートビーズ中に捕捉後、種々の時間で死滅した骨髄由来の幹細胞のフラクションのデータを示す。死滅した細胞のフラクションは、また１０倍に増大した細胞密度を有するアルギネートビーズで記録された（閉じた記号）。平均の標準誤差は、記号を越えたときに示される。ＢｒｄＵ（ＦＬ１）およびプロピジウムヨーダイド（ＦＬ２）により染色された骨髄幹細胞の２つのパラメーターフローサイトメトリー記録からのデータを示す。ゲート状域（Ｒ２）は、ｓｕｂＧ１ＤＮＡ含量を有する細胞（非生存細胞）のフラクションを示す。原材料からの計画的単離直後に採取した幹細胞の写真を示す。付着および拡がり前では、未培養のＡＴ−ＭＳＣは小さくかつ丸かった。単層で２Ｄでの生体外の培養後に採取された幹細胞の写真を示す。ＡＴ−ＭＳＣは、スピンドル様の形態をとった。上方の左および右のパネルは、通常のアルギネートに捕捉された幹細胞の写真を示す。ＭＳＣは、球状の形態を回復するが、多数の細胞は７日目に死滅する。（上方の中間のパネルは、左のパネルと同じであるが、白色光の代わりに蛍光を用いた）。下方の右のパネルは、ＲＧＤアルギネート中の幹細胞を示す。細胞は、細胞本体から突き出している延長部を有することが分かり、そして７日目の死滅細胞の割合は、遙かに少ない。（下方の中間のパネルは、蛍光を用いた）。通常のアルギネート中の死滅細胞の割合は、３Ｄ培養では２１日を通して増大したが（白色の棒）、一方ＲＧＤアルギネート中の死滅細胞の割合は、この培養期間を通して低く全く安定していた（斜線の棒）。生存細胞および死滅細胞の合計数は、ＡＴ−ＭＳＶ（左のパネル）またはＢＭ−ＭＳＣ（右のパネル）について、通常のアルギネート（白色の棒）またはＲＧＤアルギネート（斜線の棒）における培養中変化しなかった。ＡＴ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣについて僅かに異なる数の細胞がビーズあたり接種された。図５は、通常のアルギネートにおけるＭＳＣの死滅がＰＣＤによることを示す。Ａは、通常のアルギネートの培養７日目のＡＴ−ＭＳＣで行われたＴＵＮＥＬアッセイの結果を示しており、蛍光（上方）および白色光（下方）による同じ細胞を示す。７日目のＰＣＤの量は、ＡＴ−ＭＳＣ（左）およびＢＭ−ＭＳＣ（右）について、単層培養（上方）、通常のアルギネート（中間）およびＲＧＤアルギネート（下方）における細胞について行われたＢｒｄＵアッセイのｓｕｂＧ１集団に対するゲーティングにより定量された。数字は、ｓｕｂＧ１ゲートの細胞の％である。１回の実験からの結果は、各細胞集団に関する２つの実験を代表している。細胞サイクルのＳ相における生存細胞の割合は、ＢｒｄＵアッセイからｓｕｂＧ１集団を除き、次にＳ相の細胞に対するゲーティングにより定量された。数字は、Ｓ相における生存細胞の％である。５ドナーからのＡＴ−ＭＳＣ（上方）および３ドナーからのＢＭ−ＭＳＣ（下方）について３Ｈチミジン結合アッセイは、７日間単層培養の細胞および通常のアルギネートまたはＲＧＤアルギネートで培養された細胞を比較する。新しく単離されたＴ細胞を、３Ｈチミジンを結合しないと思われた細胞について実験上のコントロールとして用いた。単層（上方）、通常のアルギネート（中間）およびＲＧＤアルギネート（下方）で培養された細胞に対するインテグリンモノマーの発現のフローサイトメトリー分析を示す。

アルギネートへ共有結合で結合した細胞付着ペプチドは、細胞マトリックス材料として幹細胞およびそれから分化した細胞の支えとなる。共有結合で結合した細胞付着ペプチドを有するアルギネートビーズ中で培養された幹細胞は、共有結合で結合した細胞付着ペプチドなしでアルギネートから作られたビーズ中で培養された幹細胞に比べて、遺伝子発現プロフィルに変化を生じさせる。いくつかの実験では、アルギネートへ共有結合で結合した細胞付着ペプチドは、細胞の生存を維持するのに助けになることが観察されている。

原材料から得られた幹細胞が単層として培養されるとき、遺伝子の発現が変化する。その上、単層として培養された幹細胞が単層から取り出されそして共有結合で結合した細胞付着ペプチドを有するアルギネートビーズで培養されるとき、遺伝子発現プロフィルは、さらに変化する。単層を通して継体培養されそしてアルギネートビーズ（共有結合で結合した細胞付着ペプチドを有する）で培養された幹細胞は、原材料から得られた未培養の幹細胞の発現プロフィルとは異なる発現プロフィルを有する。どんな理論にも束縛されることを望まないが、共有結合でそれに結合している細胞付着ペプチドを有するアルギネートが幹細胞の接着を支持し、遺伝子発現における変化を促進し、そして細胞がアポトシース（または他の形の細胞の死滅）を行うことを防いでいるものと考えられる。このような共有結合でそれに結合している細胞付着ペプチドを有するアルギネートは、従って、遺伝子の発現における変化を促進しそして或る場合には幹細胞の生存を維持する方法として、異なる生体構造物に使用できる。このような生体構造物は、アルギネートゲルを含むが、また発泡体または線維状の構造物なども含む。

本発明のアルギネートが幹細胞の発現プロフィルを変化するという発見は、組織工学の応用に使用でき、さらに個人への次の投与を含む種々の方法に使用するために細胞の集団を増加かつ維持する幹細胞の培養に使用できる。
本発明の１つの側面は、細胞接着ペプチド結合アルギネート例えばＲＧＤペプチドが共有結合で結合しているアルギネートおよびそれから作られた生体構造物（ゲル中に生存幹細胞を含む）を含む三次元の生体構造物内に幹細胞を継代培養する方法に関する。本発明の好適な生体構造物は、発泡体、フィルム、ゲル、ビーズ、スポンジ、フェルト、繊維およびこれらの組み合わせを含む。

細胞または他の成分を含むアルギネートゲル構造物の１つの性質は、ゲルが溶解後捕捉された物質が放出されることである。共有結合でそれに結合した細胞付着ペプチドを有するアルギネートのゲルは溶解し、それにより捕捉した幹細胞を放出する。これは、カチオン結合剤例えばシトレート、ラクテートまたはホスフェートを使用することにより行われる。これは、非常に有用な性質である。それは、幹細胞（およびそれらから分化した細胞）がゲル構造物から除かれ、そしてそれらの性質が特定の応用に関してテストできるからである。細胞は、次に特定の遺伝子の発現、表面発現などについてテストできる。また、放出された幹細胞（およびそれらから分化した細胞）は、単層培養物としてさらに培養できるか、または細胞内包システムなどとして、組織コンストラクトとして使用されるアルギネートゲルなどのような三次元の構造物で使用できる。

本発明の他の側面は、幹細胞が源から得られ、単層として培養されて細胞の増殖を促進しそして増加した数が得られ、次に細胞接着ペプチド結合アルギネートを含む生体構造物に維持され、その後細胞は生体構造物から単離されそして遺伝子発現パターン（単層で増加した集団とは異なる）を有する幹細胞の集団が得られることを提供する。遺伝子発現のパターンにおけるこのような相違は、幹細胞の集団を、個人への投与および疾患例えば変性疾患の治療を特に有用にする。

