ES2317657T3 - Polimeros que contienen polisacaridos tales como alginatos o alginatos modificados. - Google Patents

Abstract

Solución inyectable o gel para la formación de matrices de trasplante de células que comprende un alginato modificado que comprende por lo menos una sección de cadena de alginato a la que está unida de manera covalente por lo menos una molécula útil para la adhesión celular, en los que la molécula es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), GREDVY, YIGSR o REDV; y que comprende además células viables para dicho trasplante.

Description

Polímeros que contienen polisacáridos tales como alginatos o alginatos modificados.

Se describen materiales que contienen cadenas de polisacárido, particularmente cadenas de alginato o de alginato modificado. Las cadenas de polisacárido, particularmente de alginato o de alginato modificado, pueden estar incluidas en cadenas laterales o cadenas auxiliares de una cadena del polímero del eje central, que puede también ser un polisacárido. Además, las cadenas de polisacárido pueden estar reticuladas entre cadenas laterales, cadenas auxiliares y/o cadenas del eje central. Estos materiales se modifican ventajosamente por enlace covalente a los mismos de una molécula biológicamente activa para la adhesión celular u otra interacción celular. Los materiales son particularmente útiles para proporcionar matrices poliméricas destinadas a muchas aplicaciones, tal como en aplicaciones de ingeniería tisular para sustitución de huesos o de tejidos blandos. Por ejemplo, la pérdida de tejido óseo es una característica principal de muchos aspectos en odontología clínica (por ejemplo, enfermedad periodontal, caries, osteotomía para la reparación de traumatismos) y matrices de los materiales descritos en la presente memoria pueden ser útiles para la reparación o el relleno del tejido óseo perdido. Los materiales son también útiles para aplicaciones de administración de fármacos cuando la molécula biológicamente activa está unida mediante un enlace degradable.

El alginato no modificado, un polisacárido, se ha utilizado anteriormente como matriz en la ingeniería tisular en estudios de encapsulación celular y de trasplantes. Proporciona una matriz útil porque las células pueden inmovilizarse dentro del alginato con poco traumatismo celular y las mezclas de alginato y células pueden trasplantarse de manera mínimamente invasora. Sin embargo, las células presentan poca o ninguna adhesión o interacción con el alginato no modificado. Se describe una matriz que combina ligandos específicos para la adhesión celular en una matriz de modo que se consigue elevado control sobre las interacciones de la matriz celular, debido a la adhesión celular y las interacciones de la matriz.

Se describen polímeros que contienen un eje central de polímero al que se unen los grupos de polisacárido, particularmente de alginatos o alginatos modificados, que preferentemente son monómeros polimerizados de D-manuronato y/o L-guluronato. El polisacárido, particularmente los grupos alginato están presentes como cadenas laterales en el eje central del polímero que se pretende que incluya cadenas laterales en el extremo terminal del eje central, siendo de este modo una continuación de la cadena principal. Los polímeros proporcionan polisacáridos sintéticos modificados y alginatos que presentan propiedades controlables dependiendo de la última utilización de los mismos. Además, se describen procedimientos para preparar dichos polímeros y para la utilización de dichos polímeros, por ejemplo, como matrices de trasplante celular, hidrogeles preformados para el trasplante de células, matrices no degradables para el trasplante de células inmunoaisladas, vehículos para suministro de fármacos, vendajes para heridas y sustituciones para alginatos aplicados industrialmente.

Se describen polisacáridos, particularmente alginatos, que se modifican porque están reticulados. Los alginatos pueden además modificarse por enlace covalente a éstos de una molécula biológicamente activa para la adhesión celular u otra interacción celular. La reticulación del alginato puede proporcionar particularmente materiales de alginato con propiedades mecánicas controladas y propiedades de memoria de la forma que expanden en gran medida su intervalo de utilización, por ejemplo, para aplicaciones en ingeniería tisular donde el tamaño y la forma de la matriz es importante. La modificación de los alginatos reticulados con moléculas biológicamente activas puede proporcionar un medio adicional tridimensional que presenta particularmente ventajas en la adhesión celular, haciendo de este modo dichos alginatos más útiles como matrices de trasplante de la célula. Además, se describen procedimientos para preparar dichos alginatos reticulados y para su utilización, por ejemplo, para formar materiales destinados a la ingeniería tisular y/o que presentan propiedades de adhesión celular particularmente para matrices de trasplante de células, tal como soluciones inyectables para el trasplante de células y materiales preformados para el trasplante de
células.

Se describen alginatos modificados, tal como el eje central de alginato (es decir, alginato no modificado), los alginatos de la cadena lateral descritos anteriormente o los alginatos reticulados, modificados mediante enlace covalente a éstos de una molécula biológicamente activa para la adhesión celular u otra interacción celular, que resulta particularmente ventajosa para el mantenimiento, viabilidad y expresión directa de modelos preferidos de expresión génica. Los polímeros de alginato modificados proporcionan un medio tridimensional que resulta particularmente ventajoso para la adhesión celular. Además, se describen procedimientos para preparar dichos polímeros y para la utilización de dichos polímeros, por ejemplo, para formar geles o líquidos muy viscosos que presentan propiedades de adhesión celular particularmente para las matrices del trasplante de células, tales como las soluciones inyectables para el trasplante de células e hidrogeles preformados para el trasplante de células.

Cualquier experto en la materia puede determinar otros aspectos de la invención a partir de la descripción siguiente.

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Antecedentes de la invención

La insuficiencia orgánica y tisular continúa siendo un problema frecuente, costoso y serio en la atención sanitaria a pesar de los avances en la tecnología médica. Los tratamientos disponibles actualmente incluyen los trasplantes de órganos de un individuo a otro, la realización de la reconstrucción quirúrgica, la utilización de dispositivos mecánicos (por ejemplo, dializador renal) y la terapia con fármacos. Sin embargo, estos tratamientos no son soluciones perfectas. El trasplante de órganos está limitado por la falta de donantes de órganos, el posible rechazo y otras complicaciones. Los dispositivos mecánicos no pueden realizar todas las funciones de un órgano, por ejemplo, la diálisis renal puede ayudar solamente a eliminar algunos residuos metabólicos del cuerpo. Asimismo, las concentraciones de fármaco comparables a los sistemas de referencia del cuerpo es difícil de conseguir. Esto es debido en parte a las dificultades para controlar la concentración de fármaco in vivo. Económicamente, el coste de los procedimientos quirúrgicos es muy elevado. Los avances en las ciencias médicas, biológicas y físicas han permitido la aparición del campo de la ingeniería tisular. La "ingeniería tisular" es la aplicación de los principios y procedimientos de la ingeniería y de las ciencias de la vida hacia la comprensión fundamental de las relaciones entre estructura y función en los tejidos normales y patológicos de mamíferos y el desarrollo de sustitutos biológicos para restablecer, mantener o mejorar la función. De este modo conlleva el desarrollo de procedimientos para construir sustitutos biológicos como suplementos o alternativas al trasplante del órgano o del tejido completos. La utilización de células vivas y/o de componentes de la matriz extracelular (ECM) en el desarrollo de partes implantables o de dispositivos es una estrategia atractiva para restablecer o para sustituir la función. La ventaja de esta estrategia sobre el trasplante del órgano/tejido completo es que solamente se implantan las células de interés, y potencialmente pueden multiplicarse in vitro.

De este modo, puede desarrollarse una pequeña biopsia en una gran masa de tejido y, potencialmente, puede utilizarse para tratar muchos pacientes. El aumento del suministro de tejido puede reducir el coste de la terapia debido a que la intervención inicial es posible durante la enfermedad, y esto puede impedir la hospitalización de larga duración que resulta a medida que evoluciona la insuficiencia del tejido. La utilización de la inmunodepresión puede evitarse también en algunas aplicaciones utilizando las propias células del paciente.

El alginato es un polisacárido lineal, aislado, por ejemplo, de las algas pardas marinas, que forma un hidrogel estable en presencia de cationes divalentes (por ejemplo, Ba^{++}, Ca^{++}) (Smidsrod et al. (1990): Alginate as immobilization matrix for cells. TIBTECH, 8:71-78). El alginato se está utilizando actualmente para el cultivo in vitro de algunos tipos de célula como matriz inyectable para administración de células, destinado a terapias basadas en el inmunoaislamiento, y como sustrato de inmovilización de enzimas (Atala et al., 1993: Injectable alginate seeded with chondrocytes as a potencial treatment for vesicoureteral reflux. J. Urology, 150:745-747; Levesque et al., 1992: Maintenance of long-term secretory function by microencapsulated islets of Langerhans. Endocrinology, 130:644-650; Domínguez et al., 1988: Carbodiimide coupling of \beta-galactosidase from Aspergillus oryzae to alginate. Enzyme Microb. Technol., 10:606-610; y Lee et al., 1993; Covalent immobilization of Aminoacylase, to Alginate for L-h\phenylalanine production, J. Chem. Tech. Biotechnol., 58:65-70). Los hidrogeles de alginato son atractivos para su utilización con células debido a sus condiciones suaves de gelificación, bajas barreras de difusión para nutrientes de células y baja inflamación e inocuidad in vivo (Smidsrod, anteriormente).

