KR20100044173A

KR20100044173A - 줄기 세포에 대해 펩타이드 연결된 세포 기질 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20100044173A
Application number: KR1020107000802A
Authority: KR
Inventors: 잔 엔겔센 브린크만; 카트린 브조네벡 프론스달; 잔 에질 멜비크
Original assignee: 에프엠씨 코포레이션
Priority date: 2007-06-13
Filing date: 2008-06-13
Publication date: 2010-04-29
Also published as: WO2008157324A2; WO2008157324A3; US20100239540A1; EP2152860A2; CN101778936A; EP2152860A4; IL202583A0; US20120276066A1; JP2010529858A; AU2008266019A1

Abstract

본 발명은 하나 이상의 줄기 세포를 포착하는 개질된 알기네이트를 포함하는 생체구조에 관한 것이다. 개질된 알기네이트는 하나 이상의 세포 접착 펩타이드를 공유 결합시킴으로써 결합되는 하나 이상의 알기네이트 쇄 구역을 포함한다. 또한, 복수개의 줄기 세포가 개시되어 있다. 줄기 세포 및 그로부터 분화된 세포의 사멸 방지 방법이 개시되어 있다. 복수개의 줄기 세포의 제조 방법이 개시되어 있다. 줄기 세포를 퇴행성 질환, 예컨대 신경계 장애 또는 신경 손상 관련 상해를 갖는 개체에게 투여함으로써 상기 개체를 치료하는 방법이 개시된다.

Description

줄기 세포에 대해 펩타이드 연결된 세포 기질 및 이의 사용 방법{PEPTIDE LINKED CELL MATRIX MATERIALS FOR STEM CELLS AND METHODS OF USING THE SAME}

본 발명은 줄기 세포, 줄기 세포를 포함하는 조성물, 세포 부착 펩타이드를 사용하여 줄기 세포 및 줄기 세포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법, 및 줄기 세포 및 줄기 세포를 포함하는 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

세포 유전자 발현, 표현형 및 기능에 영향을 미치는 미세 환경 특성의 인식은 의학 용도를 위한 인공 조직을 유전공학 처리하기 위해 보다 나은 접근을 제공할 뿐만 아니라 세포를 보다 잘 이해하는 데 있어 중요하다. 정상적인 환경에서, 포유류의 세포는 이웃 세포 뿐만 아니라 주변의 세포외 기질, 성장 인자 및 사이토카인으로 이루어진 복잡하고 역동적인 미세 환경 내에 묻힌다. 세포외 기질 골격으로의 세포 부착은 특이적 세포 표면 수용체를 통한 세포외 기질 단백질로의 물리적 결합을 포함한다. 이들 중, 인테그린은 세포내 세포골격을 세포외 기질로 결합시키는데 책임이 있는 주요 막횡단 수용체이다. 부착 과정은 성장, 이동 및 분화와 같은 세포 거동의 변화를 이끌 수 있는 연쇄적인 세포내 신호 사건을 촉발시킨다. 콜라겐과 같이 천연 세포외 기질로부터 유래된 물질은 인테그린을 통한 세포 접착을 촉진시키는 천연 부착 리간드를 제공하기 때문에, 이들은 조직의 유전공학 처리를 위한 생물질의 유전공학 처리에 있어 출발점이었다. 그러나, 콜라겐 및 다른 생물학적 물질의 주요 단점은 그의 화학 및 물리적 특성을 조절하는 능력이 제한된다는 것이다. 그러나, 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)과 같이 세포 부착을 개시하는 짧은 펩타이드 서열의 발견은 부착 펩타이드가 컨쥬게이트될 수 있는 중합체의 개발을 허용하였다.

이러한 관점에서 매우 촉망받는 특성을 갖는 중합체의 한 그룹은 알기네이트이다. 알기네이트는 생리학적으로 적절한 온도에서 전개되고 설정되는 열-안정한 겔을 형성한다는 독특한 능력을 갖는 친수성 해양 생체중합체이다. 알기네이트는 1-4 글리코사이드로 연결된 β-D-마누론산(M)과 α-L-글루론산(G) 잔기의 비분지형 2원 공중합체의 계열이다. 두 개의 우론산 단량체의 상대적인 양 및 중합체 쇄에 따른 그의 서열 배열은 알기네이트의 기원에 따라 크게 달라진다. 알기네이트는 해양 갈조류에서의 구조 중합체이며, 또한 특정 박테리아에 의해 생성된다. RGD와 같은 펩타이드가 알기네이트에 공유 결합될 수 있으며, 알기네이트를 구성하는 겔 구조가 세포 부착을 지지할 수 있는 것으로 입증되어 왔다.

조직의 유전공학 처리에서 또 다른 중요한 요소는 이용될 세포의 공급원이다. 미성숙 세포가 특수화된 조직을 갖는 완전 분화된 세포보다 시험관내에서 보다 높은 정도로 번식할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 완전 분화된 세포의 시험관내 번식과 대조적으로, 상기 미성숙 또는 전구 세포는 시험관내에서 몇몇 세대 후에 분화되어 작용하도록 유도될 수 있다. 또한, 이들은 그들이 거주하는 환경의 기능에 따라 특이적 조직내에서 발견되는 대부분의 특수화된 세포로 분화되는 능력을 갖는 것으로 보인다. 따라서, 줄기 세포는 조직의 유전공학 처리를 위해 선택된 세포일 수 있다.

현행 기법은 단층 배양으로서 시험관내 줄기 세포의 배양을 허용한다. 그러나, 줄기 세포를 특이적 표현형으로 분화시키기 위해서, 3차원 환경에서 세포 기능, 증식 및 분화에 대한 최적 조건을 제공하는 생체 적합한 기질에 대한 요구가 존재한다.

로우슬라티(E.Ruoslahti)및파스쿠알리(R.Pasqualini),RGD-결합부위의구조모방,1998년미국특허제5,817,750호.

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본 발명은 하나 이상의 줄기 세포를 포착하는 개질된 알기네이트를 포함하는 생체구조에 관한 것이다. 개질된 알기네이트는 하나 이상의 세포 접착 펩타이드를 공유 결합시킴으로써 결합되는 하나 이상의 알기네이트 쇄 구역을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 생체구조로부터 단리된 복수개의 줄기 세포에 관한 것이다.

더 나아가, 본 발명은 3차원 생체구조에서 줄기 세포 및 그로부터 분화된 세포에 의해 유전자 발현 변화를 유도하는 방법에 관한 것이다. 3차원 생체구조는 하나 이상의 세포 접착 펩타이드를 공유 결합시킴으로써 결합되는 하나 이상의 알기네이트 쇄 구역을 포함하는 개질된 알기네이트를 포함한다. 상기 방법은 생체구조 내에서 줄기 세포 및 그로부터 분화된 세포를 포착하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 복수개의 줄기 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 하나 이상의 줄기 세포를 공여자로부터 수득하는 단계, 및 공여자로부터 수득된 줄기 세포를 줄기 세포가 단층으로서 성장하고 증식하는 조건하에 유지시키는 단계를 포함한다. 그 후, 줄기 세포는 하나 이상의 세포 접착 펩타이드를 공유 결합시킴으로써 결합되는 하나 이상의 알기네이트 쇄 구역을 포함하는 개질된 알기네이트를 포함하는 생체구조에 포착된 후 상기 생체구조로부터 단리된다.

추가적으로, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 복수개의 줄기 세포에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 퇴행성 질환, 예컨대 신경계 장애, 또는 신경 손상과 관련된 상해를 갖는 개체에게 상기 줄기 세포를 투여함으로써 상기 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 줄기 세포가 증식하는 조건하에 하나 이상의 세포 접착 펩타이드를 공유 결합시킴으로써 결합되는 하나 이상의 알기네이트 쇄 구역을 포함하는 개질된 알기네이트를 포함한 생체구조에서 줄기 세포를 배양시키는 단계, 및 상기 줄기 세포를 신경계 장애 또는 신경 손상과 관련된 상해를 갖는 개체에게 치료학적 이점을 제공하는 효과량 및 효과적인 부위에서 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.