単層として培養された細胞が、細胞接着ペプチド結合アルギネートを含む生体構造物内に捕捉されるとき、細胞は形態および遺伝子発現で変化する。細胞は、一般に、球状になりそして遺伝子発現の変化のなかで、インテグリンの変化をエンコードする遺伝子の発現をする。細胞は、遺伝子発現が、単層として培養された細胞により示される発現プロフィルから、生体構造物中に維持された細胞により示される安定な遺伝子発現プロフィルへ変化するのに十分な時間、生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前少なくとも３時間生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前６時間より短く生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前少なくとも６時間生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前９時間より短く生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前少なくとも９時間生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前１２時間より短く生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前少なくとも１２時間生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前１８時間より短く生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前少なくとも１８時間生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前２４時間より短く生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前少なくとも２４時間生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前３６時間より短く生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前少なくとも３６時間生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前４８時間より短く生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前少なくとも４８時間生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前７２時間より短く生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前少なくとも７２時間生体構造物に捕捉されて維持される。いくつかの態様では、細胞は、生体構造物の取り出し前少なくとも４日生体構造物に捕捉されて維持される。細胞は、生体構造物の取り出し前少なくとも５日生体構造物に捕捉されて維持される。細胞は、生体構造物の取り出し前少なくとも６日生体構造物に捕捉されて維持される。細胞は、生体構造物の取り出し前少なくとも１週生体構造物に捕捉されて維持される。細胞は、生体構造物の取り出し前２週まで生体構造物に捕捉されて維持される。細胞は、生体構造物の取り出し前３週まで生体構造物に捕捉されて維持される。細胞は、生体構造物の取り出し前４週まで生体構造物に捕捉されて維持される。

本発明の他の側面は、幹細胞が供給源から得られそして捕捉されさらに細胞接着ペプチド結合アルギネートを含む生体構造物で培養され、その後細胞は生体構造物から単離されそして遺伝子発現パターン（単層で増加した集団とは異なる）を有する幹細胞の集団が得られることを提供する。このような態様では、選ばれた幹細胞は、好ましくは、このような条件下例えば脂肪組織から由来する幹細胞を増殖できるものである。このような幹細胞は、個人への投与および疾患例えば変性疾患の治療を特に有用にする。

いくつかの態様によれば、幹細胞は、細胞付着ペプチドへ共有結合で結合したアルギネートポリマー例えばＲＧＤモチーフを有するもの（これに限定されない）を含むアルギネートポリマーから作られるアルギネートマトリックス中で培養される。このようなマトリックス中で培養されたこのような幹細胞は、神経障害例えばパーキンソン病、ＨＤ（ハンチントン病）、卒中、ムコ多糖症およびＭＳ（多発性硬化症）の治療、および神経損傷例えば脊髄損傷を含む損傷の治療に有用である。このような幹細胞は、例えば脳、脊柱または他の治療上の作用を与える適切な部位で、患者中に移植される。

本発明の幹細胞は、例えば治療上の作用が望まれる部位での移植または全身のような任意の伝達の態様により患者に伝達される。投与の態様は、直接的な注射または移植を含む。本発明の幹細胞は、組成物または装置の一部としてまたは内包されたまたは内包されていない細胞として伝達できる。いくつかの態様では、幹細胞は、静脈内、髄腔内、皮下、器官の組織へ直接、空所および凹所例えば滑液腔および脊柱中へ直接、または神経通路へ伝達される。本発明の幹細胞の静脈内投与は、肺中の幹細胞の蓄積が生じないように思われ、それは、幹細胞が単層として培養された後直接静脈内に投与されたとき観察されるパターンである。

本発明の幹細胞は、変性疾患、すなわち病気に冒された組織または器官の機能または構造が、時間の経過とともに次第に劣化する疾患の治療に有用である。変性疾患の例は、アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）すなわちルーゲリック病；粥状硬化症；癌；糖尿病；心臓疾患；ハンチントン病（ＨＤ）；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；ムコ多糖症；多発性硬化症（ＭＳ）；ノリエ（Ｎｏｒｒｉｅ）病；パーキンソン病；前立腺炎；骨関節炎；骨粗鬆症；シャイ・ドレイジャー症候群；および卒中を含む。

任意の幹細胞が使用できる。いくつかの態様では、幹細胞は、間葉幹細胞例えば脂肪または骨髄から由来するものである。いくつかの態様では、幹細胞は自己由来である。すなわち、それらはそれらおよびそれらの元祖がそのなかに移植される個人から由来する。

ＵＳ４９８８６２１、４７９２５２５，５９６５９９７、４８７９２３７、４８７９２３７、４７８９７３４および６６４２３６３は、本明細書に参考として引用されるが、多数の例を開示している。好適なペプチドは、約１０より少ないアミノ酸を有するペプチドを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、細胞付着ペプチドは、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、ＩＫＶＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、ＲＥＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＤＧＥＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、ＶＧＶＡＰＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、ＧＲＧＤＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）、ＬＤＶ、ＲＧＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）、ＰＤＳＧＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）、ＲＹＶＶＬＰＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、ＬＧＴＩＰＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）、ＬＡＧ、ＲＧＤＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）、ＲＧＤＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）、ＨＨＬＧＧＡＬＱＡＧＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、ＶＴＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、ＳＤＧＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）、ＧＲＥＤＶＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）、ＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）、ＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）、ＶＡＰＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）、ＧＧＧＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）、およびＧＧＧＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）およびＦＴＬＣＦＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）を含む。いくつかの態様では、細胞付着ペプチドは、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、ＩＫＶＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、ＲＥＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＤＧＥＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、ＶＧＶＡＰＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、ＧＲＧＤＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）、ＬＤＶ、ＲＧＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）、ＰＤＳＧＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）、ＲＹＶＶＬＰＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、ＬＧＴＩＰＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）、ＬＡＧ、ＲＧＤＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）、ＲＧＤＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）、ＨＨＬＧＧＡＬＱＡＧＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、ＶＴＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、ＳＤＧＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）、ＧＲＥＤＶＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）、ＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）、ＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）、ＶＡＰＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）、ＧＧＧＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）、およびＧＧＧＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）およびＦＴＬＣＦＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）を含み、そしてさらに追加のアミノ酸、例えば１−１０の追加のアミノ酸（ＮまたはＣ末端での１−１０Ｇ残基を含むがこれらに限定されない）を含む。例えば、好適なペプチドは、式（Ｘａａ）_ｎ−ＳＥＱ−（Ｘａａ）_ｎ（但し、式中Ｘａａは独立してそれぞれ任意のアミノ酸であり、ｎは０−７であり、ＳＥＱは、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、ＩＫＶＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、ＲＥＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＤＧＥＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、ＶＧＶＡＰＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、ＧＲＧＤＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）、ＬＤＶ、ＲＧＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）、ＰＤＳＧＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）、ＲＹＶＶＬＰＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、ＬＧＴＩＰＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）、ＬＡＧ、ＲＧＤＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）、ＲＧＤＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）、ＨＨＬＧＧＡＬＱＡＧＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、ＶＴＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、ＳＤＧＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）、ＧＲＥＤＶＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）、ＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）、ＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）、ＶＡＰＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）、ＧＧＧＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）、およびＧＧＧＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）およびＦＴＬＣＦＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）からなる群から選ばれるペプチド配列であり、そしてアミノ酸の全数は２２より小さく、好ましくは２０より小さく、好ましくは１８より小さく、好ましくは１６より小さく、好ましくは１４より小さく、好ましくは１２より小さく、好ましくは１０より小さい）を有する。ＲＧＤモチーフを含む細胞付着ペプチドは、いくつかの態様では、長さが３，４，５，６，７，８，９，または１０アミノ酸である。その例は、ＲＧＤ、ＧＲＧＤＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）、ＬＤＶ、ＲＧＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）、ＬＡＧ、ＲＧＤＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）、ＲＧＤＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）、ＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）、ＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）、ＧＧＧＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）、およびＧＧＧＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）である。いくつかの態様では、細胞付着ペプチドは、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、ＩＫＶＡＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、ＲＥＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＤＧＥＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、ＶＧＶＡＰＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、ＧＲＧＤＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）、ＬＤＶ、ＲＧＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）、ＰＤＳＧＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）、ＲＹＶＶＬＰＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、ＬＧＴＩＰＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）、ＬＡＧ、ＲＧＤＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）、ＲＧＤＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）、ＨＨＬＧＧＡＬＱＡＧＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、ＶＴＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、ＳＤＧＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）、ＧＲＥＤＶＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）、ＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）、ＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）、ＶＡＰＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）、ＧＧＧＧＲＧＤＳＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）、およびＧＧＧＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）からなる。細胞付着ペプチドがＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）からなるいくつかの態様では、生体構造物は生成したとき、細胞は１ｍＬあたり２×１０^６より少ない、または１ｍＬあたり２×１０^７より多い。細胞付着ペプチドがＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）からなるいくつかの態様では、ＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）からなる細胞付着ペプチドを有するアルギネート鎖部分を含む変性アルギネートに加えて、変性アルギネートはまたＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）以外の細胞付着ペプチドを有する同じおよび／または異なるアルギネート鎖部分を含むならば、生体構造物は生成したとき、細胞は１ｍＬあたり２×１０^６より少ない、または１ｍＬあたり２×１０^７より多い。