Los alginatos se producen en la naturaleza como copolímeros de D-mannuronato (M) y de L-guluronato (G) y presentan diferentes composiciones monoméricas cuando se aíslan a partir de diferentes fuentes naturales. La longitud del bloque de las unidades monoméricas, la composición global y el peso molecular del alginato influye en sus propiedades. Por ejemplo, los alginatos de calcio ricos en G son materiales rígidos, (véase Sutherland, IW (1991): Alginates. En Biomaterials.: Novel materials from biological sources). Se teoriza que la formación del gel es debida principalmente al bloque G y que el bloque M no es esencialmente selectivo. En dicha disposición, los iones de calcio estarían unidos selectivamente entre las secuencias de los restos de poliguluronato y mantenidas entre restos de L-guluronato unidos diaxialmente que están en la configuración de silla ^{1}C_{4}. Los iones de calcio estarían de este modo rellenados en los intersticios entre las cadenas de poliguluronato asociadas en pares y su estructura se denomina secuencia de "huevera". La capacidad para formar una zona de unión depende de la longitud de los bloques G en diferentes alginatos (Sutherland, anteriormente). Otras ventajas de los alginatos incluyen su amplia disponibilidad, baja barrera de difusión para todos los nutrientes y biocompatibilidad relativa (Smidsrod et al., Trends in Biotech., 8:71-78, 1990).

Una limitación de los hidrogeles de alginato utilizados con un componente celular es la falta de adhesión celular intrínseca. Dicha adhesión es necesaria para la unión de la célula y la supervivencia a largo plazo de la mayoría de los sistemas celulares de mamíferos. Aunque se han trasplantado con éxito condrocitos e islotes de Langerhans utilizando alginatos, la ausencia de adhesión celular adecuada por los alginatos limita prácticamente su utilización en aplicaciones de cartílago y células de islotes. La mayoría de otros tipos de células requieren el acoplamiento a un sustrato extracelular para que continúe siendo viable.

Se ha intentado anteriormente crear un medio tridimensional de hidrogel que incorpora ligandos de adhesión celular para la unión y supervivencia de las células. Un sistema es una poliacrilamida fotopolimerizable a base de hidrogel con un péptido RGD injertado en el eje central del polímero. Este polímero experimenta fotogelificación en presencia de luz UV, y puede polimerizarse como híbrido de polímero/célula (Moghaddam et al., 1993: Molecular design of three-dimensional artificial extracelular matrix: photosensitive polymers containing cell adhesive peptide. J. Polymer Science: Part A: Polymer Chem. 31: 1589-1597). Otro polímero es un sistema de poliacrilamida, de nuevo con el ligando RGD unido por enlace covalente, que se polimeriza catalíticamente antes de cualquier interacción biológica (Woerly et al. 1995: Intracerebral implantation of hydrogel-coupled adhesión peptides: tissue reaction. J. Neural Transplant. Plasticity, 5: 245:255). Un inconveniente de dichos sistemas es que la conversión de los polímeros de líquido a sólido, gel o sistema muy viscoso requiere condiciones que son perjudiciales para la viabilidad de las células, por ejemplo, utilización de disolventes orgánicos y/o temperaturas elevadas.

Otra limitación principal de los hidrogeles de alginato utilizados en las aplicaciones de la biotecnología es que su estabilidad depende solamente del enlace del calcio (u otro catión divalente) y esto puede presentar una limitación en la utilización de estos materiales (por ejemplo, la pérdida de calcio de los geles conduce a la disolución del gel). Además, los hidrogeles de alginato tienen un margen limitado de propiedades físicas debido al número limitado de variables que se puede manipular actualmente (es decir, concentración de alginato, catión divalente específico utilizado para gelificación y concentración de catión divalente. Esta limitación es especialmente evidente cuando se utiliza alginato como vehículo para la administración de células inyectables en la ingeniería tisular. No es posible obtener una forma predefinida y deseable de la matriz después de la inyección y por lo tanto no es posible crear un nuevo tejido con una forma y tamaño específicos y deseables. Esto es especialmente importante siempre que el tamaño y la forma del nuevo tejido sean críticos para la función del tejido, por ejemplo, en la reconstrucción de características faciales tales como la nariz u orejas, o en el revestimiento de articulaciones.

La solicitud de patente europea nº 0 712 635 da a conocer geles de polímero médicos producidos inmovilizando un fármaco en un polímero hinchable en agua.

La patente US nº 5.227.298 da a conocer un procedimiento de encapsulación de células viables en perlas con doble pared que utilizan alginato y polilisina.

El documento WO 95/24429 da a conocer un éster activo y derivados de carboxi polisacáridos donde todos o parte de los grupos carboxi están esterificados por un alcohol aromático, un alcohol aromático sustituido, un alcohol heterocíclico, un alcohol heterocíclico sustituido o N-hidroxilamina. Dichos ésteres pueden utilizarse en la preparación de polisacáridos modificados en forma de ésteres, tioésteres o amidas que pueden utilizarse en los campos biomédico y farmacéutico.

El documento WO 93/09176 da a conocer materiales biocompatibles que pueden experimentar polimerización de radicales libres para formar microcápsulas que pueden contener células biológicas.

El documento WO 94/07536 da a conocer conjugados de alginato-agente bioactivo conectados mediante un enlace de espaciador biodegradable ácido lábil. El conjugado sirve para administrar agentes bioactivos a dianas en medios con bajo pH.

El documento WO 93/21906 da a conocer microcápsulas bioadhesivas que contienen fármacos o sustancias bioactivas con fines terapéuticos o de diagnóstico en relación con las enfermedades del aparato gastrointestinal.

El documento JP 1993-049148 da a conocer un vehículo para cultivo celular en el que se forma una capa de recubrimiento de colágeno en la superficie de una perla realizada a partir de una partícula de sal de ácido algínico que tiene un diámetro de 1 a 5 mm. En el procedimiento de cultivo el vehículo del cultivo celular está rellenado en el interior de una columna.

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Sumario de la invención

Un objetivo consistía en diseñar análogos sintéticos mejorados de alginatos, para proporcionar un procedimiento destinado a preparar dichos polímeros y para proporcionar composiciones y procedimientos que utilizan dichos polímeros, particularmente en aplicaciones de ingeniería tisular. Además es útil para proporcionar materiales que contienen alginato en los que la estabilidad del gel está relacionada con una variable adicional además del enlace del catión de los cationes divalentes. De este modo, por ejemplo, pueden evitarse los inconvenientes de los sistemas anteriores proporcionando un alginato que puede gelificarse o resultar muy viscoso en condiciones suaves, es decir, en presencia de cationes de metal divalente tales como Ca^{++} o Ba^{++} en sistemas acuosos, sin requerir, por ejemplo, disolventes orgánicos y/o aumento de temperatura.

Se proporcionan polímeros con cadenas laterales de polisacáridos en general que no pueden presentar el comportamiento de gelificación de los alginatos, pero que proporcionan polisacáridos con propiedades controlables, tal como la degradación. Estos polímeros pueden comprender una sección de eje central polimérico a la que está unido por enlace covalente una cadena lateral de polisacárido. Se proporciona también una sección con eje central polimérico a la que está unida una cadena lateral, preferentemente muchas cadenas laterales, de monómeros de D-manuronato (unidades M) y/o L-guluronato (unidades G) polimerizados, opcionalmente modificados. Los alginatos modificados mantienen preferentemente el comportamiento de gelificación suave de los alginatos convencionales, pero no adolecen de los inconvenientes expuestos anteriormente. El enlace entre la sección del eje central polimérico y la(s) cadena(s) lateral(es) puede ser proporcionado por los compuestos enlazadores bifuncionales o multifuncionales, por grupos incorporados dentro de la sección del eje central polimérico reactiva con unidades de polisacárido y/o por grupos en las unidades de polisacárido o derivados de los mismos reactivos con grupos en la sección del eje central polimérico. Los polímeros pueden de manera ventajosa comprender además moléculas biológicamente activas unidas a éstos, particularmente unidas preferentemente mediante los grupos de ácido carboxílico en las unidades M y/o G. En una forma de realización particularmente preferida, las cadenas laterales son alginatos, las moléculas biológicamente activas presentan propiedades de adhesión celular y los polímeros son útiles para el trasplante de células.