도 1은 공유 결합된 RGD 서열이 있거나 없는 알기네이트로 구성된 알기네이트 비드에서의 포착 후 상이한 시간에서 지방 유래된 사멸 줄기 세포의 분율 데이터를 보여준다. 또한, 사멸 세포의 분율은 10 배 증가된 세포 밀도를 갖는 알기네이트 비드(닫힌 기호)에서 기록된다. 평균의 표준 오차는 상기 기호를 초과하는 경우에 나타난다.
도 2는 공유 결합된 RGD 서열이 있거나 없는 알기네이트로 구성된 알기네이트 비드에서의 포착 후 상이한 시간에서 골수 유래된 사멸 줄기 세포의 분율 데이터를 보여준다. 또한, 사멸 세포의 분율은 10 배 증가된 세포 밀도를 갖는 알기네이트 비드(닫힌 기호)에서 기록된다. 평균의 표준 오차는 상기 기호를 초과하는 경우에 나타난다.
도 3은 BrdU(FL1) 및 프로피듐 아이오다이드(FL2)로 염색된 골수 줄기 세포의 두 개의 매개변수의 유세포 분석 기록으로부터의 데이터를 보여준다. 게이트 영역(R2)은 sub G1 DNA-함량(무생육성 세포)을 갖는 세포의 분율을 보여준다.
도 4의 패널 a는 공급 물질로부터 예상되는 단리 직후 취한 줄기 세포의 사진을 보여준다. 접착 및 확산 전에, 비배양된 AT-MSC는 작고 둥굴다. 도 4의 패널 b는 단층에서 2D의 시험관내 배양 후에 취한 줄기 세포의 사진을 보여준다. AT-MSC는 방추-형상의 형태를 채택한다. 도 4의 패널 c의 상부 패널의 왼쪽과 오른쪽은 정상 알기네이트에 포착된 줄기 세포의 사진을 보여준다. MSC는 구형으로 복귀하지만 다수의 세포는 7일째에 사멸한다(도 4의 패널 c의 상부의 중간 패널은 왼쪽 패널과 동일하지만 백색광 대신에 형광을 사용하였다). 도 4의 패널 c의 하부 패널의 오른쪽은 RGD 알기네이트에서의 줄기 세포를 보여준다. 세포는 세포체로부터 돌출된 연장부를 갖는 것으로 보일 수 있으며, 사멸 세포 7일의 비율은 훨씬 낮다(도 4의 패널 c의 하부의 중간 패널은 형광이다). 정상 알기네이트에서 사멸 세포의 비율은 3D 배양시에 21일 내내 증가하였지만(도 4의 패널 d의 회색 막대), RGD 알기네이트에서 사멸 세포의 비율은 이러한 배양 기간 내내 낮고 상당히 안정하였다(도 4의 패널 d의 검정 막대). 살아있는 세포와 사멸 세포의 총 수는 AT-MSC(도 4의 패널 e의 왼쪽 패널) 또는 BM-MSC(도 4의 패널 e의 오른쪽 패널)의 경우 정상 알기네이트(회색 막대) 또는 RGD 알기네이트(검정 막대)에서 배양 과정 중에 변하지 않는다. 약간 상이한 수의 세포가 AT-MSC 및 BM-MSC에 대한 비드 마다 시딩된다.
도 5는 정상 알기네이트에서 MSC의 사멸이 PCD에 의한 것임을 보여준다. 도 5의 패널 a는 정상 알기네이트에서 배양 7일째에 AT-MSC에 대해 수행된 TUNEL 분석의 결과를 보여주며, 이는 형광(상부) 및 백색광(하부)에서 동일한 세포임을 보여준다. 7일째 PCD의 양은 AT-MSC(도 5의 패널 b의 왼쪽) 및 BM-MSC(도 5의 패널 b의 오른쪽)에 대한 단층 배양(도 5의 패널 b의 상부), 정상 알기네이트(도 5의 패널 b의 중간) 및 RGD 알기네이트(도 5의 패널 b의 하부)에서 세포에 수행되는 BrdU 분석시 subG1 개체군을 게이팅함으로써 정량화된다. 그 수는 subG1 게이트에서의 세포의 비율이다. 단일 실험으로부터의 결과가 각 세포 개체군에 대한 2번의 실험을 대표한다. 세포 주기의 S-기에서 살아있는 세포의 비율은 BrdU 분석으로부터 subG1 개체군을 제거하고, 그 후 S-기에서 세포를 게이팅(도 5의 패널 c)함으로써 정량화된다. 그 수는 S-기에서 살아있는 세포의 비율이다. 단층 배양시의 세포 및 7일 동안 정상 알기네이트 또는 RGD-알기네이트에서 배양된 세포를 비교하는 5개의 공여자로부터의 AT-MSC(도 5의 패널 d의 상부) 및 3개의 공여자로부터의 BM-MSC(도 5의 패널 d의 하부)에 대한 3H 티미딘 혼입 분석(도 5의 패널). 새롭게 단리된 T-세포는 3H 티미딘을 혼입할 것 같지 않은 세포에 대한 실험 대조군으로서 사용된다.
도 6은 단층(상부), 정상 알기네이트(중간) 및 RGD 알기네이트(하부 패널)에서 배양된 세포 상의 인테그린 단량체의 발현의 유세포 분석을 보여준다.

알기네이트에 공유 결합된 세포 접착 펩타이드는 세포 기질 물질로서 줄기 세포 및 그로부터 분화되는 세포를 지지한다. 공유 결합된 세포 접착 펩타이드를 갖는 알기네이트 비드에서 배양된 줄기 세포는 공유 결합된 세포 접착 펩타이드가 없는 알기네이트로 이루어진 비드에서 배양된 줄기 세포와 비교할 경우 유전자 발현 프로파일의 변화를 겪는다. 몇몇 실험시에, 알기네이트에 공유 결합된 세포 접착 펩타이드는 세포 생존을 유지하는데 도움이 되는 것으로 관찰되었다.

공급 물질로부터 수득된 줄기 세포가 단층으로서 배양되는 경우 유전자 발현이 변화한다. 또한, 단층으로서 배양된 줄기 세포가 단층으로부터 제거되고 공유 결합된 세포 접착 펩타이드를 갖는 알기네이트 비드에서 배양되는 경우, 유전자 발현 프로파일은 더욱 변화된다. 단층을 통해 통과되고 공유 결합된 세포 접착 펩타이드를 갖는 알기네이트에서 배양된 줄기 세포는 공급 물질로부터 수득된 비배양된 줄기 세포의 발현 프로파일과 상이한 발현 프로파일을 갖는다. 임의의 이론에 얽매이지 않으면서, 알기네이트에 공유 결합된 세포 접착 펩타이드를 갖는 알기네이트가 줄기 세포 부착을 지지하고, 유전자 발현 변화를 촉진시킴에 따라, 세포가 세포자멸사(또는 세포 사멸의 다른 형태)를 겪는 것을 방지할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 그러한 알기네이트에 공유 결합된 세포 접착 펩타이드를 갖는 알기네이트는 유전자 발현의 변화를 촉진시키고 몇몇 경우 줄기 세포 생존을 유지시키는 방식으로 상이한 생체구조에서 사용될 수 있다. 상기 알기네이트 생체구조는 알기네이트 겔을 포함하지만, 또한 포말 또는 섬유 구조 및 기타를 포함할 수 있다.

본 발명의 알기네이트가 줄기 세포의 발현 프로파일을 변화시킨다는 발견은 개체로의 후속 투여를 포함함 다양한 방법에 사용하기 위해 세포의 개체군을 확장시키고 유지시키는 줄기 세포의 배양뿐만 아니라 조직의 유전공학 처리 분야에 사용될 수 있다.

본 발명의 한 양태는 세포 부착 펩타이드-연결된 알기네이트, 예컨대 알기네이트에 공유 결합된 RGD-펩타이드를 포함한 3차원 생체구조 및 겔에서 생육 줄기 세포를 포함하는 그로부터 제조된 생체구조 내에서 줄기 세포를 통과시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 적합한 생체 구조는 포말, 필름, 겔, 비드, 스폰지, 펠트, 섬유 및 이의 조합을 포함한다.

세포 또는 다른 구성물을 함유하는 알기네이트 겔 구조의 한 특성은 포착된 물질이 겔이 용해된 후에 방출될 수 있다는 것이다. 알기네이트에 공유 결합된 세포 접착 펩타이드를 갖는 알기네이트는 포착된 줄기 세포를 방출시킴으로써 용해될 수 있다. 이는 시트레이트, 락테이트 또는 포스페이트와 같은 양이온 결합제를 사용함으로써 수행될 수 있다. 이는 줄기 세포(및 그로부터 분화된 세포)가 겔 구조로부터 제거될 수 있고 그의 특성이 특별한 분야에 관하여 시험될 수 있기 때문에 매우 유용한 특성을 유지한다. 그 후, 세포는 특이적 유전자의 발현, 표면 발현 또는 다른 발현에 대해 시험될 수 있다. 또한, 방출된 줄기 세포(및 그로부터 분화된 세포)는 단층 배양으로서 더욱 배양되거나, 또는 조직 구조체로서 사용하기 위한 알기네이트 겔 또는 다른 것과 같은 3차원 구조에서, 세포 캡슐화 시스템 또는 다른 것으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 줄기 세포가 공급원으로부터 수득되고 단층으로서 배양되어 세포 증식을 촉진한 후 수를 확장시키고, 그 후 세포 부착 펩타이드-연결된 알기네이트를 포함한 생체구조에서 포착되고 유지될 수 있으며 그 후 세포가 생체구조로터 단리되며, 줄기 세포의 개체군은 단층 확장된 개체군과 상이한 유전자 발현 패턴으로 수득됨이 제공된다. 유전자 발현 패턴의 이러한 차이는 줄기 세포의 개체군을 퇴행성 질환과 같은 질환의 치료 및 개체로의 투여에 특히 유용하게 만든다.

단층으로서 배양된 세포가 세포 부착 펩타이드-연결된 알기네이트를 포함하는 생체구조 내에 포착되는 경우, 세포는 형태 및 유전자 발현이 변화된다. 세포는 일반적으로 구형이 되고, 유전자 발현 변화 중에서 인테그린을 암호화하는 유전자의 발현이 변화한다. 세포는 유전자 발현을 위한 충분한 시간 동안 생체구조에서 포착됨으로써 유지되어 단층으로서 배양된 세포에 의해 나타난 발현 프로파일로부터 생체구조에 유지된 세포에 의해 나타난 안정한 유전 발현 프로파일로 변화한다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 3시간 이상 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 6시간 미만 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 6시간 이상 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 9시간 미만 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 9시간 이상 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 12시간 미만 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 12시간 이상 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 18시간 미만 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 18시간 이상 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 24시간 미만 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 24시간 이상 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 36시간 미만 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 36시간 이상 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 48시간 미만 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 48시간 이상 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 72시간 미만 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 72시간 이상 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 4일 이상 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 5일 이상 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 6일 이상 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 1주 이상 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 2주 이하 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 3주 이하 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 생체구조의 제거 전에 4주 이하 동안 생체구조에 포착됨으로써 유지된다.

본 발명의 다른 양태는 줄기 세포가 공급원으로부터 수득되고, 세포 부착 펩타이드-연결된 알기네이트를 포함하는 생체구조에서 포착되고 배양될 수 있으며 그 후 세포가 생체구조로터 단리되며, 줄기 세포의 개체군은 단층 확장된 개체군과 상이한 유전자 발현 패턴으로 수득됨을 제공한다. 상기 실시양태에서, 선택된 줄기 세포는 지방 조직으로부터 유래된 줄기 세포와 같이 상기 조건 하에 증식될 수 있는 것들이 바람직하다. 상기 줄기 세포는 개체로의 투여 및 퇴행성 질환과 같은 질환의 치료에 유용할 수 있다.

몇몇 실시양태에서 따라, 줄기 세포는 비제한적으로 RGD 모티프를 갖는 것과 같은 세포 접착 펩타이드에 공유 결합된 알기네이트 중합체를 포함하는 알기네이트 중합체로부터 제조된 알기네이트 기질에서 배양된다. 상기 기질에서 배양된 상기 줄기 세포는 신경계 질환, 예컨대 파킨슨병, HD(헌팅톤 질환), 뇌졸증, 점액다당류증 및 MS(다발성 경화증)의 치료, 및 신경 손상과 관련된 상해, 예컨대 척수 손상의 치료에 유용할 수 있다. 상기 줄기 세포는 환자에게, 예컨대 뇌, 척주 또는 치료적 효과를 부여할 수 있는 적절한 다른 부위로 삽입될 수 있다.