ＵＳ６６４２３６３は、本明細書で参考として引用されるが、アルギネートポリマーへ共有結合で結合した細胞付着ペプチドを開示している。
いくつかの態様では、共有結合で結合した細胞付着ペプチドを含む精製したアルギネートは、精製されてエンドトキシンを除く。いくつかの態様では、共有結合で結合した細胞付着ペプチドを含む精製したアルギネートは、＜５００ＥＵ／ｇのエンドトキシンを含む。いくつかの態様では、共有結合で結合した細胞付着ペプチドを含む精製したアルギネートは、＜２５０ＥＵ／ｇのエンドトキシンを含む。いくつかの態様では、共有結合で結合した細胞付着ペプチドを含む精製したアルギネートは、＜２００ＥＵ／ｇのエンドトキシンを含む。いくつかの態様では、共有結合で結合した細胞付着ペプチドを含む精製したアルギネートは、＜１００ＥＵ／ｇのエンドトキシンを含む。いくつかの態様では、共有結合で結合した細胞付着ペプチドを含む精製したアルギネートは、＜５０ＥＵ／ｇのエンドトキシンを含む。細胞付着ペプチドがＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）からなるいくつかの態様では、共有結合で結合した細胞付着ペプチドを含む精製したアルギネートは、＜５０ＥＵ／ｇのエンドトキシンを含む。細胞付着ペプチドがＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）からなるいくつかの態様では、ＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）からなる細胞付着ペプチドを有するアルギネート鎖部分を含む変性アルギネートに加えて、変性アルギネートはまたＧＲＧＤＹ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）以外の細胞付着ペプチドを有する同じおよび／または異なるアルギネート鎖部分を含むならば、共有結合で結合した細胞付着ペプチドを含む精製したアルギネートは、＜５０ＥＵ／ｇのエンドトキシンを含む。

いくつかの態様では、細胞はアルギネートマトリックス内に内包される。マトリックスは、ほぼ回転楕円体である。いくつかの態様では、マトリックスは、不規則な形状を有する。一般に、アルギネートマトリックスは、有効な数の細胞を受け入れるほど十分に大きいが、一方十分に小さくてマトリックスの外表面の面積がマトリックス内の体積に対して十分に大きい。本明細書で使用されるとき、アルギネートマトリックスのサイズは、一般に、本質的に回転楕円体であるマトリックスについて示され、サイズは最大の断面積の測定値として表される。球状のマトリックスの場合には、そのような断面積の測定値は、直径であろう。いくつかの態様では、アルギネートマトリックスは回転楕円体であり、そしてそのサイズは約２０μｍと約１０００μｍとの間にある。いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのサイズは、１００μｍより小さく、例えば２０−１００μｍであり、いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのサイズは、８００μｍより大きく、例えば８００−１０００μｍである。いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのサイズは約１００μｍであり、いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのサイズは約２００μｍであり、いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのサイズは約３００μｍであり、いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのサイズは約４００μｍであり、いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのサイズは約５００μｍであり、いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのサイズは約６００μｍであり、いくつかの態様では、約７００μｍである。

いくつかの態様では、アルギネートマトリックスは、カルシウム、バリウム、亜鉛および銅およびこれらの組み合わせから選ばれたゲル化イオンを含む。いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのアルギネートポリマーは、５０％より多いα−Ｌ−グルロン酸を含む。いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのアルギネートポリマーは、６０％より多いα−Ｌ−グルロン酸を含む。いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのアルギネートポリマーは、６０−８０％のα−Ｌ−グルロン酸を含む。いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのアルギネートポリマーは、６５−７５％のα−Ｌ−グルロン酸を含む。いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのアルギネートポリマーは、７０％より多いα−Ｌ−グルロン酸を含む。いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのアルギネートポリマーは、２０−５００ｋＤの平均分子量を有する。いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのアルギネートポリマーは、５０−５００ｋＤの平均分子量を有する。いくつかの態様では、アルギネートマトリックスのアルギネートポリマーは、１００−５００ｋＤの平均分子量を有する。

細胞は、広い範囲の濃度にわたって内包される。いくつかの態様では、細胞は、アルギネート１ｍＬあたり１×１０^４より少なく、そして１×１０^８より多い濃度で捕捉される。いくつかの態様では、細胞は、アルギネート１ｍＬあたり１×１０^４−１×１０^８の濃度で捕捉される。いくつかの態様では、細胞は、アルギネート１ｍＬあたり１×１０^５−５×１０^７の濃度で捕捉される。いくつかの態様では、細胞は、アルギネート１ｍＬあたり１×１０^６−５×１０^７の濃度で捕捉される。いくつかの態様では、細胞は、アルギネート１ｍＬあたり５×１０^５−５×１０^７の濃度で捕捉される。いくつかの態様では、細胞は、アルギネート１ｍＬあたり２×１０^６−２×１０^７の濃度で捕捉される。細胞は、アルギネート１ｍＬあたり５×１０^５−１×１０^７の濃度で捕捉される。細胞は、アルギネート１ｍＬあたり５×１０^５−５×１０^６の濃度で捕捉される。細胞は、アルギネート１ｍＬあたり２×１０^６の濃度で捕捉される。

単離された幹細胞は、細胞の増殖を支持する条件下でアルギネート−ペプチドマトリックスで培養される。多次元基体としてアルギネート−ペプチドマトリックスを用いることで、細胞の集団は、高度の細胞生存性で能率的に増大する。
幹細胞の集団は、次に神経障害、例えばパーキンソン病、ＨＤ（ハンチントン病）、卒中、ムコ多糖症およびＭＳ（多発性硬化症）の治療、および脊髄損傷のような神経損傷を含む損傷の治療に使用できる。このような幹細胞は、アルギネートマトリックスから単離され、そして患者に移植されるか、またはマトリックス内の幹細胞が移植される。移植は、適切な部位でなされ、それらは脳または脊柱または神経損傷の他の部位において治療作用を行う。

いくつかの態様では、幹細胞の集団は、表１に示される遺伝子発現の特性を有する。いくつかの態様では、幹細胞の集団は、表２に示される遺伝子発現の特性を有する。いくつかの態様では、幹細胞の集団は、表３に示される遺伝子発現の特性を有する。いくつかの態様では、幹細胞の集団は、表５（補足１）に示される遺伝子発現の特性を有する。いくつかの態様では、幹細胞の集団は、表６（補足２）に示される遺伝子発現の特性を有する。いくつかの態様では、幹細胞の集団は、表７（補足３）に示される遺伝子発現の特性を有する。いくつかの態様では、幹細胞の集団は、表８（補足４）に示される遺伝子発現の特性を有する。