Un aspecto ventajoso de estos materiales es la capacidad para proporcionar un análogo de polímero para los alginatos, pero con alta capacidad de control de las propiedades, particularmente cuando se utiliza con fines de trasplante de células. Las estructuras químicas, la funcionalidad y los tamaños de las diferentes partes del polímero, es decir, el eje central, el enlazador, la cadena lateral y, opcionalmente, la(s) molécula(s) activa(s) pueden proporcionarse a fin de controlar muchas propiedades del polímero en sistemas fisiológicos, tales como, por ejemplo, la degradabilidad, biocompatibilidad, especificidad y afinidad del órgano o tejido, la adhesión celular, el crecimiento celular y la diferenciación celular, la manera y la velocidad de eliminación del sistema, la solubilidad y la viscosidad.

En cuanto a la sección del eje central polimérico puede utilizarse cualquier homopolíimero o copolímero que sea compatible con la utilización última y que tenga los grupos funcionales apropiados tal que pueda unirse por enlace covalente directamente o mediante un enlazador al polisacárido, particularmente las unidades M y/o G polimerizadas, o modificaciones adecuadas de las mismas. Cualquier polímero que reúna los requisitos anteriores es útil en la presente memoria, y la selección del polímero específico y las adquisiciones o preparación de dicho polímero se practicarían de manera convencional en la técnica. Veáse The Biomedical Engineering Handbook, ed. Bronzino, apartado 4, ed. Park. Resultan preferidos para dicha sección del eje central polimérico, por ejemplo, poli(vinil alcoholes), poli(óxidos de alquileno), particularmente los poli(óxidos de etileno), polipéptidos, poli(aminoácidos), tales como poli(lisina), poli(alilaminas) (PAM), poli(acrilatos), polímeros de estireno modificados tales como poli(4-aminometilestireno), poliésteres, polifosfacenos, polioles plurónicos, polioxámeros, poli(ácidos urónicos) y copolímeros, incluyendo los polímeros de injerto de los mismos.

La sección del eje central polimérico puede seleccionarse para que presente un amplio intervalo de pesos moleculares, generalmente desde tan bajos como 100 up a diez millones. Sin embargo, mediante la selección del peso molecular y la estructura de la sección del eje central polimérico la aparición y la velocidad de degradabilidad del polímero y la manera y velocidad de liberación de los sistemas fisiológicos del polímero pueden ser influidas. Por ejemplo, una sección del eje central polimérico no degradable de alto peso molecular, por ejemplo con un peso molecular superior a aproximadamente 100.000, proporcionará en general un polímero más estable que puede ser útil, por ejemplo, en matrices no degradables para el trasplante de células inmunoaisladas. Alternativamente, una sección de eje central polimérico con un peso molecular inferior a aproximadamente 30.000 a 50.000 o una en la que el propio eje central sea degradable puede ser eliminada por los riñones y por otras vías metabólicas normales. Los polímeros con una sección del eje central polimérico degradable incluyen los que presentan un eje central con grupos hidrolizables en éstos, tales como los polímeros que comprenden grupos éster en el eje central, por ejemplo, poliésteres alifáticos de los poli(\alpha-hidroxiácidos) incluyendo poli(ácido glicólico) y poli(ácido láctico). Cuando el eje central es autodegradable, no necesita ser de bajo peso molecular para proporcionar dicha degradabilidad. Un ejemplo específico de un polímero degradable para el eje central es un polímero para injerto de PEO (óxido de polietileno) y acetil-aspartato mostrado por la siguiente ecuación, en el que la primera ecuación presenta la formación del eje central del polímero degradable y el segundo esquema presenta la unión de las cadenas laterales a éste:

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La solubilidad, viscosidad, biocompatibilidad, etc., de la sección del eje central polimérico también es una consideración en cuanto a su efecto sobre las propiedades deseadas del producto del polímero final.

La sección del eje central polimérico puede ser la que incorpore puntos de unión de las cadenas laterales de polisacárido de modo que no se requiera un grupo enlazador independiente. Por ejemplo, los poli(aminoácidos) con grupos amino libres pueden utilizarse para este fin.

Cuando se utiliza un grupo enlazador, dicho grupo enlazador puede seleccionarse de entre cualquiera de los grupos divalentes que sean compatibles con la utilización última del polímero y que proporcionen un enlace covalente entre la sección del eje central polimérico y la(s) cadena(s) lateral(es) de polisacárido. Dichos grupos enlazadores son convencionalmente conocidos en la técnica para dicho fin y pueden unirse al eje central de manera convencional. Para el enlace del enlazador o el punto de enlace en el polímero al polisacárido, como el polisacárido está generalmente unido mediante un grupo carboxilato, las químicas útiles para reaccionar con grupos carboxilato son particularmente útiles para proporcionar el enlazador o punto de enlace en el polímero; véase Bronzino y Hermanson, mencionados anteriormente. El grupo enlazador puede seleccionarse para que afecte de manera significativa la biodegradabilidad del polímero dependiendo de la extensión de la capacidad de hidrólisis de los grupos en la cadena del enlazador. Resultan preferidos los enlazadores de aminoácido y los derivados de los mismos debido a la capacidad de control de la propiedad de degradación. Por ejemplo, los grupos enlazadores de aminoácido, tal como la glicina, proporcionarán enlaces éster que son fácilmente hidrolizables y, de este modo, facilitan la degradación del polímero en un medio acuoso, mientras que, los aminoalcoholes proporcionan un enlace éter que es significativamente menos degradable. Los aminoaldehídos son también grupos enlazadores útiles. Los grupos sustituyentes en los aminoácidos afectarán también la velocidad de la degradabilidad del enlace. El grupo enlazador puede también variarse en la longitud de la cadena dependiendo de las propiedades deseadas. Resultan preferidos los enlaces que proporcionan, por ejemplo, de 1 a 10 átomos entre el eje central y la cadena lateral, aunque son posibles las cadenas de enlace más largas. Además, el enlazador puede estar ramificado para que proporcione muchos puntos de unión para las cadenas laterales, por ejemplo, para proporcionar una configuración dendrítica tal como la mostrada en el Ejemplo 5. El enlazador estará en forma de un resto del compuesto de enlace con el grupo eliminado durante el enlace.

Las cadenas laterales son polisacáridos, preferentemente unidades de alginato opcionalmente modificadas, que permiten la preparación de un gel o de un líquido muy viscoso en presencia de un metal divalente, por ejemplo, Ca^{++} o Ba^{++}. Preferentemente están comprendidos por monómeros polimerizados de D-manuronato (M) y/o L-guluronato (G), pero, también comprenden dichos monómeros modificados. Las cadenas laterales están particularmente comprendidas preferentemente de bloques oligoméricos de unidades M, unidades G o unidades M y G. El peso molecular de cada cadena lateral o el número de unidades y la longitud de dichas cadenas laterales es de nuevo una función de las propiedades del polímero últimas deseadas y la capacidad de selección de este aspecto es una característica ventajosa de la invención. Aunque no existe limitación específica, el peso molecular de la cadena lateral puede estar comprendido entre aproximadamente 200 up y un millón, y puede contener, preferentemente 2 a 5.000 unidades M y/o G. En cuanto a la sección del eje central polimérico, las cadenas laterales de peso molecular mayor, por ejemplo superior a aproximadamente 100.000, son generalmente útiles cuando se desean polímeros más estables y cadenas laterales de peso molecular menor, por ejemplo, inferior a aproximadamente 30.000 a 50.000, son generalmente útiles cuando se desean especies biodegradables que pueden ser eliminadas por los riñones u otras funciones normales.