본 발명의 줄기 세포는 치료적 효과가 바람직한 부위에서 또는 전신으로 삽입과 같은 임의의 전달 방식에 의해 환자에게 전달될 수 있다. 투여 방식은 직접 주사 또는 삽입을 포함한다. 본 발명의 줄기 세포는 조성물 또는 장치의 일부로서 또는 캡슐화 또는 비캡슐화 세포로서 전달될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 줄기 세포는 정맥내로, 수막강내로, 피하로, 기관의 조직으로 직접적으로, 윤할 공간 및 척주와 같은 공간 및 강으로 직접적으로 또는 신경 경로로 전달된다. 본 발명의 줄기 세포의 정맥내 투여는 폐에서 줄기 세포의 축적을 덜 일으킬 수 있으며, 그의 페턴은 줄기 세포가 단층으로서 배양된 직후 정맥내로 투여되는 경우 관찰된다.

본 발명의 줄기 세포는 퇴행성 질환, 즉 병에 걸린 조직 또는 기관의 기능 또는 구조가 점차적으로 시간에 따라 악화되는 질환의 치료에 유용할 수 있다. 퇴행성 질환의 예는 알쯔하이머병; 근위축성 측삭 경화증(ALS), 즉 로우 게흐리그(Lou Gehrig) 질환; 죽상동맥경화증; 암; 당뇨병; 심장 질환; 헌팅톤병(HD); 염증성 창자 질환(IBD); 점액다당류증; 다발 경화증(MS); 노리에(Norrie) 병; 파킨슨병; 전립선염; 골관절염; 골다공증; 쉬-드라거(Shy-Drager) 증후군; 및 뇌졸증을 포함한다.

임의의 줄기 세포가 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 줄기 세포는 지방 또는 골수로부터 유래된 것들과 같은 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 줄기 세포는 자가 조직이다. 즉, 이들은 그들 및 그의 자손이 삽입될 개체로부터 유래된다.

본원에서 참고로서 인용되는 미국 특허 제 4,988,621 호, 제 4,792,525 호, 제 5,965,997 호, 제 4,879,237 호, 제 4,789,734 호 및 제 6,642,363 호는 다수의 예를 개시하고 있다. 적합한 펩타이드는 약 10개 미만의 아미노산을 갖는 펩타이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 세포 접착 펩타이드는 RGD, YIGSR (서열 식별 번호: 1), IKVAV (서열 식별 번호: 2), REDV (서열 식별 번호: 3), DGEA (서열 식별 번호: 4), VGVAPG (서열 식별 번호: 5), GRGDS (서열 식별 번호: 6), LDV, RGDV (서열 식별 번호: 7), PDSGR (서열 식별 번호: 8), RYVVLPR (서열 식별 번호: 9), LGTIPG (서열 식별 번호: 10), LAG, RGDS (서열 식별 번호: 11), RGDF (서열 식별 번호: 12), HHLGGALQAGDV (서열 식별 번호: 13), VTCG (서열 식별 번호: 14), SDGD (서열 식별 번호: 15), GREDVY (서열 식별 번호: 16), GRGDY (서열 식별 번호: 17), GRGDSP (서열 식별 번호: 18), VAPG (서열 식별 번호: 19), GGGGRGDSP (서열 식별 번호: 20) 및 GGGGRGDY (서열 식별 번호: 21) 및FTLCFD (서열 식별 번호: 22)를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 세포 접착 펩타이드는 RGD, YIGSR (서열 식별 번호: 1), IKVAV (서열 식별 번호: 2), REDV (서열 식별 번호: 3), DGEA (서열 식별 번호: 4), VGVAPG (서열 식별 번호: 5), GRGDS (서열 식별 번호: 6), LDV, RGDV (서열 식별 번호: 7), PDSGR (서열 식별 번호: 8), RYVVLPR (서열 식별 번호: 9), LGTIPG (서열 식별 번호: 10), LAG, RGDS (서열 식별 번호: 11), RGDF (서열 식별 번호: 12), HHLGGALQAGDV (서열 식별 번호: 13), VTCG (서열 식별 번호: 14), SDGD (서열 식별 번호: 15), GREDVY (서열 식별 번호: 16), GRGDY (서열 식별 번호: 17), GRGDSP (서열 식별 번호: 18), VAPG (서열 식별 번호: 19), GGGGRGDSP (서열 식별 번호: 20) 및 GGGGRGDY (서열 식별 번호: 21) 및 FTLCFD (서열 식별 번호: 22)를 포함하고, 추가의 아미노산, 예컨대 N 또는 C 말단에서 비제한적으로 1 내지 10G 잔기를 포함하는 1 내지 10개의 추가의 아미노산을 추가로 포함한다. 예를 들면, 적합한 펩타이드는 식 (Xaa)_n-SEQ-(Xaa)_n을 가질 수 있으며, 여기서 Xaa는 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, n은 0 내지 7이고, 서열은 RGD, YIGSR (서열 식별 번호: 1), IKVAV (서열 식별 번호: 2), REDV (서열 식별 번호: 3), DGEA (서열 식별 번호: 4), VGVAPG (서열 식별 번호: 5), GRGDS (서열 식별 번호: 6), LDV, RGDV (서열 식별 번호: 7), PDSGR (서열 식별 번호: 8), RYVVLPR (서열 식별 번호: 9), LGTIPG (서열 식별 번호: 10), LAG, RGDS (서열 식별 번호: 11), RGDF (서열 식별 번호: 12), HHLGGALQAGDV (서열 식별 번호: 13), VTCG (서열 식별 번호: 14), SDGD (서열 식별 번호: 15), GREDVY (서열 식별 번호: 16), GRGDY (서열 식별 번호: 17), GRGDSP (서열 식별 번호: 18), VAPG (서열 식별 번호: 19), GGGGRGDSP (서열 식별 번호: 20) 및 GGGGRGDY (서열 식별 번호: 21) 및 FTLCFD (서열 식별 번호: 22)로 이루어진 군 중에서 선택된 펩타이드 서열이고, 아미노산의 총 수는 22개 미만, 바람직하게는 20개 미만, 바람직하게는 18개 미만, 바람직하게는 16개 미만, 바람직하게는 14개 미만, 바람직하게는 12개 미만, 바람직하게는 10개 미만이다. RGD 모티프를 포함하는 세포 접착 펩타이드는 몇몇 실시양태에서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 길이일 수 있다. 예로는 RGD, GRGDS (서열 식별 번호: 6), RGDV (서열 식별 번호: 7), RGDS (서열 식별 번호: 11), RGDF (서열 식별 번호: 12), GRGDY (서열 식별 번호: 17), GRGDSP (서열 식별 번호: 18), GGGGRGDSP (서열 식별 번호: 20) 및 GGGGRGDY (서열 식별 번호: 21)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 세포 접착 펩타이드는 RGD, YIGSR (서열 식별 번호: 1), IKVAV (서열 식별 번호: 2), REDV (서열 식별 번호: 3), DGEA (서열 식별 번호: 4), VGVAPG (서열 식별 번호: 5), GRGDS (서열 식별 번호: 6), LDV, RGDV (서열 식별 번호: 7), PDSGR (서열 식별 번호: 8), RYVVLPR (서열 식별 번호: 9), LGTIPG (서열 식별 번호: 10), LAG, RGDS (서열 식별 번호: 11), RGDF (서열 식별 번호: 12), HHLGGALQAGDV (서열 식별 번호: 13), VTCG (서열 식별 번호: 14), SDGD (서열 식별 번호: 15), GREDVY (서열 식별 번호: 16), GRGDY (서열 식별 번호: 17), GRGDSP (서열 식별 번호: 18), VAPG (서열 식별 번호: 19), GGGGRGDSP (서열 식별 번호: 20) 및 GGGGRGDY (서열 식별 번호: 21) 및 FTLCFD (서열 식별 번호: 22)로 이루어진다. 세포 접착 펩타이드가 GRGDY (서열 식별 번호: 17)로 이루어진 몇몇 실시양태에서, 생체구조는 생성되는 경우 2 × 10⁶세포/mL 미만 또는 2 × 10⁷세포/mL 초과를 포함한다. 세포 접착 펩타이드가 GRGDY (서열 식별 번호: 17)로 이루어진 몇몇 실시양태에서, GRGDY (서열 식별 번호: 17)로 이루어진 세포 접착 펩타이드를 갖는 알기네이트 쇄 구역을 포함하는 개질된 알기네이트 이외에, 개질된 알기네이트가 GRGDY (서열 식별 번호: 17)와 다른 세포 접착 펩타이드를 갖는 동일하고/하거나 상이한 알기네이트 쇄 구역을 또한 포함한다면 생체구조는 생성되는 경우 2 × 10⁶세포/mL 내지 2 × 10⁷세포/mL를 포함한다.

본원에서 참고로서 인용되는 미국 특허 제 6,642,363 호는 알기네이트 중합체에 공유 결합하는 세포 접착 펩타이드를 개시한다.