（ＲＧＤペプチドを有するアルギネートビーズ中のヒト間葉幹細胞の捕捉
脂肪（図１）および骨髄（図２）からのヒト間葉幹細胞をヒトドナーから単離しアルギネートビーズ中に捕捉した。細胞を、多いＧ含量（〜７０％、ＰＲＯＮＯＶＡＬＶＧ）を有する２％アルギネートの溶液中で混合し、そして約４００μｍのビーズを、ゲル化浴として５０ｍＭのＣａＣｌ_２の溶液を有するＮｉｓｃｏＶＡＲＶＩ静電ビーズ生成器を用いて得た。アルギネートバッチの１つは、ポリマーへ共有結合で結合したＲＧＤペプチドを含んだ。細胞密度は、１つの実験では約８０−１００細胞／ビーズであるように調節され、他の実験では１０倍多かった。ゲル化後、幹細胞を含むビーズを、ＣＯ_２インキュベーター中で細胞培養培地を有する組織培養フラスコ中に貯蔵した。生存および死滅の細胞のフラクションは、蛍光顕微鏡を用いることにより、死滅および生存アッセイ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｌ３２２４）により染色した数個のビーズ中の細胞を計測することによって、異なる時間に計算された。両者の幹細胞タイプについて、実験を通して（２１日）、細胞の全数はほとんど変化しないことが観察された。しかし、両者の細胞タイプでは（図１および２）、生存細胞の数は、非ＲＧＤアルギネートビーズに捕捉される細胞について非常に早く減少した。従って、データは、ＲＧＤ−アルギネート細胞結合が、細胞の付着を助けるとともに、アルギネートゲルマトリックス内の細胞の死滅を防ぐのに極めて重要であることを、驚くべきことに立証する。細胞の生存に対する細胞対細胞の相互作用の効果は、また細胞の濃度を１０倍に上昇させることにより実験で検討された。図１および２のデータから分かるように、細胞濃度が上昇するとき、ＬＶＧアルギネートビーズ中で時間とともに細胞の死滅に対する作用が非常に小さいかまたは全くない。両者の細胞タイプについて、アルギネートビーズの細胞密度は、ＲＧＤアルギネートによる細胞の死滅を防ぐ能力に対して顕著な作用を有しなかった。

ＲＧＤアルギネートマトリックスが細胞の生存を改善することに関して、このような性質は、アルギネートによる新しい生医学的応用、特に組織工学、細胞の内包および幹細胞の培養において、アルギネートを有用にする特別な性質である。

（ＲＧＤアルギネートに捕捉された骨髄由来幹細胞に関する阻害されたアポトーシスの立証）
骨髄からのヒト間葉幹細胞をヒトドナーから単離しそしてＬＶＧアルギネートまたはＲＧＤアルギネートを用いるアルギネートビーズに捕捉させて、または単層として成長させた。アルギネート中の細胞の捕捉は、実施例１に記載したように行った。アルギネート−細胞の集団は、脱ゲル化により単一の細胞の懸濁物として作られた。ＢｒｄＵ（最終濃度１０μＭ）を、４℃で１０分間３００×ｇで遠心分離することによって収集する前１．５時間細胞培養へ添加する。ペレットを１００μＬの氷冷ＰＢＳに再懸濁し、７０％エタノール（４ｍＬ）を添加することにより細胞を固定する。管を数回ひっくり返し、次に−２０℃で一晩（少なくとも１８時間）貯蔵する。細胞を次に遠心分離により集め、ペレットをペプシン−ＨＣｌ溶液（１ｍＬ）に再懸濁する。正確に１０分間のインキュベーション後、０．１Ｍの四硼酸ナトリウム、ｐＨ８．５（３ｍＬ）を加えて酸を中和する。細胞をペレットにし、一度ＩＦＡ（２−３ｍＬ）により洗い、次に室温で５分間ＩＦＡ−Ｔ（２−３ｍＬ）とともにインキュベートした。細胞を再びペレットにし、ＢｒｄＵ−抗体溶液（１００μＬ）に再懸濁し、次に暗所に少なくとも３０分間インキュベートする。ＩＦＡ−Ｔ（２−３ｍＬ）を細胞懸濁物へ添加し、細胞を次にペレットにし、それらをＲＮａｓｅ／ＰＩ溶液（５００μＬ）に再懸濁する。１０分間のインキュベーション後、細胞の懸濁物をポリスチレンの丸底管（５ｍＬ）へ移す。細胞をフローサイトメーターにより分析する。

図３では、２つのパラメーターの記録が、６日後の細胞について示されている。単層として成長した細胞とは対照的に、増殖が活性な細胞（ＢｒｄＵ正細胞）の数は、アルギネート捕捉細胞培養では非常に低いことが示されている。また、これらの細胞について、ｓｕｂＧ１ＤＮＡ含量を有する死滅細胞のフラクションの増加（図３のＲ２ゲート）は、アルギネート集団におけるアポトーシス活性を示している。しかし、ｓｕｂＧ１細胞のフラクションは、非ＲＧＤアルギネートサンプルに比べて、ＲＧＤアルギネートにおいて約５０％低下した（図３）。従って、データは、ＤＮＡ分解が、非ＲＧＤアルギネートに対してＲＧＤアルギネート環境で成長した細胞についてより阻害されたことを示している。アポトーシス的細胞の死滅がアルギネートマトリックス中でＲＧＤを使用することにより阻害されているように思われるという観察は、またさらにＴＵＮＥＬアッセイを用いる独立したデータにより支持された。本発明者の実験は、従って、細胞の付着が、ＲＧＤ結合アルギネートにより支持されるように、幹細胞の集団におけるアポトーシス活性を予防することを明白に示していた。

（材料および方法）
（ＡＴ−ＭＳＣの単離）
ＡＴは、１８−３９歳の健康なドナーから脂肪吸引により得られた。ドナーは、書面によるインホームドコンセントを提供し、そして脂肪組織（ＡＴ）およびＡＴ−ＭＳＣの収集および貯蔵は、ノルウエイの医学研究における倫理に関する地方委員会により承認された。間質の血管フラクション（ＳＶＦ）を、既に記述されたように（Ｂｏｑｕｅｓｔ，２００５２９００）ＡＴから分離した。簡単には、脂肪吸引物（３００−１０００ｍＬ）を、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリンおよび１００ＩＵ／ｍＬのストレプトマイシン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，米国）および２．５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（Ｓｉｇｍａ）を含むフェノールレッドなしのＨａｎｋｓ′平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−ＢＲＬ，Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）により繰り返し洗った。洗ったＡＴを４５分間シェーカーで３７℃で０．１％コラゲナーゼＡタイプ１（Ｓｉｇｍａ）を用いて消化した。１０分間４００ｇで遠心分離後、浮かんだ脂肪細胞を除いた。２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＨＢＳＳに、残ったＳＶＦ細胞を再懸濁した。組織の塊を１分間沈降させた。懸濁した細胞を１００μｍ次に４０μｍの細胞ふるい（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）を通して濾過した。細胞の懸濁物（１５ｍＬ）を、５０ｍＬ容の管中の１５ｍＬのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ勾配分離媒体（ＡｘｉｓＳｈｉｅｌｄ，Ｏｓｌｏ，ノルウエイ）の上に重ねた。遠心分離後（４００ｇ、３０分）、勾配界面の細胞を集め、洗いそして１０％のＦＢＳおよび抗生物質を含む通常の媒体に再懸濁した。細胞の計数および生存可能性の測定は、アクリジンオレンジ／エチジウムブロミド染色および蛍光顕微鏡を用いて行われた。

分離直後、ＡＴ−ＭＳＣを、磁気による細胞の区分けを使用して残りの細胞から単離した。内皮細胞（ＣＤ３１^＋）および白血球（ＣＤ４５^＋）を、マウス抗ヒトＣＤ３１およびＣＤ４５モノクローナル抗体（ＭＡｂ）へ直接結合した磁気ビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｌＢｉｏｔｅｃｈ，ＢｅｒｇｉｓｈＧｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）およびＬＳカラムを用いて除いた。確認のために、フローサイトメトリーにより測定し、そして５％以下のＣＤ３１^＋およびＣＤ４５^＋の細胞が懸濁物に残されていることを観察した。細胞を洗いそして２０％のＦＢＳおよび抗生物質を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの変性したＥａｇｌｅ′ｓ媒体（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）に再懸濁した。

（ＢＭ−ＭＳＣの単離）
骨髄（ＢＭ）（１００ｍＬ）を、書面によるインホームドコンセントの後に健康なボランティアのドナーの腸骨稜から得た。ＢＭおよびＢＭ−ＭＳＣの収集および貯蔵は、医学研究の倫理に関する地域委員会により承認された。吸引物を媒体により１：３に希釈した。細胞の懸濁物（１５ｍＬ）を、５０ｍＬ容管中で１５ｍＬのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ勾配に加えた。２０分間８００ｇでの密度−勾配遠心分離後、単核細胞の層を界面から除き、２回洗い、１ｍＬあたり１０^７細胞でＤＭＥＭ／Ｆ１２に懸濁した。他の付着細胞の発生を減らすために、単核細胞を、製造者の指示に従いマウスＣＤ１４ＭＡｂへ結合した磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ）を用いて除いた。ＣＤ１４細胞を洗い、そして２０％ＦＢＳおよび抗生物質を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の培養フラスコ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｋｉｌｄｅ、デンマーク）中で３７℃および５％含湿ＣＯ_２で一晩接着させた。