La distribución de las unidades M y G proporciona también una característica de controlabilidad de la invención con una proporción mayor de unidades G que proporcionan generalmente un polímero más rígido que mantendrá mejor su forma. Resultan particularmente preferidas las cadenas laterales con un porcentaje de unidades G a base del total de las unidades M y G desde el 10 al 100%. Aumentando o disminuyendo el número de unidades G en las cadenas laterales también permitirá aumentar o disminuir la velocidad de gelificación del polímero. Esto puede ser interesante cuando los polímeros se utilizan en soluciones inyectables y la velocidad se controla de modo que la solución gelificará en el tiempo apropiado después de la inyección. El número de cadenas laterales proporcionadas en la sección del eje central polimérico también afectará el alcance y la velocidad de gelificación y, de este modo, variará dependiendo de la utilización última. En general, más cadenas laterales darán como resultado un polímero compacto y más rígido y proporcionarán una concentración más densa de moléculas biológicamente activas unidas, si están presentes. El número de cadenas laterales está comprendido preferentemente entre 1 y 100% de las unidades de monómero reactivo disponibles en el eje central por molécula de polímero. No es necesario que cada grupo enlazador o punto de enlace se proporcione con una cadena lateral. Por ejemplo, puede permitirse que enlazadores libres o puntos de enlace faciliten la solubilidad y/o compatibilidad del polímero en su sistema deseado. Además, pueden proporcionarse enlazadores libres o puntos de enlace que permitan la adición posterior de cadenas laterales de alginato estructuradas o proporcionadas de manera diferente u otras cadenas laterales.

Además, la cadena lateral completa o unidades M y/o G individuales pueden modificarse a partir de unidades naturales. Las unidades de alginato M y G naturales presentan la misma estructura química general independientemente de su procedencia, aunque, la distribución y proporciones de las unidades M y G se diferenciará dependiendo de la procedencia. Los alginatos naturales, por ejemplo de algas o bacterias, pueden seleccionarse de este modo para proporcionar cadenas laterales con unidades M y G apropiadas para la utilización última del polímero. El aislamiento de las cadenas de alginato de fuentes naturales para su utilización como cadenas laterales en la presente memoria puede realizarse por procedimientos convencionales. Véase Biomaterials; Novel Materials from Biological Sources, ed. Byrum, capítulo Alginates (ed. Sutherland), pág. 309-331 (1991). Alternativamente, los alginatos preparados por síntesis que tienen una proporción y distribución de las unidades M y G seleccionadas preparadas por vías sintéticas análogas a las conocidas en la técnica pueden utilizarse como cadenas laterales. Además, los alginatos de fuentes naturales o sintéticas pueden modificarse para que proporcionen unidades M y G con una estructura modificada siempre que los polímeros con cadenas laterales modificadas proporcionen todavía un gel o líquido muy viscoso por interacción de las unidades de alginato con un metal divalente. Las unidades M y/o G pueden modificarse, por ejemplo, con unidades de óxido de polialquileno de peso molecular variado tal como el mostrado para la modificación de los polisacáridos en Spaltro (pat. US nº 5.490.978) con otros alcoholes tales como glicoles. La modificación de las cadenas laterales con dichos grupos generalmente harán más soluble al polímero, lo que generalmente produce un gel menos viscoso. Dichos grupos de modificación pueden también aumentar la estabilidad del polímero. Además, los polímeros pueden modificarse en las cadenas laterales para proporcionar resistencia al álcali, por ejemplo, tal como se muestra en la patente US nº 2.536.893.

La sección del eje central polimérico, los enlaces y las cadenas laterales pueden proporcionarse en numerosas configuraciones cuya configuración será un factor en la capacidad de control de las propiedades del polímero. La configuración de la sección del eje central polimérico, el número y situación de los puntos de enlace y el tipo y número de cadenas laterales determinará la configuración. En la figura 1 se representan ejemplos de configuraciones útiles aunque la invención no está limitada a dichas configuraciones y más configuraciones utilizando las tres unidades estructurales básicas pueden proporcionarse según la invención. Son especialmente preferidos, sin embargo, los polímeros que tienen la configuración ramificada. Obsérvese que las "cadenas laterales" de los polímeros lineales están en los extremos del terminal del eje central, pero se considera todavía cadenas laterales en éste. Además, las cadenas laterales pueden estar presentes entre las secciones del eje central del polímero en una configuración alternativa de tipo bloque.

Resultan preferidos los materiales en los que el propio eje central es un alginato. Las cadenas laterales, por ejemplo, pueden ser de poliguluronato procedentes del alginato sódico. Un ejemplo específico comprende poliguluronato con reticulación a sí mismo, mediante un enlace hidrolíticamente degradable, utilizando una molécula con reticulación bifuncional para formar un polímero reticulado. Los polímeros dendríticos y los polímeros en peine, como se describe a continuación pueden también proporcionarse como tales materiales. Estas estructuras pueden proporcionar un polímero muy reticulado que se degradaría rápidamente a componentes de peso molecular bajo y fácilmente sería eliminado por el cuerpo. Para conseguir este objetivo, por ejemplo, el polialdehído guluronato se hace reaccionar con hidrazina y borohidruro sódico para proporcionar el polihidrazino guluronato. Los grupos hidrazina en este polímero derivado de alginato se utilizan para incorporar cadenas del bloque G mediante su terminal hemiacetal. Esto proporciona materiales procedentes de polisacáridos naturales con enlaces hidrazona hidrolizables, por consiguiente, biocompatibles y biodegradables. La hidrólisis del enlace hidrazona en estos materiales conducirá a polisacáridos de cadena corta que pueden ser excretados por el riñón. Además, la reducción del enlace hidrazona por borohidruros puede formar un enlace hidrazina químicamente estable que proporciona materiales no degradables. De este modo, tanto los biomateriales biodegradables como los no degradables pueden proceder de polisacáridos naturales. La reacción de reticulación no daña las células en el polímero, lo que indica que estos materiales son útiles, por ejemplo, para el trasplante de células.

Los dendrímeros proporcionan una estructura de eje central particularmente interesante ya que presentan diferentes propiedades de los polímeros lineales correspondientes debido a la diferencia en la forma y estructuras moleculares. Las moléculas dendríticas pueden proporcionarse como un eje central con asas para ramificar un gran número de grupos funcionales en una zona compacta. Ya que los polipéptidos son biodegradables y sus productos de degradación (es decir, los aminoácidos) no son tóxicos, pueden utilizarse determinados polipéptidos (por ejemplo, polilisinas) como asas dendríticas. En relación con esto, los soportes del polímero soluble que combinan las ventajas tanto las síntesis en fase sólida como en solución pueden utilizarse para preparar los materiales. Los soportes del polímero soluble más típicos utilizados están compuestos por poli(óxido de etileno) (PEO). Las razones son la naturaleza hidrófíla de PEO y la insolubilidad en una variedad de disolventes orgánicos que es deseable para la purificación.

Una estructura de eje central más útil está constituida por polímeros en peine que contienen muchas cadenas laterales que se extienden desde un eje central polimérico. El poli(vinil alcohol) (PVA) proporciona un eje central particularmente útil para polímeros en peine. Los grupos alcohol del PVA pueden estar esterificados y someterse a la química de enlace carbodiimida expuesta anteriormente para proporcionar los enlaces de la cadena lateral.

Los materiales que contienen un eje central polimérico pueden prepararse utilizando procedimientos de síntesis conocidos en la técnica, algunos de los cuales se expusieron anteriormente, por ejemplo en el Biomedical Engineering Handbook, apartado 4; véase también Odian, Principles of Polymerization, capítulo 9, 2ª ed., (1970). Por ejemplo, pueden utilizarse materiales de partida del eje central polimérico los cuales contienen ya puntos de unión adecuados, por ejemplo, grupos amino libres tales como determinados poli(aminoácidos), o los polímeros pueden hacerse reaccionar con compuestos enlazadores para proporcionar puntos enlace adecuados, particularmente mediante la reacción de puntos adecuados en el eje central polimérico con derivados de aminoácido, opcionalmente con los grupos aminos que están protegidos. Además, pueden protegerse algunos puntos reactivos en el eje central para evitar la adición del grupo enlazador si se desea mantener dichos puntos libres o para proporcionar posteriormente dichos puntos con diferentes grupos enlazadores. Esta química es convencional en el campo de la formación del enlazador/polímero, especialmente que conlleva enlaces éster, amida, éter y otros enlaces covalentes; véase, por ejemplo Bronzino y Hermanson, citados anteriormente. Para los grupos protectores, véase, por ejemplo, Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry, 5ª ed. Pág. 550+ y 784+. Tras la eliminación de los grupos protectores opcionales en el enlazador, se realiza la reacción con la cadena lateral de unidades M y/o G, preferentemente mediante injerto por aminación reductora del extremo reductor de la cadena lateral con el grupo amino del enlazador, para producir los presentes polímeros. Se proporcionan cadenas laterales como las descritas anteriormente de procedencia natural o por síntesis, y pueden tener, opcionalmente, las modi-
ficaciones descritas, pueden estar unidas como se describió anteriormente o por otros procedimientos convencionales.