몇몇 실시양태에서, 공유 결합된 세포 접착 펩타이드를 포함하는 정제된 알기네이트는 내독소를 제거하도록 정제된다. 몇몇 실시양태에서, 공유 결합된 세포 접착 펩타이드를 포함하는 정제된 알기네이트는 < 500EU/g 내독소를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 공유 결합된 세포 접착 펩타이드를 포함하는 정제된 알기네이트는 < 250EU/g 내독소를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 공유 결합된 세포 접착 펩타이드를 포함하는 정제된 알기네이트는 < 200EU/g 내독소를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 공유 결합된 세포 접착 펩타이드를 포함하는 정제된 알기네이트는 < 100EU/g 내독소를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 공유 결합된 세포 접착 펩타이드를 포함하는 정제된 알기네이트는 < 50EU/g 내독소를 포함한다. 세포 접착 펩타이드가 GRGDY (서열 식별 번호: 17)로 이루어진 몇몇 실시양태에서, 공유 결합된 세포 접착 펩타이드를 포함하는 정제된 알기네이트는 < 50EU/g 내독소를 포함한다. 세포 접착 펩타이드가 GRGDY (서열 식별 번호: 17)로 이루어진 몇몇 실시양태에서, 공유 결합된 세포 접착 펩타이드를 포함하는 정제된 알기네이트는 GRGDY (서열 식별 번호: 17)로 이루어진 세포 접착 펩타이드를 갖는 정제된 알기네이트 이외에, 정제된 알기네이트가 GRGDY (서열 식별 번호: 17)와 다른 세포 접착 펩타이드를 갖는 동일하고/하거나 상이한 알기네이트 쇄 구역을 또한 포함한다면 < 50EU/g 내독소를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 세포는 알기네이트 기질 내에서 캡슐화된다. 기질은 일반적으로 회전 타원체이다. 몇몇 실시양태에서, 기질은 불규칙 형태이다. 일반적으로, 알기네이트 기질은 효과적인 수의 세포를 축적할 만큼 충분히 커야하며 동시에 기질의 외부 표면의 표면적이 기질 내의 부피에 비해 충분히 크도록 충분히 작아야 한다. 본원에서 사용되는 알기네이트 기질의 크기는 본질적으로 회전 타원체인 기질에 대하여 일반적으로 표시되며, 크기는 최대 단면적 치수로서 표시된다. 구형 기질의 경우, 상기 단면적 치수는 직경이다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 기질은 회전 타원체이고, 그의 크기는 약 20 내지 약 1000 ㎛이다. 몇몇 실시양태에서 알기네이트 기질의 크기는 100 ㎛ 미만, 예컨대 20 내지 100 ㎛이고, 몇몇 실시양태에서 알기네이트 기질의 크기는 800 ㎛ 초과, 예컨대 800 내지 1000 ㎛이다. 몇몇 실시양태에서 알기네이트 기질의 크기는 약 100 ㎛이고, 몇몇 실시양태에서 알기네이트 기질의 크기는 약 200 ㎛이고, 몇몇 실시양태에서 알기네이트 기질의 크기는 약 300 ㎛이고, 몇몇 실시양태에서 알기네이트 기질의 크기는 약 400 ㎛이고, 몇몇 실시양태에서 알기네이트 기질의 크기는 약 500 ㎛이고, 몇몇 실시양태에서 알기네이트 기질의 크기는 약 600 ㎛이고, 몇몇 실시양태에서는 약 700 ㎛이다.

몇몇 실시양태에서, 알기네이트 기질은 칼슘, 바륨, 아연 및 구리 및 이의 조합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 겔화 이온을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 기질의 알기네이트 중합체는 50% 초과의 α-L-글루론산을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 기질의 알기네이트 중합체는 60% 초과의 α-L-글루론산을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 기질의 알기네이트 중합체는 60% 내지 80%의 α-L-글루론산을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 기질의 알기네이트 중합체는 65% 내지 75%의 α-L-글루론산을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 기질의 알기네이트 중합체는 70% 초과의 α-L-글루론산을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 기질의 알기네이트 중합체는 20 내지 500 kD의 평균 분자량을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 기질의 알기네이트 중합체는 50 내지 500 kD의 평균 분자량을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 알기네이트 기질의 알기네이트 중합체는 100 내지 500 kD의 평균 분자량을 갖는다.

세포는 광범위한 농도에 걸쳐 캡슐화될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 알기네이트의 ml 당 1 × 10⁴개 미만의 세포 내지 알기네이트의 ml 당 1 × 10⁸개 초과의 세포 농도로 포착된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 알기네이트의 ml 당 1 × 10⁴개의 세포 내지 알기네이트의 ml 당 1 × 10⁸개의 세포 농도로 포착된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 알기네이트의 ml 당 1 × 10⁵개의 세포 내지 알기네이트의 ml 당 5 × 10⁷개의 세포 농도로 포착된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 알기네이트의 ml 당 1 × 10⁶개의 세포 내지 알기네이트의 ml 당 5 × 10⁷개의 세포 농도로 포착된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 알기네이트의 ml 당 5 × 10⁵개의 세포 내지 알기네이트의 ml 당 5 × 10⁷개의 세포 농도로 포착된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 알기네이트의 ml 당 2 × 10⁶개의 세포 내지 알기네이트의 ml 당 2 × 10⁷개의 세포 농도로 포착된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 알기네이트의 ml 당 5 × 10⁵개의 세포 내지 알기네이트의 ml 당 1 × 10⁷개의 세포 농도로 포착된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 알기네이트의 ml 당 5 × 10⁵개의 세포 내지 알기네이트의 ml 당 5 × 10⁶개의 세포 농도로 포착된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 알기네이트의 ml 당 약 2 × 10⁶개의 세포 농도로 포착된다.

단리된 줄기 세포는 세포 증식을 지지하는 조건 하에 알기네이트-펩타이드 기질에서 배양될 수 있다. 다차원 섭스트레이트로서 알기네이트-펩타이드 기질을 사용하여, 세포 개체군은 높은 세포 생육도로 효율적으로 확장될 수 있다.

이어서 줄기 세포의 개체군은 신경계 장애, 예컨대 파킨슨병, HD(헌팅톤 질환), 뇌졸증, 점액다당류증 및 MS(다발성 경화증)의 치료, 및 신경 손상과 관련된 상해, 예컨대 척수 손상의 치료에 사용될 수 있다. 그러한 줄기 세포는 알기네이트 기질로부터 단리되어 환자 또는 기질이 삽입될 수 있는 줄기 세포로 삽입될 수 있다. 삽입은 뇌 또는 척주 또는 신경 손상의 다른 부위에서 치료적 효과를 부여할 수 있는 적절한 부위에서 이루어질 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 줄기 세포 개체군은 하기 표 1에 나타난 바와 같은 유전자 발현 특성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 줄기 세포 개체군은 하기 표 2에 나타난 바와 같은 유전자 발현 특성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 줄기 세포 개체군은 하기 표 3에 나타난 바와 같은 유전자 발현 특성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 줄기 세포 개체군은 하기 보충 표 1a에 나타난 바와 같은 유전자 발현 특성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 줄기 세포 개체군은 하기 보충 표 2a에 나타난 바와 같은 유전자 발현 특성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 줄기 세포 개체군은 하기 보충 표 3a에 나타난 바와 같은 유전자 발현 특성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 줄기 세포 개체군은 하기 보충 표 4a에 나타난 바와 같은 유전자 발현 특성을 갖는다.

[실시예]

실시예 1: RGD 펩타이드를 갖는 알기네이트 비드에서 인간 중간엽 줄기 세포의 포착

지방(도 1) 및 골수(도 2)로부터의 인간 중간엽 줄기 세포를 인간 공여자로부터 단리하고 알기네이트 비드에서 포착하였다. 세포를 높은 G 농도(약 70%, PRONOVA LVG)로 2% 알기네이트의 용액에서 혼합하고, 약 400 ㎛의 비드를 겔화 욕으로서 50 mM CaCl₂용액과 함께 니스코(Nisco) VAR V1 정전기 비드 발생기를 사용함으로써 생성시켰다. 알기네이트 배치 중 하나는 중합체에 공유 결합된 RGD 펩타이드를 함유하였다. 세포 밀도를 하나의 실험에서 대략 80 내지 100 세포/비드로 조정하였고 다른 실험에서는 10배 이상으로 조정하였다. 겔화 후에, 줄기 세포를 함유하는 비드는 CO₂ 배양기에서 세포 배양 배지를 갖는 조직 배양 플라스크에서 보관하였다. 살아있는 세포와 사멸 세포의 분율은 상이한 시간에서 형광 현미경을 사용함으로써 생사 분석(live dead assay)(몰레큘러 프로브(Molecular Probes, L3224))에 의해 염색된 몇몇 비드에서의 세포를 계수하여 계산하였다. 줄기 세포 유형 둘 모두의 경우, 세포의 총 수가 실험 전체에 걸쳐(21일) 매우 적게 변하는 것으로 관찰되었다. 그러나, 세포 유형 둘 다의 경우(도 1 및 도 2), 생존한 세포의 수는 비 RGD-알기네이트 비드에서 포착된 세포의 경우 매우 급격하게 감소하였다. 따라서, 상기 데이터는 세포 접착에 대한 지지 외에도 RGD-알기네이트 세포 결합이 놀랍게도 알기네이트 겔 기질 내에서 세포 사멸을 방지하는데 있어 중요하다는 것을 증명하였다. 또한, 세포 생존에 대한 세포와 세포의 상호작용 효과를, 세포 농도를 10배 증가시킴으로써 실험에서 연구하였다. 도 1 및 도 2의 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 세포 농도가 증가하는 경우 LVG 알기네이트 비드에서 시간에 따른 세포 사멸에 대한 효과는 단지 매우 적거나 거의 없었다. 세포 유형 둘 다의 경우, 알기네이트 비드 세포 밀도는 RGD-알기네이트에 의한 세포 사멸 방지 능력에 큰 영향을 주지 않았다.

RGD-알기네이트 기질이 세포 생존을 향상시킬 수 있다는 점에서, 그러한 특성은 알기네이트에 의한 새로운 생의학 분야에서, 특히 세포 캡슐화 및 줄기 세포의 배양을 위한 조직의 유전공학 처리에서 유용한 부가적인 특성이 될 수 있다.

실시예 2: RGD-알기네이트에서 포착된 골수 유래된 줄기 세포에 대한 억제된 세포자멸사의 증명

골수로부터의 인간 중간엽 줄기 세포를 인간 공여자로부터 단리하고 단층 배양으로서 성장시키거나 LVG-알기네이트 또는 RGD-알기네이트를 사용하여 알기네이트 비드에서 포착하였다. 알기네이트에서의 세포의 포착을 실시예 1에 기재한 바와 같이 수행하였다. 알기네이트 세포 개체군을 탈겔화시킴으로써 단일 세포 현탁액으로서 준비하였다. BrdU(10 μM의 최종 농도)를 세포 배양물에 1 1/2h에 첨가한 후 4℃에서 10분 동안 300 × g에서 원심분리에 의해 수확하였다. 펠릿을 100 μl 차가운 PBS에서 재현탁하고, 세포를 70% 에탄올(4 ml)을 첨가함으로써 고정시켰다. 튜브를 몇 회 역전시킨 후 -20℃에서 밤새(18시간 이상) 보관하였다. 그 후, 세포를 원심분리에 의해 모으고, 펠릿을 펩신-HCl 용액(1 ml)에서 재현탁하였다. 정확히 30분 배양 후에, 0.1 M 사붕산나트륨, pH 8.5(3 ml)를 첨가함으로써 산을 중화시켰다. 세포를 펠릿화하고, IFA(2 내지 3 ml)로 1회 세척한 후 IFA-T(2 내지 3 ml)로 실온에서 5분 동안 배양하였다. 다시 세포를 펠릿화하고, BrdU-항체 용액(100 μl)에서 재현탁한 후 암실에서 30분 이상 동안 배양하였다. IFA-T(2 내지 3 ml)를 세포 현탁액에 첨가하고, 그 후 세포를 펠릿화한 후 이들을 RNase/PI 용액(500 μl)에서 재현탁하였다. 10분의 배양 후, 세포 현탁액을 폴리스타이렌 둥근 바닥 튜브(5 ml)로 옮겼다. 세포를 유세포 분석기로 분석하였다.