（ＢＭ−ＭＳＣおよびＡＴ−ＭＳＣの培養）
ＢＭ−ＭＳＣ培養の１日目で、非付着細胞を含む培地を捨て、培養物をＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）により注意深く洗い、そして培養培地を新しいものに置換した。細胞が５０％の密集になったときに、可塑性の付着をトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）により中断し、細胞を１ｃｍ^２あたり５０００細胞で新しいフラスコに接種した。第１回の継代培養後、アンホテリシンＢを除き、１０％ＦＢＳを培養の持続のために２０％の代わりに用いた。生存細胞をそれぞれの継代培養で計測した。培地を２−３日毎に変えた。

（アルギネートゲルの製造および用途）
低粘度の高グルロン酸のナトリウムアルギネート（ＰＲＯＮＯＶＡＬＶＧ、分子量１３４ｋＤａ、通常のアルギネートとよぶ）、および高グルロン酸アルギネート（ＰＲＯＮＯＶＡＭＶＧ、分子量２９１ｋＤａ）から作られたカスタムメイドのＧＲＧＤＳＰアルギネート（ＮｏｖａｔｅｃｈＲＧＤ、ペプチド／アルギネート分子比約１０／１）がＮｏｖａＭａｔｒｉｘ／ＦＭＣＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒ（Ｏｓｌｏ，ノルウエイ）から得られた。すべての場合でグルロン−マニュロン酸の比は、〜７０：３０比であった。２％のアルギネート溶液は、アルギネート粉末を２５０ｍＭのマンニトール溶液に溶解することにより作られ、室温で一晩攪拌され、次に溶液を０．２２μｍフィルターにより濾過することにより作られた。

アルギネートに内包する前に、５０％の密集で単層ＡＴ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣをトリプシン処理しそして５００μＬの培地に懸濁した。細胞を次に０．５，２．０または５．０×１０^６細胞／ｍＬで適切なアルギネート溶液中に混合した。細胞／アルギネート懸濁物を、静電ビーズ発生器（ＮｉｓｃｏＶＡＲＶＩ、Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）を用いてビーズとしてゲル化した。ビーズを０．５ｍｍ（外径）のノズルを用いて６ｋＶ／ｃｍおよび１０ｍＬ／時で発生させ、５０ｍＭのＣａＣｌ_２溶液中で架橋させた。約２０分間ゲル化溶液中ビーズを貯蔵後、それらを数回培地で洗いそして１０％のＦＢＳおよび抗生物質を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いて培養フラスコ中に保持した。ＭＳＣを有するビーズは、２１日間培養物に維持され、そして培地を３日毎に変えた。ビーズは、７日毎に滅菌濾過した５０ｍＭのＣａＣｌ_２中に浸漬された。異なる時点で異なる分析を行うことができるために、細胞を、５分間１００ｍＭのＥＤＴＡ−ＤＰＢＳ溶液により洗いそして１５分間１５００ｒｐｍで遠心分離することによりアルギネートビーズから放出させた。最後に、細胞をＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁させそして異なる方法で分析した。

（生存アッセイ）
生存／死滅の生存可能性アッセイ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ，米国）を、アルギネート細胞について行った。簡単には、ビーズを沈降させ、そしてＤＰＢＳにより洗った。細胞を、暗所で４５分間室温で、２ｍＬの４．６％滅菌無マンニトール溶液中の８μＬの成分Ｂ（２ｍＭのエチジウムブロミドストック溶液）および２μＬの成分Ａ（４ｍＭのＣａｌｃｅｉｎＡＭストック溶液）とともにインキュベートした。細胞を調べ、そしてビーズ中のすべての細胞の評価を可能にするように焦点距離を変えて、蛍光顕微鏡により計測した。それぞれのアッセイについて１５−２０ビーズを評価で含まれた。このアッセイは、アルギネート中の内包後０，１，３、７、１４および２１日目に行われた。

（アポトーシスアッセイ）
アポトーシスを調べるＴＵＮＥＬアッセイを、ＩｎＳｉｔｕＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＬｔｄ、ＢｕｒｇｅｓｓＨｉｌｌ、英国）を用いて７日間未変性およびＲＧＤアルギネート中で培養した細胞について行った。簡単には、アルギネートビーズを上記のように脱ゲル化し、細胞を単一の細胞の懸濁物に残した。細胞を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドにより固定し、そして１５分間氷上でインキュベートした。固定した細胞をＤＰＢＳにより洗い、２００μＬの０．１％サポニンに再懸濁し、そして１５分間インキュベートして細胞を透過可能にした（氷）。洗浄後、再懸濁した細胞を、暗所（氷）で３７℃で１時間５０μＬのＴＵＮＥＬ反応混合物とともにインキュベートした。細胞を次に洗い、２００μＬのＰＢＳに再懸濁し、そして蛍光顕微鏡で検査した。

（ＢｒｄＵアッセイ）
単層の細胞およびビーズ中の細胞中のＢｒｄＵの結合は、７日目に分析された。それぞれ単層およびアルギネートビーズ内の３×１０^５細胞を２時間１０μＭのＢｒｄＵとともにパルスした。次に、単層の細胞をトリプシン処理し、一方内包された細胞をＣａＣｌ_２により脱ゲル化し、そしてＤＰＢＳにより洗った。細胞を７０％エタノールで固定し、そして２０℃で貯蔵した。２４時間後、細胞を５分間４００ｇの遠心分離により集め、次に１時間ペプシン−ＨＣｌ溶液に再懸濁し、次に０．１Ｍ四硼酸ナトリウム、ｐＨ８．５（３ｍＬ）により中性にした。細胞を免疫蛍光アッセイ緩衝液（ＩＦＡ）（２．３ｍＬ）により１回洗い、次に室温で５分間Ｔｗｅｅｎ２０を含むＩＦＡ（２−３ｍＬ）とともにインキュベートし、ＦＩＴＣ接合抗ＢｒｄＵＭＡｂ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびプロピジウムヨーダイドにより染色した。細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。

（休止ＣＤ８^＋Ｔ細胞の単離）
休止ＣＤ８^＋Ｔ細胞を^３Ｈチミジン結合アッセイにおいて増殖しないコントロール集団として用いた。細胞を、製造者（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）により記載されたようにＰａｎＴＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ、ＣＤ４ＭＡＣＳビーズ、ＬＳカラムおよびＳｕｐｅｒＭＡＣＳ磁石による負の単離を用いて末梢血液単核細胞から単離した。

（チミジン結合アッセイ）
ＤＮＡ合成の目安としての^３Ｈチミジンの吸収を、ＡＴ−ＭＳＣについて５人の異なるドナーおよびＢＭ−ＭＳＣについて３人のドナーについて７日目に検査した。トリプシン処理した単層細胞およびビーズ中のＭＳＣを９６平底穴プレート中１穴あたり１５０００細胞で接種し、各穴において１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含む２００μＬのＤＭＥＭ／１２Ｆ培地中の１μＣｉ^３Ｈチミジンとともにパルスし、そして２４時間５％ＣＯ_２中で３７℃でインキュベートした。ＤＮＡ細胞へ結合された^３Ｈチミジンの量は、ＴｏｐＣｏｕｎｔＮＸＴＳｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ、米国）を用いて測定された。

（細胞表面マーカー分析）
単層およびビーズから脱ゲル化されたＭＳＣを、フローサイトメトリーにより細胞表面マーカーについて７日目に分析した。細胞を、以下の蛋白、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６１、ＣＤ５１、ＣＤ４１に向けられた未接合ＭＡｂ（Ｆ．Ｌ．Ｊｏｈａｎｓｅｎ博士からの好意による）により染色した。免疫ラベルのために、細胞を、氷上で１５分間一次ＭＡｂとともにインキュベートし、洗い、そして氷上で１５分間ＰＥ接合ヤギ抗マウス抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）とともにインキュベートした。洗浄後、細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）により分析した。