Otros análogos sintéticos de materiales de alginato son los proporcionados por reticulación covalente del alginato. Esta reticulación covalente expande en gran medida la gama de situaciones en las que estos materiales son útiles. Una aplicación específica de esta modificación es el desarrollo de matrices del alginato con memoria de forma. El alginato reticulado proporciona propiedades ventajosas de memoria de forma y propiedades de resistencia a la compresión que les hacen particularmente ventajosos para su utilización en la formación de matrices para trasplante de células. Las matrices de memoria de forma se diseñan para "recordar" sus dimensiones originales y, tras la inyección en el cuerpo en una forma compacta (por ejemplo, mediante una jeringuilla) u otros medios de colocación en el cuerpo o en otras posiciones que puedan encontrar utilización, reasumen su tamaño y forma originales. La propiedad de la memoria de forma del alginato es proporcionada por la reticulación del mismo. La reticulación puede también mejorar la resistencia a la compresión y/o otras propiedades mecánicas del alginato. Además, un alginato reticulado puede proporcionar un grado de adhesión celular incluso sin la utilización de ligandos de adhesión de la célula biológicamente activos. La gelificación por cationes divalentes proporciona otros medios para aumentar la viscosidad y el grado de estructura del alginato además de la reticulación. Además, el alginato reticulado puede estar unido por enlace covalente a por lo menos
un ligando de adhesión celular para proporcionar la adhesión celular y el mantenimiento de la viabilidad celular.

Un objetivo consiste asimismo en proporcionar un procedimiento para preparar dichos alginatos reticulados y para proporcionar composiciones y procedimientos que utilizan dichos alginatos reticulados.

El alginato utilizado para la reticulación según la invención son cadenas de alginato que contienen monómeros polimerizados de D-manuronato (M) y/o L-guluronato (G), pero la terminología "alginato" o "cadena de alginato" tal como se utiliza en la presente memoria también se pretende que comprenda las cadenas en las que dichos monómeros están modificados tales como las descritas a continuación cuando son compatibles con la utilización última y son capaces de reticularse por enlace covalente. La cadena de alginato está particularmente comprendida preferentemente por bloques oligoméricos de unidades M, unidades, unidades M y G o mezclas de dichos bloques. La estructura general de un copolímero lineal de alginato de unidades M y G se demuestra mediante la fórmula general siguiente:

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El peso molecular de la cadena de alginato y, por lo tanto, el número de unidades y la longitud de las cadenas puede seleccionarse dependiendo de las propiedades deseadas del polímero. En general, el peso molecular de cada cadena puede estar comprendido entre aproximadamente 1.000 y un millón, por ejemplo. Las cadenas de peso molecular mayor, por ejemplo, superiores a aproximadamente 100.000, son generalmente útiles cuando se desean polímeros de alginato más estables y las cadenas de peso molecular inferior, por ejemplo, inferior a aproximadamente 30.000 a 50.000, son generalmente útiles cuando se desean especies biodegradables que pueden eliminarse por los riñones o mediante otras funciones metabólicas normales.

La distribución de las unidades M y G proporciona también una característica de de controlabilidad de la invención con una relación mayor de unidades G que proporciona generalmente un material de alginato más rígido que mantendrá mejor su forma. Resulta preferida particularmente una cadena de alginato con un porcentaje de unidades G a base del total de unidades M y G desde 10 al 100%. Aumentando o disminuyendo el número de unidades G en la cadena también permitirá aumentar o disminuir, respectivamente, la velocidad de gelificación del alginato. Esto puede ser de interés cuando el alginato se utiliza en una solución inyectable y la velocidad está controlada de modo que la solución gelifique en el tiempo apropiado tras la inyección.

La cadena de alginato o las unidades individuales M y/o G pueden modificarse también a partir de las unidades naturales. Las procedencias de los alginatos naturales y de los alginatos modificados se describieron anteriormente en relación con las cadenas laterales de alginato para la forma de realización del eje central polimérico descrita anteriormente.

Además, los materiales que tienen un eje central polimérico al que se unen las cadenas laterales de alginato, como las descritas anteriormente, son útiles como materiales de partida de alginato. La reticulación puede tener lugar entre las cadenas laterales del mismo eje central y/o entre las cadenas laterales de otros ejes centrales. También es posible que tengan diferentes tipos de materiales que contienen alginato con reticulación proporcionada entre las secciones de alginato o las cadenas del mismo. Pueden utilizarse también mezclas de cualquiera de los materiales de partida de alginato anteriores.

La reticulación de los alginatos se realiza mediante la acción de un agente de reticulación que proporcione el enlace covalente, mediante el agente de reticulación, procedente de los grupos de ácido clorhídrico del ácido urónico de una unidad de alginato al grupo del ácido carboxílico del ácido urónico de otra unidad de alginato. Dicha reticulación es preferentemente entre las unidades de alginato de diferentes cadenas de alginato. Sin embargo, la reticulación puede tener lugar también entre unidades de alginato de la misma cadena o, en el caso en que los alginatos sean cadenas laterales en un eje central del polímero como se describió anteriormente, la reticulación puede tener lugar entre diferentes cadenas laterales en el mismo o diferentes ejes centrales poliméricos.

El agente de reticulación puede ser cualquier agente adecuado con por lo menos dos grupos funcionales que puedan unirse por enlace covalente a los grupos de ácido carboxílico y/o a los grupos alcohol del alginato o a los grupos modificados del mismo. Pueden utilizarse también agentes de reticulación de mayor funcionalidad. Por ejemplo, son útiles las poliaminas tales como los polímeros estrella bifuncional y trifuncional o las aminas dendríticas y éstas pueden prepararse, por ejemplo, por conversión de los correspondientes polioles. Los agentes de reticulación preferidos son aquellos con por lo menos dos grupos funcionales a base de nitrógeno tales como, por ejemplo, compuestos de diamina o dihidrazida; ejemplos no limitativos de éstos son los diaminoalcanos, los compuestos de la serie Jeffamine, la hidrazida del ácido adípico y la putrescina. Como agente de reticulación resulta, específicamente preferido, especialmente un éster del mismo, particularmente el éster metílico o etílico.

El agente de reticulación puede seleccionarse también para que proporcione un enlace más o menos biodegradable o no biodegradable de modo que el tiempo de vida del material de alginato reticulado resultante en su medio, por ejemplo in vivo, puede modificarse para la utilidad deseada.

Los enlaces amida formados cuando la reticulación con un agente de reticulación amínico de los alginatos son menos susceptibles a la escisión hidrolítica en comparación con los enlaces acetal entre las unidades consecutivas de ácidos urónicos de los alginatos. Por consiguiente, los productos reticulados con diamina regulares son de biodegradabilidad relativamente baja en esta serie de materiales, ya que el polisacárido (alginato) se degradará antes de que lo hagan las moléculas de enlace. Para mejorar la velocidad de biodegradación, puede incorporarse un grupo funcional más lábil en el reticulador. Los reticuladores biofuncionales biodegradables pueden sintetizarse según la serie de reacciones químicas bien demostradas. Véase la preparación de ejemplificación esquemática siguiente de un agente de reticulación con un enlace éster biodegradable:

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Modificación del etilenglicol para formar reticuladores bifuncionales biodegradables

Por ejemplo, el etilenglicol podría acoplarse con dos N-(t-Boc)glicina utilizando la química de la carbodiimida para proporcionar el producto intermedio 1,2-etilen-(N,N'-di-t-Boc)glicina. Este producto intermedio pudo desprotegerse utilizando ácido trifluoroacético en cloruro de metileno a varias temperaturas para proporcionar el producto intermedio 1,2-etilenglicoldiglicinato. Este producto intermedio pudo desprotegerse utilizando ácido trifluoroacético en cloruro de metileno a varias temperaturas para proporcionar el producto intermedio 1,2-etilenglicoldiglicinato. Además del etilenglicol, podrían utilizarse otras moléculas con dos grupos funcionales alcohol terminales. Además, los polioles que incluyen, por ejemplo, (forma de estrella o dendríticos) pudieron transformarse en tipos similares de reticuladores con grupos funcionales éster biodegradables incorporados que utilizan series de reacciones químicas en paralelo.

Preferentemente, aunque no necesariamente, la reticulación está facilitada por un compuesto activador que reacciona con el grupo de ácido carboxílico de la unidad de alginato para hacerle más reactivo al agente de reticulación. Los activadores útiles para la preparación de un grupo de ácido carboxílico más reactivo para el agente de reticulación, particularmente un grupo funcional amina del agente de reticulación, son conocidos en la técnica. Los ejemplos de los mismos incluyen, pero no se limitan a, carbodiimidas, particularmente carbodiimidas solubles en agua tales como, por ejemplo, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), 1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil)carbodiimida (CMC) y CDI (carbodiimidazol).