도 3에, 6일 후 세포에 대한 두 개의 매개변수 기록이 나타나 있다. 단층으로서 성장한 세포와 반대로, 활동적으로 증식하는 세포(BrdU 양성 세포)의 수는 알기네이트 포착된 세포 배양물에서 매우 낮은 것으로 보여진다. 또한, 이들 세포에 있어서, 증가된 분율의 사멸 세포가 존재하며 이때 sub G1 DNA 함량(도 3에서 R2-게이트)은 알기네이트 개체군에서의 세포자멸 활성을 나타낸다. 그러나, sub G1 세포의 분율은 비 RGD-알기네이트 샘플(도 3)과 비교할 경우 RGD 알기네이트에서 대략 50% 만큼 감소하였다. 그러므로, 상기 데이터는 DNA 분해가 비-RGD 알기네이트와 비교하여 RGD 알기네이트 환경에서 성장한 세포의 경우 더욱 억제됨을 명확하게 보여준다. 또한, 세포자멸 세포 사멸이 알기네이트 기질에서 RGD를 사용하여 억제되는 것으로 보인다는 관찰은 TUNEL 분석을 사용하는 독립 데이터에 의해 더욱 지지된다. 따라서, 이번 실험은 RGD 결합 알기네이트에 의해 지지되는 바와 같이 세포 접착이 줄기 세포 개체군에서 세포자멸 활성을 방지한다는 것을 명백하게 보여준다.

실시예 3

물질 및 방법

AT-MSC의 단리

AT는 18 내지 39세의 건강한 공여자로부터 지방흡입에 의해 얻었다. 공여자에게 정보 서면 동의서가 제공되었고, 지방 조직(AT) 및 AT-MSC의 수집 및 보관은 노르웨이의 의학 연구 윤리를 위한 지역 위원회에 의해 승인되었다. 기질 혈관 분획(SVF)을 상기 기재한 바와 같은 AT로부터 분리하였다{Boquest, 2005 2900/id}. 요약하면, 리포아스피레이트(300 내지 1000 ml)를 100 IU/ml 페니실린 및 100 IU/ml 스트렙토마이신(미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)) 및 2.5 μg/ml 암포테리신 B(시그마)를 함유하는 페놀 레드(영국 페이즐리 소재의 라이프 테크놀로지스-BRL(Life Technologies-BRL)) 없이 행크(Hank)의 평형 염 용액(HBSS)으로 반복하여 세척하였다. 세척된 AT를 0.1% 콜라게나제 A 유형 1(시그마)을 사용하여 37℃에서 진탕기 상에서 45분 동안 분해시켰다. 10분 동안 400g에서 원심분리 후, 부유하는 지방세포를 제거하였다. 남아있는 SVF 세포를 2% 우 태아 혈청(FBS)을 함유하는 HBSS에서 재현탁시켰다. 조직 덩어리를 1분 동안 정착시켰다. 현탁된 세포를 100 ㎛ 체를 통해 여과한 후 40 ㎛ 세포 체를 통해 여과하였다(미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)). 세포 현탁액(15 ml)을 50 ml 튜브에서 15 ml 림포프레프(Lymphoprep) 구배 분리 배지(노르웨이 오슬로 소재의 액시스 쉴드(Axis Shield))로 층화시켰다. 원심분리(400g, 30분) 후에, 구배 계면에서의 세포를 모으고, 세척한 후, 10% FBS 및 항생제를 함유하는 정상 배지에서 재현탁시켰다. 아크리딘 오렌지/에티듐 브로마이드 염색 및 형광 현미경을 사용하여 세포 계수 및 생육성 평가를 수행하였다.

분리 직후, 자석 세포 분류를 사용하여 남아있는 세포로부터 AT-MSC를 단리하였다. 마우스 항-인간 CD31 및 CD45 단클론성 항체(MAb)에 직접 연결된 자석 비드(독일 베르그쉬 글라드배치 소재의 밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotech)) 및 LS 컬럼을 사용하여 내피 세포(CD31⁺) 및 백혈구(CD45⁺)를 제거하였다. 증명하기 위해, 유세포 분석에 의해 측정하였고 CD31+ 및 CD45+ 세포의 5% 이하가 현탁액에 남아있는 것으로 관찰되었다. 세포를 세척하고 20% FBS 및 항생제를 함유하는 둘베코(Dulbecco)의 개질된 이글(Eagle) 배지(DMEM)/F12(영국 페이즐리 소재의 깁코(Gibco))에서 재현탁하였다.

BM-MSC의 단리

골수(BM)(100 ml)를 정보 서면 동의서를 작성한 후에 건강한 자발적 공여자의 장골릉으로부터 얻었다. BM 및 BM-MSC의 수집 및 보관은 의학 연구 윤리를 위한 지역 위원회에 의해 승인되었다. 아스피레이트를 배지에 의해 1:3으로 희석하였다. 세포 현탁액(15 ml)을 50 ml 튜브에서 15 ml 림포프레프 구배로 적용하였다. 20분 동안 800g에서 밀도-구배 원심분리 후, 단핵 세포 층을 계면으로부터 제거하고, 2회 세척하고, ml 당 10⁷개의 세포에서 DMEM/F12 중에 현탁하였다. 다른 부착 세포의 발생을 줄이기 위해, 제조자의 충고에 따라 마우스 항-인간 CD14 MAb에 연결된 자석 비드(밀테니)를 사용하여 단핵구를 제거하였다. CD14^- 세포를 세척하고 20% FBS 및 항생제를 갖는 DMEM/F12 배지 중 배양 플라스크(덴마크 록스킬드 소재의 눈크(Nunc))에서 5% 습한 CO₂를 사용하여 37℃에서 밤새 부착시켰다.

BM-MSC 및 AT-MSC의 배양

BM-MSC 배양 1일째에, 비부착 세포를 갖는 배지를 버리고, 배양물을 DPBS(깁코)에서 조심스럽게 세척하고, 배양 배지를 새로운 부분으로 교체하였다. 세포가 50% 합류에 도달할 때, 가소성 부착은 트립신-EDTA(시그마)에 의해 저지되었고, 세포를 5,000 세포/cm²에서 새로운 플라스크로 접종하였다. 첫 번째 통과 후, 암포테리신 B를 제거하였고, 배양물의 지속 기간 동안 10% FBS를 20% FBS 대신에 사용하였다. 각각의 통과시에 살아있는 세포를 계수하였다. 배지를 2 내지 3일 마다 교체하였다.

알기네이트 겔의 제조 및 사용

저점도, 고 글루론산 나트륨 알기네이트(프로노바(Pronova) LVG, MW 134 kDa, 본원에서는 정상 알기네이트로 지칭됨) 및 고 글루론산 알기네이트(프로노바 UP MVG, MW 291 kDa)로부터 제조된 맞춤형 GRGDSP 알기네이트(노바테크(Novatech) RGD, 대략 10/1의 펩타이드/알기네이트 분자비)를 노바매트릭스(NovaMatrix)/FMC 바이오폴리머(노르웨이 오슬로 소재)로부터 입수하였다. 모든 경우에서 글루론산-마누론산 비율은 약 70:30 비율이었다. 250 mM 만니톨 용액에서 알기네이트 분말을 용해시킴으로써 2% 알기네이트 용액을 제조하고, 실온에서 밤새 교반한 후 용액을 0.22 μM 필터를 통해 여과하였다.

알기네이트에서의 캡슐화 전에, 50% 합류에서 AT-MSC 및 BM-MSC의 단층을 트립신 처리하고 500 μl 배지에서 현탁하였다. 그 후, 세포를 0.5, 2.0 또는 5.0 × 10⁶ 세포/ml에서 적절한 알기네이트 용액으로 혼합하였다. 세포/알기네이트 현탁액을 정전기 비드 발생기(스위스 취리히 소재의 니스코(Nisco) VAR V1)를 사용하여 비드로서 겔화하였다. 비드를 0.5 mm(외경) 노즐을 사용하여 6 kV/cm 및 10 ml/hr에서 발생시키고 50 mM CaCl₂ 용액에서 교차 결합시켰다. 약 20분 동안 겔화 용액에서 비드를 보관한 후, 이들은 배지로 수회 세척하고 10% FBS 및 항생제를 함유하는 DMEM/F12 배지를 사용하여 배양 플라스크에서 유지하였다. MSC를 갖는 비드를 21일 동안 배양물에서 유지시키고 배지는 매 3일째에 변경하였다. 비드를 매 7일째에 무균-여과된 50 mM CaCl₂에 담궜다. 상이한 지점에서 상이한 분석을 수행하기 위해, 세포를 5분 동안 100 mM EDTA-DPBS 용액으로 세척하여 알기네이트 비드로부터 방출시키고 15분 동안 1500 rpm에서 원심분리하였다. 최종적으로, 세포를 DPBS(깁코)에서 재현탁하고 상이한 분석으로 분석하였다.

생육성 분석

생/사 생육성 분석(미국 오레곤주 유진 소재의 인비트로겐 몰레큘러 프로브스(Invitrogen Molecular Probes))을 알기네이트된 세포에서 수행하였다. 요약하면, 비드를 정착시키고 DPBS로 세척하였다. 세포를 암실에서 45분 동안 실온에서 4.6% 무균 만니톨 부재 용액 2 ml 중 성분 B(2 mM 에티듐 브로마이드 원료 용액) 8 μl 및 성분 A(칼세인 AM 원료 용액 4 mM) 2 μl를 사용하여 배양하였다. 세포를 실험하고 형광 현미경으로 계수하였고 초점 거리를 바꾸어 비드에서의 모든 세포를 평가하였다. 각각의 분석에서, 15 내지 20개의 비드가 평가에 포함되었다. 이 분석은 알기네이트에서 캡슐화한 후 0, 1, 3, 7, 14 및 21일 째에 수행하였다.