（結果）
（通常のアルギネートの培養中のＭＳＣの死滅）
脂肪組織からの単離直後、ＡＴ−ＭＳＣは小さい、規則正しい、丸い形状を有する（図４Ａ）。プラスチック表面上の付着、拡がりおよび増殖後、それらは長い、スピンドル状の形状を得た（図４Ｂ）。下方のプラスチック表面への付着が妨げられたとき、細胞がそれらの以前の形状を得るかどうかを確認するために、細胞をアルギネート（α−Ｌ−グルロン酸およびβ−Ｄ−マンニュロン酸の長鎖からなり、そして細胞のまわりに不活性のスカホールドをもたらす）中に捕捉された。結果は図４Ｃの上方のパネルに示される。この３Ｄシステムで培養されたＭＳＣは、小さく丸いことが分かった。本発明者は、また通常のアルギネートで培養されたＭＳＣが培養でいくらかの時間が経過後高い割合の死滅細胞を示すことを観察した。これらは、生存／死滅アッセイにおける赤血球として見られる（図４Ｃ、上方の中間の図）。通常のアルギネート中の培養における生存および死滅の細胞の割合は定量され、そして図４Ｄの白色の棒で示される。培養３週間後、ほとんどの細胞は死滅した。これらの細胞は、計測できる細胞としてアルギネート中に残存した。それは、細胞の全数の変化がこれらの３週間の培養では無視できるからである（図４Ｅ、白色の棒）。同様な結果は、ＢＭ−ＳＭＣについても得られた。本発明者は、アルギネート中の細胞密度が生存／死滅の結果に影響することが可能であると考え、そのため本発明者は同じ実験を行い、アルギネート１ｍＬあたり０．５×１０^６細胞から作られたビーズ（以前の実験で使用した）中の死滅細胞の数を、アルギネート１ｍＬあたり５×１０^６細胞から作られたビーズ中の死滅細胞の数と比較した。しかし、結果は、ＡＴ−ＳＭＣおよびＢＭ−ＳＭＣの両者について本質的に同じであった（データは示さず）。これらの実験の残りについて、本発明者は２×１０^６細胞／ｍＬの濃度でアルギネート中にＭＳＣを内包することを選んだ。

（ＭＳＣ上のインテグリン分子へのＲＧＤ結合が、細胞の生存を確実にする／アルギネート培養における細胞の死滅を阻害する）
トリペプチドＲＧＤは、ＥＣＭ中の分子のいくつかで見いだされ、細胞の表面でインテグリンヘテロダイマーへ結合し、そして細胞間シグナルを経る細胞の生存に重要である（Ｆｒｉｓｃｈ、１９９７３１３４）。本発明者は、ＲＧＤペプチドがその中に結合されたアルギネート中にＭＳＣを埋め込んだ。その時点では、細胞はまだ小さいかつかなり丸い形状を有したが、細胞の本体からの延長は、しばしば観察されて、周囲の物質への付着を示唆した（図４Ｃ、下方の右パネル）。死滅（赤）細胞は、生存／死滅アッセイでなお観察されたが、通常のアルギネートと殆ど同じではなかった（図４Ｃ、下方の中間のパネル）。ＲＧＤアルギネート培養における生存および死滅の細胞の定量は、図４Ｄ、斜線の棒に示され、そして細胞の１０−１５％が内包で死滅したことを示す。この培養期間中細胞の全数が増加した証拠はなかった（図４Ｅ）。同様な結果は、ＡＴ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣについて得られた。

（通常のアルギネートにおけるＭＳＣは、プログラムされた細胞の死滅により死滅するように極めて思われる）
通常のアルギネートで開始された細胞の死滅のタイプを決めるために、本発明者は、７日目でＴＵＮＥＬアッセイを行った。ＡＴ−ＭＳＣに関する結果を図５Ａに示す。このアッセイにおけるＴＵＮＥＬ＋細胞の割合は、エンドヌクレアーゼ仲介ＤＮＡ鎖の破壊（二本鎖）を有する細胞を同定し、そしてこれらの細胞がプログラムされた細胞の死滅（ＰＣＤ）により死滅することを示す。同様な結果は、ＢＭ−ＳＭＣについても観察された（データを示さず）。

オリゴヌクレオソームサブユニット中へのＤＮＡフラグメント化を示す短いＤＮＡ鎖の存在は、フローサイトメトリーによりｓｕｂＧ１集団として示され定量できる。ｓｕｂＧ１集団についてゲートされた２Ｄおよび３Ｄで培養された７日目のＭＳＣのＢｒｄＵ染色は、図５Ｂに示される。単層で培養された細胞のわずか２−４％がｓｕｂＧ１集団に見いだされ、細胞の死滅が少ない割合であることを示す。通常のアルギネートにおける細胞については、４２％および４９％が、それぞれＡＴ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣについてｓｕｂＧ１集団に見いだされ、一方ＲＧＤアルギネート中の細胞の２１％および２６％が、それぞれＡＴ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣについてｓｕｂＧ１集団に存在した。これは、死滅の態様としてＰＣＤをさらに示し、そして生存／死滅アッセイからの結果を立証する。

（３Ｄアルギネート培養におけるＡＴ−ＭＳＣの大きくない増殖およびＢＭ−ＭＳＣの無増殖）
細胞の計数からの結果は、アルギネート中に埋め込まれたＭＳＣが増殖しないことを示唆した。本発明者は、ＢｒｄＵアッセイを用いて、増殖のレベルを反映すると思われるＳ相にある細胞の数を評価した。単層で培養された高い割合の細胞が、細胞サイクルのＳ相にあることが分かり、一方Ｓ相における内包された細胞の割合は非常に低く、未培養のＡＴ−ＭＳＣについて既述されたのと同じであった（Ｂｏｕｑｕｅｓｔ、２００６３１２８）。増殖を評価する他の方法は、^３Ｈチミジン結合を測定することによる。図５Ｄは、このアッセイが、培養の７−８日目にＡＴ−ＭＳＣについては５人のドナー、ＢＭ−ＭＳＣについては３人のドナーからの細胞について行われた。単層で培養されたすべての細胞において^３Ｈチミジンの大きな吸収があり、高い増殖活性を確認した。通常のアルギネートで培養されたＭＳＣについては、活性は全く観察されなかった。しかし、ＲＧＤアルギネート中で培養されたＡＴ−ＭＳＣについて、本発明者は^３Ｈチミジンの小さい／中程度の吸収を観察した。

（ＲＧＤアルギネート中で培養されたＭＳＣは、ＲＧＤ含有ＥＣＭ蛋白への結合に含まれるインテグリンの発現を保持する）
多数のインテグリンヘテロダイマーが、ＥＣＭ分子中のＲＧＤモチーフへの結合に含まれることが知られている。アルギネート中のＭＳＣの埋め込みが細胞表面においてインテグリンの発現に影響するかどうかを決定するために、本発明者はフローサイトメトリーを用いて、ＲＧＤ結合に含まれるインテグリンモノマーのいくつかの発現レベルを検出した。結果は図６に示される。単層で培養されたＭＳＣは、これらの分子の高い発現を示し、恐らくこれらの分子がプラスチックへのそれらの付着に重要であることを示唆した。通常のアルギネートにおける培養７日後、すべてのこれらのインテグリンは下方調節された。ＣＤ６１を除くすべてのインテグリンは、またＲＧＤアルギネート中で培養されたＭＳＣにおいて下方調節されたが、その程度は、通常のアルギネートで培養された細胞のよりも少ない程度であった。

（ＲＧＤアルギネート中のＭＳＣの捕捉は遺伝子発現における変化を誘発する）
骨髄および脂肪組織（ＡＴ）からのヒト間葉幹細胞をヒトドナーから単離し、そして単層培養として成長させ、その後ＬＶＧアルギネートまたはＲＧＤアルギネートを用いてアルギネートビーズに捕捉させた。アルギネート中の細胞の捕捉は、実施例１に記載したように行った。異なる時点で、５分間１００ｍＭのＥＤＴＡを含むＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）により洗いそして１５分間１５００ｒｐｍで遠心分離することにより、細胞をアルギネートビーズから放出させた。最後に、細胞をＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁しそしてさらに分析した。