Se prefiere también, cuando se utiliza un compuesto activador, la utilización de un estabilizante para estabilizar el grupo activado resultante. De nuevo, se conocen en la técnica estabilizantes útiles para los grupos activadores. Para las carbodiimidas, particularmente el EDC, un estabilizante útil es el 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) que estabiliza el grupo activado frente a la hidrólisis. Otros estabilizantes útiles incluyen la N-hidroxisuccinimida y la N-hidroxisulfilsuccinimida (sulfo-NHS).

La secuencia de reacción que utiliza un agente de reticulación del éster etílico de lisina con el activador EDC y el estabilizante HOBT se presenta en el esquema siguiente:

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Serie de reacciones de reticulación de alginato. EDC activa el ácido carboxílico para proporcionar el producto intermedio O-acilisourea. Este producto intermedio reacciona con HOBT para formar el producto intermedio HOBT activado. Los grupos amino primarios en el éster etílico de lisina se acoplan a continuación a los grupos carboxilo activados de las moléculas de alginato adyacentes para formar alginatos reticulados.

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La reticulación puede realizarse generalmente a temperatura ambiente y en condiciones de pH neutro, sin embargo, las condiciones pueden variarse para optimizar la aplicación específica y la química de reticulación utilizada. Para la reticulación utilizando la química de EDC, opcionalmente con HOBT o etapas intermedias de sulfo-NHS, el pH desde 4,0 hasta 8,0 y las temperaturas desde 0ºC hasta la temperatura ambiente (25ºC) son óptimos y preferidos. Es conocido que, para esta química, no resultan preferidas temperaturas mayores debido a la descomposición de EDC. Asimismo, cuando se utiliza esta química, el pH básico (por ejemplo, de 8 a 14) no resulta preferido tampoco por esta razón.

Pueden también utilizarse otras químicas de reticulación. Por ejemplo, utilizando poli(etilenglicol) (PEG) como espaciador en un agente de reticulación con un aminoácido protegido con N (véase el Ejemplo 12). Asimismo, puede realizarse la reticulación del alginato oxidado con hidrazida del ácido adípico. La oxidación produce alginatos de polialdehído (alginatos oxidados límite) para la reticulación (véase el Ejemplo 17). Además, la reticulación puede efectuarse por activación con luz utilizando materiales fotorreactivos (véase el Ejemplo 26).

Otro procedimiento para alterar los mecanismos de los sistemas reticulados consiste en modificar el peso molecular entre las reticulaciones, M_{c}, en la red del polímero (Peppas y Bar-Howell, Hydrogels in Medicine and Pharmacy, vol. 1, CRC, Boca Raton, págs. 28-55, 1986; y, Anseth et al., Biomaterials 17: 1647-1657, 1996). M_{c} puede modificarse controlando la extensión de la reticulación o variando el peso molecular de la molécula de reticulación (Simon et al., Polymer 32: 2577-2587, 1991). Ambas estrategias pueden utilizarse para alterar las propiedades mecánicas de los geles de alginato. La reticulación covalente se ha conseguido con varios métodos diferentes. La reticulación con lisina produce la formación del enlace amida, que proporcionará estabilidad y se degradará muy lentamente. Los reticuladores con PEG contienen un enlace éster, que será más lábil para la hidrólisis. Por último, la reticulación de alginato oxidado con dihidrazida de ácido adípico conduce a un enlace hidrazona. Es importante que estos materiales pueden ser reticulados tanto por enlace covalente como iónico (por ejemplo, calcio). Esto puede demostrarse ventajoso en determinadas aplicaciones en las que desea una gelificación en dos etapas. Por ejemplo, los alginatos de polialdehído descritos a continuación se reticularán por enlace iónico muy rápidamente (por ejemplo, en minutos), mientras que la reacción de reticulación covalente puede diseñarse para que se produzca muy lentamente (por ejemplo, en horas). Un cirujano podría de este modo reticular por enlace iónico estos polímeros para proporcionar una solución que sea adecuada para la inyección con una jeringuilla o endoscopio, pero es bastante viscosa (la viscosidad en esta etapa disminuye a medida que aumenta la oxidación) de modo que no se extravase una vez se coloca. La reticulación covalente endurecería posteriormente el material implantado en una masa más rígida y no fluida.

La reticulación del alginato proporciona un material más estructurado, dependiendo el alcance de la estructuración, por lo menos en parte, del alcance de la reticulación. El alcance de la estructura del material de alginato dependerá también, entre otros factores, del alcance de la gelificación mediante la acción del enlace iónico del catión metálico divalente, como se expuso anteriormente, y de la naturaleza del material de alginato de partida, que como se expuso anteriormente puede variarse, por ejemplo, para afectar la rigidez del material. Dependiendo del alcance de la reticulación y de estos otros factores, el material de alginato reticulado puede trazar el espectro mediante, por ejemplo, las formas siguientes: un líquido viscoso, un gel hinchable, un gel no hinchable, una red de polímero hinchado o una matriz sólida.

El alcance de la reticulación es función de la cantidad de agente de reticulación y del procedimiento de reticulación utilizado, es decir, el porcentaje molar de agente de reticulación por mol de grupos ácido carboxílico de alginato reticulable. El alginato aumentará de viscosidad a medida que se reticula. Por lo tanto, el alcance de la reticulación dependerá de la utilización última. Por ejemplo, para proporcionar materiales de gel que tienen propiedades de superabsorbancia, es útil disponer de un alcance de reticulación bajo, por ejemplo, de aproximadamente 1 al 20%, preferentemente del 1 al 10%, de grupos reticulables reticulados. Para los materiales de la matriz del tejido, por ejemplo, el alcance de la reticulación preferentemente está comprendido entre aproximadamente el 5% y el 75%. En una forma específica descrita en los siguientes ejemplos, el alginato es un líquido viscoso cuando la cantidad de agente de reticulación es de aproximadamente el 25% molar o inferior, un gel hinchable cuando la cantidad es de aproximadamente 50% y una estructura sólida que mantiene su tamaño y forma cuando la cantidad es de aproximadamente el 75% o superior. Sin embargo, la química de la reticulación puede seleccionarse y utilizarse para controlar la viscosidad incluso en un alcance de reticulación inferior. En otra forma, el agente de reticulación se utiliza en una cantidad molar aproximadamente igual (es decir, 100% molar) al número de grupos de ácido carboxílico (ácido urónico) de alginato reticulable.

Además, la reticulación puede realizarse antes, después o simultáneamente a la gelificación mediante la acción de cationes metálicos divalentes. Resulta preferido para determinadas aplicaciones que la reticulación se realice antes o simultáneamente a la gelificación por el catión divalente a fin de evitar problemas con difusión del agente reticulante a las partes interiores del material gelificado.

Este material puede construir una matriz de gelificación en dos etapas. El alcance de la oxidación del alginato en la primera etapa de la síntesis controla los puntos de unión disponibles para la gelificación iónica, y de este modo regula la viscosidad de los geles reticulados de calcio. La reacción de reticulación covalente con hidrazida del ácido adípico se produce durante varias horas, y de este modo puede utilizarse para endurecer el gel lentamente. Las propiedades mecánicas definitivas de la matriz pueden controlarse variando el alcance de la reticulación covalente, y esto será función de la concentración de ácido adípico. Por ejemplo, puede diseñarse un material muy insensible al tiempo de duración de la reticulación iónica, y con un marco temporal para la reticulación iónica considerablemente más corto que el de la reticulación covalente.

En otra forma de realización, el alginato reticulado no se gelifica por acción de los cationes metálicos divalentes completamente o se gelifica por los cationes presentes in vivo solamente después de la administración del alginato reticulado al sistema biológico, por ejemplo, el cuerpo.

Por las razones expuestas anteriormente, el alcance de la rigidez y la estructura de la matriz de los materiales de alginato reticulados estarán influido tanto por la gelificación por el catión divalente como por el alcance y la naturaleza de la reticulación. La capacidad para variar estos y otros factores proporciona gran flexibilidad en el diseño de un material que es particularmente adecuado para su aplicación final.