세포자멸 분석

동일계 세포 사멸 검사 키트(In Situ Cell Death Detection Kit)(영국 버게스 힐 소재의 로슈 다이아그노스틱스 리미티드(Roche Diagnostics Ltd))를 사용하여 7일 동안 개질되지 않은 알기네이트 및 RGD 알기네이트에서 배양된 세포에 대해 세포자멸을 검사하기 위한 TUNEL 분석을 수행하였다. 요약하면, 알기네이트 비드를 상기 기재한 바와 같이 탈겔화시켜 단일 세포 현탁액에 세포를 남겼다. 세포를 4%(w/v) 파라포름알데하이드로 고정시키고 15분 동안 얼음 위에서 배양하였다. 고정된 세포를 DPBS로 세척하고, 0.1% 사포닌 200 μl에서 재현탁하고 15분 동안 배양하여 세포를 침투시켰다(얼음). 세척 후, 재현탁된 세포를 암실(얼음)에서 1시간 동안 37℃에서 50 μl TUNEL 반응 혼합물과 함께 배양하였다. 그 후, 세포를 세척하고, PBS 200 μl에서 재현탁한 후 형광 현미경으로 검사하였다.

BrdU 분석

단층 세포 및 비드 중의 세포에서 BrdU의 혼입을 7일째에 분석하였다. 단층 및 알기네이트 비드내에서 3 × 10⁵개의 세포에 각각 2시간 동안 BrdU 10 μM를 펄스하였다. 그 후, 단층 세포를 트립신 처리하면서, 캡슐화된 세포를 CaCl₂로 탈겔화하고 DPBS로 세척하였다. 세포를 70% 에탄올에서 고정시키고 -20℃에서 보관하였다. 24시간 후, 세포를 5분 동안 400g에서 원심분리에 의해 모으고, 그 후 1시간 동안 펩신-HCl 용액에서 재현탁한 후 pH 8.5(3 ml)의 0.1 M 사붕산나트륨에 의해 중화시켰다. 세포를 면역형광 분석 완충액(IFA)(2 내지 3 ml)을 사용하여 1회 세척한 후 IFA 함유 트윈(Tween) 20(2 내지 3 ml)과 함께 5분 동안 실온에서 배양한 후 FITC-컨쥬게이트된 항-BrdU MAb(BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences)) 및 프로피듐 아이오다이드로 염색하였다. FACS칼리버(FACSCalibur) 유세포 분석기(BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 세포를 분석하였다.

나머지 CD8+ T 세포의 단리

나머지 CD8+ T를 ³H 티미딘 혼입 분석에서 증식하지 않은 대조군 개체군으로서 사용하였다. 제조자(밀테니 바이오테크)에 의해 기재된 바와 같이 판(Pan) T 단리 키트, CD4 MACS 비드, LS 컬럼 및 슈퍼MACS 자석에 의한 음성 단리를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포로부터 세포를 단리하였다.

티미딘 혼입 분석

³H 티미딘의 흡수, 즉 DNA 합성의 측정을 7일째에 AT-MSC의 경우에는 5명의 상이한 공여자에게서 시험하고 BM-MSC의 경우에는 3명의 공여자에게서 시험하였다. 비드 중 트립신화된 단층 세포 및 MSC를 96 평평한 바닥 웰 판에서 웰 당 15,000 세포에서 시딩하고, 각각의 웰에서 10% FBS 및 항생제를 함유하는 DMEM/F12 배지 200 μl에서 1μCi ³H 티미딘으로 펄스하고 24시간 동안 5% CO₂에서 37℃에서 배양하였다. DNA 세포로 혼입된 ³H 티미딘의 양을 탑카운트(TopCount) NXT 섬광 계수기(미국 코네티컷주 메리덴 소재의 팩커드(Packard))를 사용하여 측정하였다.

세포 표면 마커 분석

비드로부터 단층 및 탈겔화된 MSC를 유세포 분석기에 의해 세포 표면 마커에 대해 7일째에 분석하였다. 세포를 다음의 단백질: CD49e, CD29, CD49c, CD61, CD51, CD41(요한센(F.L. Johansen)으로부터의 기증된 종류)에 대해 지시된 비컨쥬게이트된 MAb로 염색하였다. 면역레벨링을 위해, 세포를 얼음 위에서 15분 동안 1차 MAb와 함께 배양하고, 세척하고, PE-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 항체(미국 앨라배마주 버밍함 소재의 사우썬 바이오테크놀로지 어소씨에이션(Southern Biotechnology Association))로 얼음 위에서 15분 동안 배양하였다. 세척 후, 세포를 유세포 분석기(FACS칼리버)에 의해 분석하였다.

결과

정상 알기네이트의 배양물에서 MSC의 사멸

지방 조직으로부터의 단리 즉시, AT-MSC는 작고, 규칙적이며 둥근 형태를 갖는다(도 4a). 가소성 표면으로의 접착, 확산 및 증식 후에, 이들은 길고, 방추형과 같은 형태를 획득한다(도 4b). 하부의 가소성 표면으로의 접착이 붕괴되는 경우 세포가 그의 이전 형태를 얻는지 여부를 결정하기 위해, 세포를 알기네이트에서 포착하였으며, 이는 α-L-글루론산 및 β-D-마누론산의 긴 쇄로 이루어지고, 세포 주변에 불활성 골격을 제공한다. 결과는 도 4c의 상부 패널에서 확인된다. 이 3D 시스템에서 배양된 MSC는 작고 둥근 것으로 밝혀졌다. 또한, 정상 알기네이트에서 배양된 MSC는 배양 중 얼마 후에 높은 비율의 사멸 세포가 나타나는 것으로 관찰되었다. 이들은 생/사 분석에서 적색 세포로서 보여졌다(도 4c의 상부의 중간 이미지). 정상 알기네이트의 배양물에서 살아있는 세포와 사멸 세포의 비율을 정량화하고, 이를 도 4d의 회색 막대로 나타내었다. 배양 3주 후에, 대다수의 세포가 사멸하였다. 이들 세포는 가산 세포로서 알기네이트에 잔류하였고, 이는 세포의 총수의 변화가 배양 3주 과정에서 무시할만하기 때문이다(도 4e의 회색 막대). 유사한 결과가 BM-MSC에 대해 얻어졌다. 알기네이트에서의 세포 밀도가 생/사 결과에 영향을 미치는 것으로 생각되며, 따라서 동일한 실험을 수행하여 (이전 실험에서 사용되는) 알기네이트 ml 당 0.5 × 10⁶개의 세포로 이루어진 비드에서의 사멸 세포의 수를 알기네이트 ml 당 5 × 10⁶개의 세포로 이루어진 비드에서의 사멸 세포의 수와 비교하였다. 그러나, 결과는 AT-MSC 및 BM-MSC 둘 다에 대해 본질적으로 동일하였다(데이터는 나타내지 않음). 이들 실험의 나머지 동안, 2 × 10⁶ 세포/ml의 농도에서 알기네이트 중 MSC를 캡슐화하도록 선택하였다.

MSC 상의 인테그린 분자로의 RGD 결합은 세포 생존을 보장하고/알기네이트 배양 중 세포 사멸을 억제한다.

트라이펩타이드 RGD는 ECM 중 몇몇 분자에서 발견되며, 세포 표면 상의 인테그린 헤테로이량체에 결합하고, 세포내 신호를 통한 세포 생존을 위해 중요하다{Frisch, 1997 3134/id}. RGD 펩타이드가 혼입되는 알기네이트에 MSC를 파묻었다. 본원에서, 세포는 여전히 작고 상당히 둥근 형태를 가졌지만, 세포의 몸으로부터의 연장부가 종종 관찰될 수 있으며, 이는 주변 물질로의 접착을 시사한다(도 4c의 하부의 오른쪽 패널). 사멸 (적색) 세포는 여전히 생/사 분석에서 관찰될 수 있지만 정상 알기네이트에서 만큼 많지는 않다(도 4c의 하부의 중간 패널). RGD 알기네이트 배양물에서 살아있는 세포 및 사멸 세포의 정량화가 도 4d의 검정 막대로 나타나 있으며, 세포의 10 내지 15%가 캡슐화시에 사멸하는 것으로 보인다. 이 배양 기간에 걸쳐 세포의 총수가 증가한다는 증거가 없다(도 4e). 유사한 결과가 AT-MSC 및 BM-MSC에서 관찰되었다.

정상 알기네이트에서 MSC는 거의 대부분 프로그램된 세포 사멸에 의해 사멸한다.

사멸 세포의 유형이 정상 알기네이트에서 시작하는지를 결정하기 위해서, 7일째에 TUNEL 분석을 수행하였다. AT-MSC에 대한 결과가 도 5a에 나타나 있다. 이 분석에서 TUNEL+ 세포의 비율은 엔도뉴클레아제-매개된 DNA 스트랜드 파괴(이중-스트랜드)를 갖는 세포로 간주하였고, 이들 세포가 프로그램된 세포 사멸(PCD)에 의해 사멸하는 것으로 가리켰다. 유사한 결과가 BM-MSC에 의해 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).

올리고뉴클레오좀 아단위로의 DNA 분절을 나타내는 짧은 DNA 스트랜드의 존재가 확인될 수 있으며 유세포 분석기에 의해 subG1 개체군으로서 정량화되었다. 2D 및 3D로 배양되고, subG1 개체군에 대해 게이트된 7일째의 MSC의 BrdU 염색이 도 5b에 나타나 있다. 단층에서 배양된 세포의 단 2 내지 4%만이 subG1 개체군에서 발견되었으며, 이는 적은 비율의 세포 사멸을 가리킨다. 정상 알기네이트 중의 세포 중에서, 42 내지 49%가 AT- 및 BM-MSC 각각에 대한 subG1 개체군에서 발견되었지만, RGD 알기네이트 중 세포의 21 내지 26%는 AT- 및 BM-MSC 각각에 대한 subG1 개체군에서 발견되었다. 이는 더 나아가 사멸 방식으로서 PCD를 가리키며, 생/사 분석으로부터의 결과를 실증하였다.