ＲＮＡサンプルの調製およびマイクロアレイアッセイは、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓＴｅｃｈｎｉｃａｌＭａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）に従って行われた。簡単には、新しく単離したＡＴ−ＭＳＣ、単層で培養され脱ゲル化されたアルギネート内包細胞（３人のドナーから得られ、７日目）を、それぞれペレットにし、液体窒素中で急速冷凍した。全ＲＮＡをＡｍｂｉｏｎＲＮａｑｕｅｏｕｓ（Ｍｉｒｏ、Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）を用いて細胞から抽出した。新しく単離した未培養の細胞中のＲＮＡが少量のため、ｃＤＮＡを、ＴｗｏＣｙｃｌｅｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＰ／Ｎ９００４３２）を用いて全ＲＮＡ１００ｍｇから調製した。すべてのサンプルについて、１０μｇのｃＲＮＡ１０をＨＧ−Ｕ１３３Ａ＿２アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）へハイブリッドし、２２２７７プローブを提示した。アレイはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐＳｃａｎｎｅｒ３０００７Ｇによりスキャンした。データは、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ、アクセスナンバーＥ−ＭＥＸＰ−１２７３に公表されている。

オープンソースプログラム言語および環境Ｒ（ｈｔｔｐ／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｆｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃ／ＦＡＱ／ＲＦＡＱ．ｈｔｍｉ＃Ｃｉｔｉｎｇ−Ｒ）を、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイの予備プロセシングおよび統計分析のために用いた。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ｛Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ、２００４３１２７｝コンミュニティーを形成し、そしてＲで書かれたマイクロアレイ分析に関する多数のパッケージを維持し、そしていくつかはこの分析に使用された。先ず、アレイのデータは、ｇｃＲＭＡパッケージ｛ＷｕＺ、２００４３１２９｝を用いて正規化された。次に、すべてのアレイでアブセントコールを有するプローブを分析から外した。プレプロセッシングおよび正規化後、実験の線形のモデルは、Ｌｉｍｍａを用いて作られた。このプログラムは、また顕著に特異的に発現されたプローブの統計的テストおよびランキングについて使用された｛ＳｍｙｔｈＧＫ、２００４３１３０｝。Ａｆｆｙを診断プロットおよびフィルタリングについて使用した｛ＧａｕｔｉｅｒＬ、２００４３１３１｝。複数のテストについて調節するために、個々のプローブに関する結果は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ｛Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ、１９９５３１３２｝により調節されたｐ値（但し、ｐ＜０．０１を有意と考える）によりランクされた。

細胞の形状、極性および増殖における変化が、遺伝子発現に強く影響することが示されているので｛Ｙａｍａｄａ、２００７３１２６｝、本発明者は、すべてのこれらのファクターが変化した細胞間に観察される大域ｍＲＮＡ発現における変化を求めることを望んだ。驚いたことには、本発明者は、ｐ＜０．０１でＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇマルチプルテストを使用して、ＲＧＤおよび通常のアルギネートに捕捉された細胞間のｍＲＮＡ発現のレベルにおいて有意な相違は見いだされなかった。これは、これらの細胞におけるＰＣＤで観察される事象が、すべて転写後レベルで生ずることを示唆する。

特異的に発現された遺伝子の本発明者の分析のために、ｐ＜０．０１および＞３倍の変化を用い、本発明者は、４８遺伝子を表すプローブがアルギネート中の捕捉で上方調節されることを見いだした。遺伝子オントロジー分析は、これらの遺伝子が細胞の接着および多数の代謝プロセスに機能的に関連しているだろうことを示した（表５）。上方調節された遺伝子のリストは表１に示される。最も極めて上方調節された遺伝子であるＣＮＩＨは、細胞骨格の分極に関連する蛋白をエンコードする｛Ｒｏｔｈ、１９９５３１２０｝。細胞骨格およびアクチン−ミオシン結合に関連する他の遺伝子は、ＭＬＰＨ、ＡＲＬ４ＣおよびＦＨＯＤ３である。インテグリン（β３、ＣＤ６１）は、ｍＲＮＡのレベルで中程度に上方調節されることが分かった。蛋白レベルでのβ３の発現は、また単層で培養される細胞と比べてＲＧＤアルギネートにおけるＭＳＣにおいて僅かに増大し、ｍＲＮＡレベルでの観察された上方調節と一致した。興味深いことに、ＴＤＯ２遺伝子は、細胞を捕捉したＲＧＤアルギネートにおいて非常に上方調節された。遺伝子の生成物であるトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼは、トリプトファンの異化に含まれる｛Ｔａｋｉｋａｗａ、２００５３１１８｝。トリプトファンの加速された破壊は、ＭＳＣにより仲介される免疫抑制作用に関して重要なメカニズムであることが示唆されている｛Ｍｅｉｓｅｌ、２００４２８５１｝。

ＲＧＤアルギネートにおける捕捉後のＡＴ−ＳＭＣで下方調節された３９遺伝子の遺伝子のオントロジーは、表６に示される。遺伝子の最大のクラスターは、発生、細胞内シグナリングおよび細胞の形態形成に伴うものであった。個々の遺伝子のリストは表２に示される。それは、細胞骨格およびフィラメント生物学に関係する多数の遺伝子である（ＫＲＴ１８、ＦＬＧ、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＶＩＬ２、ＣＡＰ２、ＦＨＬ１、ＬＭＯ７およびＭＦＡＰ５）。遺伝子の３つは、細胞サイクルと関係があるが（ＴＰＤ５２Ｌ１、ＮＥＫ２およびＳＥＰ１１）、一方いくつかの遺伝子は、系統分化と関係がある（軟骨についてＨＡＰＬＮ１；脂肪についてＭＥＳＴおよびＺＦＰ３６１５；心血管および筋肉についてＯＸＴＲ、ＡＣＴＣ、ＴＲＰＣ４、ＡＣＴＡ２およびＰＤＥＩＣ；および神経分化についてＲＧＳ７およびＭＢＰ）。

表７は、アルギネートに捕捉された細胞で上方調節された遺伝子を表す６６５プローブの遺伝子のオントロジーを示す。最も有意に上方調節されたプローブの殆どは、代謝プロセスの範囲と関係のある遺伝子を代表する。また非常に有意なのは、高分子の生合成および細胞局在化および接着を調節する遺伝子のカテゴリーであった。ＭＭＰ１は、アルギネート捕捉細胞に過剰発現される個々の遺伝子のリストのトップで見いだされるが（表３）、ＥＣＭ（ＣＯＭＰ，ＣＯＬＩＩＡＩ、ＰＡＰＰＡ，ＦＮＩ、ＬＴＢＰ１）と関係のある多数の他の遺伝子は、またこれらの細胞で非常に上方調節された。この候補リストの他の機能的にクラスターした遺伝子は、細胞骨格（ＬＰＸＮ、ＤＳＰ、ＭＩＣＡＬ２）および骨形態形成蛋白（ＢＭＰ）、経路（ＧＲＥＭ２、ＧＲＥＭ１、ＴＲＩＢ３、ＬＴＢＰ１）を有する関係するいくつかのものである。ＴＭＥＭ１５８およびＩＴＧＡ１０は、単層で培養された細胞および未培養細胞の両者と比較して、アルギネート捕捉細胞において非常に上方調節され、これらの遺伝子がＲＧＤアルギネート中の捕捉の結果として特異的に上方調節されていることを示唆していることが見いだされた。

ＲＧＤアルギネートに捕捉されたＭＳＣと比較して、予想的に単離され未培養のＡＴ−ＭＳＣは、多数の系統への発生および分化と関係して、クラスターした遺伝子を過剰発現した。表８は、未培養の細胞中で上方調節された５０３プローブの遺伝子のオントロジーを示す。最も非常に上方調節された個々の遺伝子のリストにおいて、ＣＸＣＬ１４が最高にランクされ、次はＢＭＰ拮抗物ＣＨＲＤＬ１である。遺伝子オントロジーのリストを立証するために、脂肪（ＣＦＤ、ＡＰＯＤ、ＳＥＰＰ１、ＦＡＢＰ４、Ｃ７，ＬＰＬ１６およびＡＡＤＡＣ）および骨軟骨分化（ＳＰＡＲＣＬ１、ＩＴＭ２Ａ、ＣＩＬＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＯＭＤおよびＯＧＮ）に関係する多数の遺伝子が見いだされた。