Además del tipo de adhesión celular expuesto a continuación, la estructura de la matriz proporcionada por los propios alginatos reticulados puede facilitar las propiedades del tipo de adhesión celular, por ejemplo, debido a la retención de células en la matriz o a la acción de un agente reticulador, tal como la lisina. Por ejemplo, el alginato reticulado como matriz puede introducirse para la ingeniería tisular y la célula puede migrar dentro de los poros de la matriz in vivo. Presenta también ventajas, sin embargo, proporcionar los alginatos reticulados con moléculas biológicamente activas para facilitar la adhesión celular u otra interacción biológica, como se expone a continuación. Los ligandos pueden añadirse antes, durante o después de la reticulación del alginato y/o de la gelificación por cationes divalentes.

Para estudiar la inactividad biológica relativa de los materiales de polisacárido o alginato modificados sintéticamente expuestos anteriormente, los polímeros pueden modificarse con moléculas biológicamente activas. Otro aspecto de la invención se basa en modificar no solamente los análogos de alginato sintéticos expuestos anteriormente sino también los materiales de alginato modificados o análogos de base natural que se describen en la presente memoria. Incluso si el alginato o el material de alginato modificado no se proporcionan en un eje central polimérico y/o no reticulado, el acoplamiento del alginato con determinadas moléculas biológicamente activas lo convierte en muy útil para la ingeniería tisular y otras aplicaciones.

Los alginatos que contienen un eje central polimérico y/o los reticulados y los naturales o los materiales de alginato básicos modificados pueden modificarse con molécula(s) activa(s) de adhesión celular, por ejemplo, por enlace covalente utilizando la química de amidas entre los grupos amina de las moléculas biológicas y un grupo ácido carboxílico libre de los restos de ácido urónico (de las unidades M y G) del alginato o de otro polisacárido. Si el material está reticulado, unido a un eje central polimérico y/o modificado de otra manera, los grupos de ácido libre deben permanecer para añadir grupos de adhesión celular. Si los grupos de adhesión celular se añaden en primer lugar, deben permanecer los grupos activos para cualquier reticulación posterior, la unión al polímero u otra modificación. Pueden utilizarse también otras químicas para efectuar dicho enlace a la molécula biológicamente activa. Por ejemplo, el alginato o materiales análogos pueden modificarse para proporcionar grupos aldehídos en éstos, que son reactivos con el terminal amino de los péptidos para proporcionar un enlace imina que se reduce a un enlace de amina estable. Un ejemplo de esta química se describe en el Ejemplo 24 en la presente memoria.

Los ejemplos de moléculas de adhesión a células adecuadas incluyen los péptidos de acoplamiento a células conocidos, las secuencias del péptido de acoplamiento a proteoglucanos (véase la Tabla 2), proteoglucanos biológicamente activos (por ejemplo laminina y fibronectina) y otros polisacáridos (por ejemplo, ácido hialurónico y condroitina-6-sulfato). Los ejemplos de otras moléculas biológicas adecuadas incluyen los factores de crecimiento de péptidos (tales como EGF, VEGF, b-FGF, ácido FGF, factor de crecimiento derivado de plaquetas, TGF o TGF-\beta) y enzimas (Domínguez et al., 1988: Carbodiimide coupling of \beta-galactosidase from Aspergillus oryzae to alginate. Enzyme Microb. Technol., 10:606-610; y Lee et al., 1993: Covalent Immobilization of Aminoacylase to Alginate for L-hiphenylalanine production. J. Chem. Tech. Biotechnol., 58:65-70). Los ejemplos de estas moléculas y su función se representan en la Tabla 1 siguiente.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Proteínas específicas para la unión de la matriz extracelular. De Hubbell JA (1995): Biomaterial in tissue engineering. Bio/Tecnology 13:565-576. Se utilizan abreviaturas de una letra de aminoácidos, X representa cualquier aminoácido

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TABLA 2

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Son particularmente preferidos como moléculas de adhesión celular unidas a la cadena de alginato los péptidos sintéticos que contienen la secuencia de aminoácidos arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) que es conocida como un ligando de acoplamiento celular y se encuentra en varias moléculas de la matriz extracelular naturales. Además es de interés el péptido GREDVY (específico para la célula endotelial). Los alginatos con dicha modificación proporcionan propiedades de adhesión celular al análogo de alginato, alginato natural o alginato modificado, particularmente cuando se utiliza como matriz de trasplante celular y mantiene la supervivencia a largo plazo de sistemas de células de mamífero, así como el control del crecimiento celular y la diferenciación.

El acoplamiento de las moléculas de adhesión celular al alginato puede realizarse utilizando procedimientos sintéticos que son en general conocidos por cualquier experto en la materia. Un procedimiento particularmente útil es mediante la formación de un enlace amida entre los grupos de ácido carboxílico y la cadena de alginato y los grupos amino de la molécula de adhesión celular. Otras químicas de enlace útiles incluyen las expuestas en Hermanson, Bioconjugate Techniques, págs. 152-185 (1996), particularmente mediante la utilización de acopladores de carbodiimida, DCC y DIC (Woodward's Reagent K). Dado que muchas de las moléculas de la adhesión celular son péptidos; contienen un grupo amino terminal para dicho enlace. La formación del enlace amida está preferentemente catalizada por la 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), que es una enzima soluble en agua utilizada frecuentemente en la síntesis de péptidos. Un ejemplo de dicha química se presenta en la ecuación siguiente.

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En las que, EDC reacciona con restos de carboxilato en el eje central del alginato creando ésteres activados que son reactivos para las aminas. R-NH_{2} representa cualquier molécula con una amina libre (es decir, lisina o cualquier secuencia del terminal N de cualquier péptido). Para reducir las reacciones secundarias desfavorables, puede utilizarse EDC junto con N-hidroxisuccinimida, N-hidroxisulfilsuccinimida o HOBT para facilitar el enlace amida en las reacciones de competencia.

Las condiciones de reacción para esta química de acoplamiento pueden optimizarse, por ejemplo, por variación del tampón de la reacción, pH, relación EDC: ácido urónico, para conseguir diferencias de la incorporación del péptido entre 65 y 75%, por ejemplo. Preferentemente el pH está aproximadamente entre 6,5 y 7,5. La concentración iónica que proporciona el tampón (por ejemplo de NaCl) es preferentemente de aproximadamente 0,1 a 0,6 molar. La relación de los grupos EDC:ácido urónico es preferentemente de 1:50 a 20:50. Cuando se utiliza HOBT, la relación molar preferida de EDC:HOBt:ácido urónico es de aproximadamente 4:1:4. La densidad de los ligandos de adhesión celular, un regulador crítico del fenotipo celular después de la adhesión a un biomaterial (Massia y Hubbell, J. Cell Biol. 114:1089-1100, 1991; Mooney et al., J. Cell Phys. 151:497-505, 1992; y Hansen et al., Mol. Biol. Cell 5:967-975, 1994) puede variarse fácilmente en un orden 5 de intervalo de densidad de magnitud. Un ejemplo del mismo se presenta en la Figura 2.

Tanto el acoplamiento en la superficie, así como el acoplamiento en la masa de alginato pueden obtenerse fácilmente con esta química de acoplamiento. Por consiguiente, mediante la manipulación del acoplamiento en superficie y en la masa, pueden proporcionarse, por ejemplo, materiales que tienen un tipo de molécula acoplada internamente en la matriz y otro tipo de molécula acoplada en la superficie.

Pueden utilizarse otros procedimientos convencionalmente conocidos para la unión o la inmovilización de los ligandos de adhesión, tales como los expuestos en Bronzino citados anteriormente, págs. 1583-1596.

Las moléculas biológicas útiles para el acoplamiento a los materiales de alginato descritos anteriormente no están, sin embargo, limitadas a las que proporcionan la función de adhesión celular. Por ejemplo, el polímero podría estar unido a una molécula con función antiséptica cuando se utiliza como vendaje de heridas, o que proporciona la expresión del gen específica para el tejido de adhesión, factores de crecimiento para aumentar la proliferación de las células en el entorno o la vascularización del tejido o actividad antiinflamatoria.

La combinación de alginato y de materiales análogos al alginato con los ligandos de adhesión celular unidos a éstos proporciona un único entorno tridimensional en el que las células interactúan mediante varias fuerzas para la adhesión al alginato que tiene muchas utilizaciones, particularmente para aplicaciones en ingeniería tisular. Los ligandos de adhesión celular proporcionan puntos del receptor de la membrana celular específicos para las células deseadas. El número, tipo y posición de los ligandos de adhesión celular en el alginato o en el material análogo a alginato afectarán las propiedades de adhesión celular y de mantenimiento de la viabilidad celular y dichos factores pueden variarse para adaptar la aplicación específica. Dichas aplicaciones incluyen los procedimientos de ingeniería tisular aplicados a seres humanos y a animales. Preferentemente, se utilizan 10^{12} a 10^{-4} moles de moléculas de adhesión por mililitro de alginato hidratado; véase Massia et al., J. Cell. Biol.; vol. 114, págs. 1089-1100 (1991). Asimismo, pueden utilizarse las combinaciones de los ligandos de adhesión celular con los ligandos diferenciados de adhesión celular u otras moléculas bioactivas según la invención. Dichos grupos adicionales pueden estar unidos a otros puntos en el alginato o a puntos adecuados en los ligandos ya presentes en el alginato o en el material análogo al
alginato.