3D 알기네이트 배양물에서 AT-MSC의 적당한 증식 및 BM-MSC의 증식 없음

세포 계수로부터의 결과는 알기네이트에 파묻힌 MSC가 증식되지 않았음을 시사하였다. BrdU 분석을 사용하여 S-기인 세포의 수를 평가하였고, 이는 증식 수준을 반영하였다. 단층에서 배양된 높은 비율의 세포가 세포 주기의 S 기에서 발견되었지만, S 기에서 캡슐화된 세포의 비율은 비배양된 AT-MSC에 대해 상기 기재한 바와 유사하게 매우 낮았다{Boquest, 2006 3128/id}. 증식을 평가하는 다른 방법은 ³H 티미딘 혼입을 측정함에 의해서이다. 도 5d는 AT-MSC의 경우에는 5개의 공여자로부터의 세포 및 BM-MSC의 경우에는 3개의 공여자로부터의 세포에 대해 수행된 배양 7 내지 8일째의 분석을 보여준다. 단층에서 배양된 모든 세포에서 ³H 티미딘의 높은 흡수가 존재하였으며 이는 높은 증식 활성으로 확인되었다. 정상 알기네이트에서 배양된 MSC의 경우 어떠한 활성도 관찰되지 않았다. 그러나, RGD 알기네이트에서 배양된 AT-MSC의 경우 ³H 티미딘의 흡수가 작고/알맞은 것으로 관찰되었다.

RGD 알기네이트에서 배양된 MSC는 RGD-함유 ECM 단백질로의 결합에 관련된 인테그린의 발현을 유지한다.

다수의 인테그린 헤테로이량체가 ECM 분자에서 RGD 모티브로의 결합에 관련되는 것으로 공지되어 있다. 알기네이트에서 MSC의 삽입이 세포 표면 상의 인테그린의 발현에 영향을 미치는지를 결정하기 위해, 유세포 분석을 사용하여 RGD 결합에 관련된 인테그린 단량체 중 몇몇의 발현 수준을 검출하였다. 결과가 도 6에 나타나 있다. 단층에서 배양된 MSC는 이들 분자의 높은 발현을 보여주었으며, 이는 아마도 이들 분자가 가소성 물질로의 부착을 위해 중요하다는 것을 시사한다. 정상 알기네이트에서 배양 7일 후에, 이러한 모든 인테그린을 하향 조절하였다. CD61을 제외한 모든 인테그린은 RGD 알기네이트에서 배양된 MSC에서 또한 하향 조절되었지만 정상 알기네이트에서 배양된 세포에서보다는 낮은 정도였다.

실시예 4: RGD 알기네이트에서 MSC의 포착은 유전자 발현 변화를 유도한다.

골수 및 지방 조직(AT)으로부터의 인간 중간엽 줄기 세포를 인간 공여자로부터 단리하고 단층 배양물로서 성장시키고 그 후에 LVG-알기네이트 또는 RGD-알기네이트를 사용하여 알기네이트 비드에서 포착하였다. 알기네이트에서의 세포의 포착을 실시예 1에 기재한 바와 같이 수행하였다. 여러 시간에서, 세포를 5분 동안 DPBS(깁코) 함유 100 mM EDTA로 세척함으로써 알기네이트 비드로부터 방출하였고 15분 동안 1500 rpm에서 원심분리하였다. 최종적으로, 세포를 DPBS(깁코)에서 재현탁하고 추가로 분석하였다.

RNA 샘플 준비 및 마이크로어레이 분석을 아피매트릭스 진칩 발현 분석 기술 매뉴얼(Affymetrix GeneChip Expression Analysis Technical Manual)(미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재의 아피매트릭스(Affymetrix))에 따라 수행하였다. 요약하면, 7일째에 3명의 공여자로부터 새롭게 단리된 AT-MSC, 단층 배양되고 탈겔화된 알기네이트 캡슐화된 세포 각각을 펠릿화하고 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 전체 RNA를 암비온 RNaqueous(Ambion RNaqueous)(미국 텍사스주 오스틴 소재의 미로(Miro))를 사용하여 세포로부터 추출하였다. 새롭게 단리된 비배양된 세포에서 소량의 RNA로 인해, cDNA를 투-사이클 cDNA 합성 키트(Two-Cycle cDNA Synthesis Kit)(아피매트릭스 P/N 900432)를 사용하여 전체 RNA 100 ng으로부터 제조하였다. 모든 샘플에 있어서, cRNA 10의 10 ㎍을 22,277 프로브를 나타내는 HG-U133A_2 어레이(아피매트릭스)로 하이브리드하였다. 어레이를 아피매트릭스 진칩 스캐너 3000 7G를 사용하여 스캐닝하였다. 데이터를 어레이익스프레스(ArrayExpress), 수납 번호 E-MEXP-1273으로 개시하였다.

오픈-소스 프로그램 언어 및 환경 R(http://cran.r-project.org/doc/FAQ/RFAQ.html#Citing-R)을 예비-프로세싱 및 아피매트릭스 진칩 마이크로어레이의 통계 분석을 위해 사용하였다. 바이오컨덕터(Bioconductor){Gentleman, 2004 3127/id} 커뮤니티를 구축하고 R로 쓰여진 마이크로어레이 분석을 위해 수많은 패키지를 유지하였으며 몇몇을 이 분석에서 사용하였다. 먼저, 어레이 데이터를 gcRMA 패키지를 사용하여 정규화하였다{Wu Z, 2004 3129/id}. 그 후, 모든 어레이에서 호출이 없는 프로브를 분석으로부터 버렸다. 예비프로세싱 및 정규화 후에, 실험의 선형 모델을 림마(Limma)를 사용하여 만들었다. 이 프로그램은 또한 통계 시험 및 상당히 특이적으로 발현된 프로브의 등급화를 위해 사용하였다{Smyth GK, 2004 3130/id}. 아피(Affy)를 진단 플롯 및 여과를 위해 사용하였다{Gautier L, 2004 3131/id}. 다중 시험을 조정하기 위해, 개별 프로브에 대한 결과를 벤자민-호치베르그(Benjamini-Hochberg){Benjamini, 1995 3132/id}에 의해 등급화하였고, p-값으로 조정하였으며, 여기서 p<0.01이 유의적인 것으로 고려되었다.

세포 형태, 극성 및 증식의 변화가 유전자 발현에 강하게 영향을 미치는 것으로 보임에 따라{Yamada, 2007 3126/id}, 이러한 모든 요인이 변하는 세포들 사이에서 관찰되는 범 mRAN 발현의 변화를 결정하기를 원했다. 놀랍게도, p<0.01의 벤자민 호치베르그 다중 시험을 사용하여 RGD 및 정상 알기네이트에서 포착된 세포들 사이에서 mRNA 발현 수준의 차이가 유의적이지 않음을 발견하였다(데이터는 나타내지 않음). 이는 이들 세포에서 PCD에 관련된 사건이 모두 전사-후 수준에서 발생한다는 것을 시사한다.

상이하게 발현된 유전자의 분석을 위해, p<0.01 및 >3배 변화를 사용하여, 알기네이트에서 포착시에 상향-조절되는 48개의 유전자를 나타내는 프로브를 발견하였다. 유전자 존재 분석은 이들 유전자가 세포 부착 및 다수의 대사 과정과 기능적으로 관련될 수 있음을 나타내었다(보충 표 1a). 상향조절된 유전자의 목록이 표 1에 제시되어 있다. 가장 높게 상향조절된 유전자, CNIH는 세포골격의 극성화와 관련된 단백질을 암호화한다{Roth, 1995 3120/id}. 세포골격 및 액틴-미오신 결합과 관련된 다른 유전자는 MLPH, ARL4C 및 FHOD3이다. 인테그린(β3, CD61)은 mRNA 수준에서 적절하게 상향조절되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 단백질 수준에서 β3의 발현은 단층에서 배양된 세포와 비교하여 RGD 알기네이트 중 MSC에서 약간 증가하였으며, mRNA 수준에서 관찰된 상향 조절과 일치하였다. 흥미롭게도, TDO2 유전자는 RGD 알기네이트 포착된 세포에서 매우 상향조절되었다. 유전자 산물, 트립토판 2,3-다이옥시게나제는 트립토판의 이화에 관련된다{Takikawa, 2005 3118/id}. 트립토판의 가속화된 파괴는 MSC에 의해 매개된 면역억제 효과에 있어 중요한 메커니즘인 것으로 제시되어 왔다{Meisel, 2004 2851/id}.

RGD 알기네이트에서의 포착 후 AT-MSC에서 하향 조절된 39개의 유전자의 유전자 존재가 보충 표 2a에 나타나 있다. 가장 큰 군집의 유전자는 발달, 세포내 신호화 및 세포 형태형성과 관련한 것들이다. 개별 유전자의 목록이 하기 표 2에 제시되어 있다. 이는 세포골격 및 필라멘트 생물학과 관련된 다수의 유전자를 함유한다(KRT18, FLG, CDC42EP3, VIL2, CAP2, FHL1, LMO7 및 MFAP5). 유전자 중 3개는 세포 주기와 관련되지만(TPD52L1, NEK2 및 SEP11), 몇몇 유전자는 혈통 분화와 관련된다(연골의 경우 HAPLN1; 지방의 경우 MEST 및 ZFP36 15; 심장혈관 및 근육의 경우 OXTR, ACTC, TRPC4, ACTA2 및 PDE1C; 및 신경 분화의 경우 RGS7 및 MBP).

보충 표 3a는 알기네이트 포착된 세포에서 상향조절된 유전자를 나타내는 665개의 프로브의 유전자 존재를 나타낸다. 대다수의 가장 유의적으로 상향조절된 프로브는 대사 과정 범위와 관련된 유전자를 나타낸다. 또한, 거대분자 생합성 및 세포 국부화 및 부착을 조절하는 유전자의 카테고리가 매우 중요하다. MMP1이 알기네이트 포착된 세포에서 과다발현된 개별 유전자의 목록 상단에서 발견될 수 있지만(표 3a), ECM(COMP, COL11A1, PAPPA, FN1, LTBP1)과 관련된 다수의 다른 유전자가 또한 이들 세포에서 매우 상향조절된다. 이러한 후보에 대해 기능적으로 군집을 이룬 다른 유전자는 세포골격(LPXN, DSP, MICAL2) 및 뼈 형태 단백질(BMP) 경로(GREM2, GREM1, TRIB3, LTBP1)와 일부 관련된다. TMEM158 및 ITGA10은 단층에서 배양된 세포 및 배양되지 않은 세포 둘 다와 비교하여 알기네이트 포착된 세포에서 높게 상향조절되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 이들 유전자가 RGD 알기네이트에서 포착의 결과로서 특이적으로 상향조절된다는 것을 시사한다.