この目的のために、広い範囲の２Ｄおよび３Ｄ組織培養の方法が記載されている。ＭＳＣについて、実際的にすべての公表されたデータは、２Ｄ培養の細胞に基づいている。これは、プラスチック表面への付着が、細胞が増殖してアッセイまたは処理のプロトコールに必要な細胞の数を生ずることを必要としているからであり、さらにまたプラスチック表面上の継代が、ＭＳＣと現在規定されている細胞の集団について選択されるからである｛Ｄｏｍｉｎｉｃｉ、２００６３０４３｝。しかし、形態における変化、細胞骨格の分極、付着の性質およびプラスチック付着により誘発される細胞の分裂の速度は、ＭＳＣ生物学における劇的な変化を導く｛Ｙａｍａｄａ、２００７３１２６｝｛Ｂｏｑｕｅｓｔ、２００５２９００｝。本発明を導く仮説は、単層で拡大したＭＳＣを３Ｄ培養へ移すことによりこれらの変化の多くを逆転することができるかもしれないということであった。本発明者は、３Ｄ培養におけるＭＳＣでは、細胞の形状、サイズおよび細胞の分裂の速度は、未培養のＭＳＣについて観察されるものと同様であった｛Ｂｏｑｕｅｓｔ、２００５２９００｝。しかし、本発明で提供される条件下では、２Ｄで拡大されそして次に３Ｄ培養で確立されるＭＳＣのトランスクリプトームは、新しく単離された未培養のＭＳＣについて観察されるそれとは遙かに隔たっていた。それらは新しく単離されたＭＳＣよりもプラスチック付着細胞に近いように思われるが、３Ｄ培養におけるＭＳＣの遺伝子発現プロフィルは、それらがＭＳＣの別の第３の集団であると考えざるを得ないことを示唆している。

（多発性硬化症（ＭＳ）の治療におけるアルギネートに捕捉された自己由来幹細胞の使用）
既述の実施例は、ＭＳＣがプラスチック表面（２Ｄ）で多くの数に拡大でき、次にアルギネートに捕捉され、そしてもしトリペプチドＲＧＤがアルギネートに結合されるならば、細胞は、高い生存可能性で検討の期間中生存することを記述している。大域遺伝子発現分析（実施例４）は、アルギネートに捕捉された細胞が２Ｄで培養された細胞とは異なり、そして未培養の形で単離直後に調べられた細胞とは異なることが立証されている｛Ｄｕｇｇａｌら、未公表｝。これらの細胞は、ＭＳＣの新しい第３の集団を表すものと思われる。治療の目的で、アルギネートを完全に取り去り、３Ｄ細胞の形態学的および分子的な特徴を有する単一の細胞の懸濁物で細胞を残す。

ＭＳの治療において２Ｄで培養された細胞より良好な、アルギネート中で培養された細胞では、それらは、多い数で損傷の部位で利用できるか、または損傷の部位で高能率で働くか、または有害な作用を生ずることがなさそうか、またはこれらの任意の組み合わせでどうかが必要になる。ＭＳにおいてＭＳＣを使用しようとするには、細胞の静脈内（ＩＶ）注射または他の投与に基づくことになるだろう。２Ｄで培養されたＭＳＣは、大きな細胞であり、プラスチック表面へのそれらの付着後、接着分子の高い密度を示す。これは、ＩＶ注射後、これらの細胞が出会う最初の毛管網状構造（肺網状構造である）に保持される主な理由と思われる。そこでは、ＭＳＣの多くは死滅してしまう（例えばＫｒａｉｔｃｈｍａｎｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ２００５；１１２：１４５１）。本発明者の研究では、本発明者は、アルギネート中の培養後ＭＳＣがより小さくなり、そして今までテストされたすべてのインテグリン（α３、５およびＶ、β１および３）がより低い濃度を表すことを示した。従って、細胞は、肺を循環し逃れるチャンスがより高いと思われる。

神経疾患で有効であると報告されているＭＳＣの作用の正確なメカニズムは知られていないが、免疫抑制作用、ニューロン、グリア細胞および希突起グリア細胞への分化転換並びに再ミエリン化を含むものと思われる。ＭＳＣにより働く免疫抑制作用では、作用のメカニズムは完全に解明されていない。しかし、トリプトファンの加速された劣化の誘発が、最も重要なものであることが示唆されている｛Ｍｅｉｓｅｌら、Ｂｌｏｏｄ、２００４；１０３；４６１９｝。アルギネートに捕捉されたＭＳＣが２Ｄで拡大されたＭＳＣより優れている１つのメカニズムは、酵素であるトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）の作用によるものであり、それはトリプトファンの劣化を触媒化し（Ｍｕｒｒａｙ、ＣｕｒｒＤｒｕｇＭｅｔａｂ２００７、８；１９７）、そして２ＤのＭＳＣに比べてアルギネートに捕捉されたＭＳＣ中のｍＲＮＡレベルでほぼ１００倍上方調節されている（実施例４）。ＭＳＣの作用の他の可能なメカニズムについて、どんな分子のメカニズムも解明されていない。恐らく、前臨床および臨床の試験は、アルギネートに捕捉されたＭＳＣがこれらの領域で有利であることを示すだろう。臨床の応用において、それらの２Ｄの対応物よりも３Ｄで培養された細胞が良好であるという先例が存在する。例えば、ＭＳＣは、軟骨細胞へ分化するのに３Ｄで培養される必要がある（Ｓｅｋｉｙａら、ＰＮＡＳ２００２；９９；４３９７）。他の例は、筋肉組織への筋芽細胞の分化である（Ｈｉｌｌら、ＰＮＡＳ２００６；１０３；２４９４）。

Claims

１つ以上の幹細胞を捕捉しているとともに、少なくとも１つの細胞付着ペプチドが共有結合により結合している少なくとも１つのアルギネート鎖部分を含み、さらにエンドトキシンの含有量が１ｇあたり５００ＥＵ以下であることを特徴とする１つ以上の幹細胞捕捉変性アルギネートを含む生体構造物。
該生体構造物が、ゲル、発泡体、ビーズ、スカホールド、繊維、フェルト、スポンジまたはこれらの組み合わせである請求項１の生体構造物。
該細胞付着ペプチドが１つ以上のＲＧＤ配列を含む請求項１または２の生体構造物。
該幹細胞が間葉幹細胞である請求項１−３の何れか１つの項の生体構造物。
該幹細胞が、該変性アルギネート中に捕捉される前に単層として維持されている請求項１−４の何れか１つの項の生体構造物。
請求項１−３の何れか１つの項の生体構造物から単離されていることを特徴とする複数の幹細胞。
少なくとも１つの細胞付着ペプチドが共有結合により結合している少なくとも１つのアルギネート鎖部分を含む変性アルギネートを含む構造中に幹細胞を捕捉することにより請求項１−５の何れか１つの項の生体構造物を製造する工程を含み、該変性アルギネートは１ｇあたりのエンドトキシンの含有量が５００ＥＵ以下であることを特徴とする複数の幹細胞を生成する方法。
該捕捉された幹細胞が、少なくとも３時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間および少なくとも７２時間からなる群から選ばれる時間、該生体構造物中に維持される請求項７の方法。
該幹細胞が該生体構造物から単離される請求項７または８の方法。
該幹細胞が、該生体構造物へ少なくとも１つのカチオン結合剤を加えることにより該生体構造物から単離される請求項９の方法。
該カチオン結合剤が、シトレート、ラクテート、ホスフェート、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの少なくとも１つを含む請求項１０の方法。
請求項７−１１の何れか１つの項の方法により生成された複数の幹細胞を、治療上の利益をもたらすのに有効な量で含むことを特徴とする神経細胞を含む損傷または変性疾患の治療剤。
個人が神経の障害を含む損傷を有する請求項１２の剤。
個人が神経学的異常を有する請求項１２の剤。
変性疾患が、アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）すなわちルーゲリック病；粥状硬化症；癌；糖尿病；心臓疾患；ハンチントン病（ＨＤ）；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；ムコ多糖症；多発性硬化症（ＭＳ）；ノリエ病；パーキンソン病；前立腺炎；骨関節炎；骨粗鬆症；シャイ・ドレイジャー症候群；および卒中からなる群から選ばれる請求項１２の剤。