RGD 알기네이트에서 포착된 MSC와 비교하여, 다수의 혈통으로의 발달 및 분화와 관련된 예상되는 단리된, 비배양된 AT-MSC 과다발현된 유전자는 군집을 이룬다. 보충 표 4a는 비배양된 세포에서 상향조절된 503개의 프로브의 유전자 존재를 보여준다. 가장 높게 상향조절된 개별 유전자의 목록에 대해서, CXCL14가 가장 높고 뒤이어 BMP 길항제 CHRDL1이 따르는 것으로 매겨졌다. 유전자 존재 목록을 실증하는, 지방(CFD, APOD, SEPP1, FABP4, C7, LPL 16 및 AADAC) 및 골연골 분화(SPARCL1, ITM2A, CILP, SERPINA3, OMD 및 OGN)와 관련된 다수의 유전자가 발견되었다.

이를 위해, 광범위한 2D 및 3D 조직 배양 절차가 기재되어 왔다. MSC의 경우, 실제로 모든 공개된 데이터는 2D 배양에서 세포를 기초로 한다. 이는 가소성 표면으로의 접착이 세포가 증식하여 분석 또는 치료 프로토콜을 위해 필요한 세포 수를 산출할 것을 요구하기 때문이며, 또한 가소성 표면 상의 통과가 이제 MSC로서 한정된 세포 개체군에 대해 선택되기 때문이다{Dominici, 2006 3034/id}. 그러나, 가소성 부착에 의해 유도된 형태, 세포골격의 극성화, 접착 특성 및 세포 분열의 비율의 변화는 MSC 생물학의 극적인 변화를 이끌었다{Yamada, 2007 3126/id}{Boquest, 2005 2900/id}. 본 발명을 이끄는 가설은 단층 확장된 MSC를 3D 배양물로 이전시킴으로서 다수의 상기 변화가 역전될 수 있다는 것이다. 3D 배양물에서 MSC에 대하여, 세포 형태, 크기 및 세포 분열의 비율이 비배양된 MSC의 경우 관찰된 것과 유사한 것으로 밝혀졌다{Boquest, 2005 2900/id}{Boquest, 2006 3128/id}. 그러나, 본 작업에서 제공된 조건 하에, 2D에서 확장되고 그 후 3D 배양물에서 확립된 MSC의 전사체는 새롭게 단리되고 비배양된 AT-MSC에서 관찰된 것으로부터 훨씬 더 제거된다. 이들은 새롭게 단리된 MSC보다 가소성-부착 세포에 더욱 밀접한 것으로 보일 수 있지만, 3D 배양물에서 MSC의 유전자 발현 프로파일은 이들이 MSC의 별도의 제 3 개체군인 것으로 간주되어야 한다는 것을 시사한다.

실시예 5: 예측 실시예. 다발 경화증(MS) 치료시에 알기네이트에서 포착된 자가 줄기 세포의 사용

상기 실시예는 MSC가 가소성 표면 상에 많은 수로 확장되고(2D), 그 후 알기네이트에서 포착될 수 있으며, 트라이펩타이드 RGD가 알기네이트에서 포착되는 경우 세포가 높은 생육성으로 연구 기간에 걸쳐 생존한다는 것을 기재하였다. 범 유전자 발현 분석(실시예 4)은 알기네이트 포착된 세포가 2D로 배양된 세포와 상이하고 비배양된 형태의 단리 직후 특성화된 세포와 상이하다는 것을 증명하였다(비공개된 듀갈(Duggal) 등의 문헌). 이들 세포는 MSC의 신규한 제 3 개체군을 나타내는 것으로 보인다. 치료 목적을 위해서, 알기네이트가 완전히 제거될 수 있으며, 3D 세포의 형태 및 분자 특성을 갖는 단일 세포 현탁액에 세포를 남긴다.

MS의 치료시 2D로 배양된 세포보다 더 우수한 알기네이트에서 배양된 세포의 경우, 이들은 보다 높은 수로 손상 부위에서 이용되거나, 손상 부위에서 보다 높은 효능을 발휘하거나, 해로운 효과를 덜 생산하거나, 이들 중 임의의 조합일 필요가 있다. MS에서 MSC의 사용을 위한 전략은 세포의 정맥내(IV) 주사 또는 다른 투여를 기초로 할 수 있다. 2D로 배양된 MSC는 고 밀도의 부착 분자의 발현 후 가소성 표면으로의 부착이 뒤따르는 거대 세포이다. 이는 IV 주사 후 이들 세포가 이들이 만나는 제 1 모세관 망상 조직(이는 폐 망상조직이다)에서 유지되는 주요 이유가 될 것이다. 본원에서, 대부분의 MSC는 사멸한다(예를 들면 문헌[Kraitchmann et al., Circulation 205; 112:1451]을 참고한다). 이번 작업에서, 알기네이트에서의 배양 후 MSC는 더 작아지고 지금까지 시험된 더 낮은 농도의 모든 인테그린을 발현하는 것으로 밝혀졌다(α3, 5 및 V, β1 및 3). 따라서, 세포는 폐 순환을 통해 달아날 기회가 높아질 수 있다.

신경계 질환에서 효율적인 것으로 보고된 MSC의 정확한 작용 매커니즘은 공지되지 않았지만 면역억제 효과, 뉴런, 아교 세포 및 희소돌기아교세포로의 트랜스분화, 및 재수초화를 포함할 것 같다. MSC에 의해 발휘되는 면역억제 효과의 경우, 작용 매커니즘은 완전히 기재되지 않았다. 그러나, 트립토판의 가속화된 분해의 유도가 굉장히 중요한 것으로 제안되어 왔다(문헌[Meisel et al., Blood 2004; 103; 4619]). 알기네이트 포착된 MSC가 2D로 확장된 MSC보다 우수할 수 있다는 한 매커니즘은 효소 트립토판 2,3-다이옥시게나제(TDO)의 작용을 통해서이며, 이는 트립토판의 분해를 촉진하며(문헌[Murray, Curr Drug Metab 2007; 8:197]), 2D MSC와 비교하여 알기네이트 포착된 MSC 중 mRNA 수준에서 대략 100배 상향조절된다(실시예 4). MSC의 다른 가능한 작용 매커니즘의 경우 어떠한 분자 매커니즘도 기재되지 않았다. 가능한 임상전 및 임상 시도는 알기네이트 포착된 MSC가 이들 분야에서 장점을 갖는다는 것을 보여줄 수 있다. 임상 용도에서 2D 대응물보다 더 우수한 3D로 배양된 세포에 대한 전례가 존재한다. 예를 들면 MSC는 3D로 배양되어 연골세포로 분화될 필요가 있다(문헌[Sekiya et al., PNAS 2002; 99:4397]). 다른 예는 근육 조직으로의 근육모세포의 분화이다(문헌[Hill et al., PNAS 2006; 103:2494]).

[표 1a]

[표 2a]

[표 3a]

[표 4a]

Claims

하나 이상의 줄기 세포를 포착하는 개질된 알기네이트를 포함하는 생체구조로서,
상기 개질된 알기네이트가 하나 이상의 세포 접착 펩타이드를 공유 결합시킴으로써 결합되는 하나 이상의 알기네이트 쇄 구역을 포함하고,
상기 개질된 알기네이트가 500 EU/g 이하의 내독소를 포함하는 생체구조.
제 1 항에 있어서,
겔, 포말, 비드, 골격, 섬유, 펠트, 스폰지 또는 이들의 조합인 생체구조.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
세포 접착 펩타이드가 하나 이상의 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 서열을 포함하는 생체구조.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
줄기 세포가 중간엽 줄기 세포인 생체구조.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
줄기 세포가 개질된 알기네이트에 포착되기 전에 단층으로서 유지되는 생체구조.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 생체구조로부터 단리된 복수개의 줄기 세포.
하나 이상의 세포 접착 펩타이드를 공유 결합시킴으로써 결합되는 하나 이상의 알기네이트 쇄 구역을 포함하는 개질된 알기네이트를 포함하는 구조에서 줄기 세포를 포착함으로써 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 생체구조를 제조하는 단계를 포함하되, 상기 개질된 알기네이트가 500 EU/g 이하의 내독소를 포함하는,
복수개의 줄기 세포의 제조 방법.
제 7 항에 있어서,
포착된 줄기 세포를 3시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상 및 72시간 이상으로 이루어진 군 중에서 선택된 시간 동안 생체구조에서 유지하는 방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
줄기 세포를 생체구조로부터 단리하는 방법.
제 9 항에 있어서,
하나 이상의 양이온 결합제를 생체구조에 첨가함으로써 생체구조로부터 줄기 세포를 단리하는 방법.
제 10 항에 있어서,
양이온 결합제가 시트레이트, 락테이트, 포스페이트, EDTA 및 EGTA 중 하나 이상을 포함하는 방법.
제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 복수개의 줄기 세포를 신경 세포와 관련된 상해 또는 퇴행성 질환을 갖는 개체에게 치료적 이점을 제공하기에 효과적인 양 및 부위에서 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 치료 방법.
제 12 항에 있어서,
개체가 신경 손상과 관련된 상해를 갖는 방법.
제 12 항에 있어서,
개체가 신경계 장애를 갖는 방법.
제 12 항에 있어서,
개체가 알쯔하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 즉 로우 게흐리그(Lou Gehrig) 질환, 죽상동맥경화증, 암, 당뇨병, 심장 질환, 헌팅톤병, 염증성 창자 질환, 점액다당류증, 다발 경화증, 노리에(Norrie) 병, 파킨슨병, 전립선염, 골관절염, 골다공증, 쉬-드라거(Shy-Drager) 증후군, 및 뇌졸증으로 이루어진 군 중에서 선택된 퇴행성 질환을 갖는 방법.