El alginato que tiene un eje central polimérico y/o que está reticulado o el alginato natural o modificado u otro polisacárido, opcionalmente con moléculas bioactivas, puede crear un medio extracelular sintético para las células de mamífero que es capaz de realizar las funciones diversas de la matriz extracelular natural (ECM). Los materiales descritos en la presente memoria, de este modo, tendrán aplicación en el campo de la ingeniería tisular, los biomateriales y en las ciencias biológicas de la célula básicas para estudiar las interacciones tridimensionales de la célula y la morfogénesis del tejido. Los materiales descritos en la presente memoria presentan ventajas como sistema de modelo para crear un ECM sintético capaz de guiar la expresión celular del gen durante la formación del tejido in vitro o
in vivo.

El ECM natural regula el crecimiento celular y la diferenciación con propiedades que permiten el control del medio mecánico y químico en torno a las células (D.E. Ingber. Mechanochemical Switching between growth and Differentiation by Extracellular Matrix, en Principles of Tissue Engineering (ed. Lanza, Langer and Chick) págs. 89-100 (1997)). El alginato y los materiales análogos pueden desplegar una amplia gama de propiedades mecánicas y, con la modificación covalente por las moléculas bioactivas descritas, puede desplegar una amplia gama de propiedades bioquímicas, tales como las que relacionan la célula de los mamíferos con el medio extracelular cuyas matrices de encapsulación de células anteriores no han podido. La modificación covalente con secuencias bioactivas permite la creación de un medio extracelular bidimensional o tridimensional sintético capaz de proporcionar señalización bioquímica en la forma de factores de crecimiento secuestrados, hormonas o secuencias activas dentro de estos productos químicos específicos, y de manera más importante permitirá a las células de los mamíferos comunicarse con otras células directamente a través del material de alginato mediante péptidos de acoplamiento celular (por ejemplo, RGD, YIGSR, REDV) unidos por enlace covalente directamente al material. Controlando a continuación las propiedades mecánicas del material de alginato, por ejemplo mediante la naturaleza del eje central del polímero y/o por reticulación y/o por modificaciones de la cadena de alginato del mismo en las maneras expuestas anteriormente, será posible controlar la señalización intercelular entre las células y entre las poblaciones celulares (véase D.E. Ingber. Mechanochemical Switching between Growth and Differentiation by Extracellular Matrix, en Principles of Tissue Engineering (ed. Lanza, Langer and Chick) págs. 89-100 (1997) y G.F. Oster, J.D. Murray y A.K. Harris, Mechanical aspects of Mesenchymal Morphogenesis, Journal of Embryology and Experimental Morphology, vol. 78, págs. 83-125 (1983)).

Se ha utilizado alginato inalterado como material para la inmovilización de las células durante muchos años debido a los hidrogeles estables formados en condiciones suaves de gelificación. Sin embargo, el alginato actúa solamente como agente neutro que pone en suspensión las células o los agregados celulares en las tres dimensiones. Al modificar este polisacárido estructuralmente de las maneras expuestas anteriormente y opcionalmente con péptidos de acoplamiento a células, factores de crecimiento, hormonas o secuencias que se unen a ECM, por ejemplo, el alginato puede transformarse en una matriz dinámica e interactiva capaz de guiar la expresión celular del gen en el espacio y en el tiempo. La capacidad para controlar las propiedades viscoelásticas del alginato es un aspecto integral en la guía de la expresión celular del gen (véase M. Opas, Substratum Mechanics and Cell Differentiation. International Review of Cytology, vol. 150, págs. 119-137 (1994); y G.F. Oster, J.D. Murry, y A.K. Harris, Mechanical aspects of Mesenchymal Morphogenesis, Journal of Embryology and Experimental Morphology, vol. 78, págs. 83-125 (1983)) y puede utilizarse en el modelo de sistemas de cultivo celular in vitro y en aplicaciones de ingeniería tisular.

Las matrices desempeñan una función central en la ingeniería tisular. Se utilizan matrices para suministrar células a puntos deseados en el cuerpo, para definir un espacio potencial para el tejido modificado genéticamente y para guiar el proceso del desarrollo tisular. La inyección directa de suspensión celular sin matrices se ha utilizado en algunos casos, pero es difícil controlar la colocación de las células trasplantadas. Además, la mayoría de los tipos de células de mamífero son dependientes del anclaje y morirán si no se proporciona con un sustrato de adhesión.

Los materiales de alginato en forma polimerizada y/o reticulada y/o modificada con moléculas bioactivas, como se expuso anteriormente, puede utilizarse provechosamente como matrices para conseguir la administración de células con gran carga y eficacia para puntos específicos. Los materiales según la invención también proporcionan soporte mecánico contra fuerzas de compresión y tensión, manteniendo de este modo la forma y la integridad de la estructura en medios agresivos del cuerpo. Este es particularmente el caso en que el alginato está reticulado en mayor grado. El soporte proporcionado por estos materiales puede actuar como una barrera física para los componentes del sistema inmunitario del hospedador o actuar como matriz para realizar la regeneración, dependiendo del diseño del
soporte.

El primer tipo de soportes, dispositivos inmunoprotectores, utiliza una membrana semipermeable para limitar la comunicación entre las células en el dispositivo y el hospedador. Los poros pequeños en estos dispositivos, por ejemplo, (d<10 \mum) permiten proteínas y moléculas de bajo peso molecular que han de transportarse entre el implante y el tejido hospedador, pero evitan que las grandes proteínas (por ejemplo, las inmunoglobulinas) y las células hospedadoras (por ejemplo, linfocitos) del sistema inmunitario se introduzcan en el dispositivo y medien en el rechazo de las células trasplantadas. En cambio, se utilizan por lo general estructuras abiertas con poros de gran tamaño, por ejemplo, (d>10 \mum) si el nuevo tejido es de esperar que se integre con el tejido del hospedador. La morfología de la matriz puede guiar la estructura de un tejido modificado, incluyendo el tamaño, la forma y la vascularización del tejido.

Como se expuso anteriormente, el alginato, el análogo de alginato y los materiales de alginato modificados de la invención son útiles para las matrices del trasplante celular. Estos materiales pueden utilizarse para proporcionar dicha matriz en alguna de las diversas maneras. Por ejemplo, cuando se desea que la matriz sea una matriz temporal para la sustitución por tejido natural, el material puede diseñarse para biodegradabilidad y liberación del sistema, por ejemplo, proporcionando enlaces hidrolizables, utilizando cadenas de alginato de relativamente bajo peso molecular, agentes de reticulación biodegradables, ejes centrales del polímero biodegradables y/o secciones del eje central del polímero de peso molecular bajo. Alternativamente, cuando se desean matrices menos degradables, pueden utilizarse enlaces no hidrolizables, cadenas de alginato de peso molecular mayor, agentes de reticulación no degradables y/o secciones de eje central del polímero de peso molecular mayor. Muchas maneras en las que las propiedades de los materiales pueden alterarse proporcionan un alto grado de controlabilidad en el suministro de materiales que cumplen los requisitos para la aplicación específica.

En una forma menos degradable, pueden introducirse las matrices en el cuerpo sin células, pero las células migrarán en el interior de la matriz, in vivo y se regenerarán en ésta. El alginato o el material análogo pueden proporcionarse en una forma inyectable, opcionalmente unidos a células viables apropiadas, tras la inyección en cuyo caso el catión del metal divalente endógeno en el sistema fisiológico tras la inyección produce la gelificación de las porciones de alginato del material. Alternativamente, se añaden cationes metálicos divalentes a la solución, por ejemplo como una solución de sulfato cálcico, justo antes de la inyección. Como se expuso anteriormente, el material puede diseñarse para controlar su velocidad de gelificación para igualar la utilidad última. Dichas soluciones inyectables pueden utilizarse para administrar las células a tejidos urológicos regenerados, para cirugía reconstructiva, sustitución de piel, otras aplicaciones ortopédicas u otra sustitución de tejido o aplicaciones de reparación. Los materiales que contienen alginato proporcionan una matriz muy estructurada, gelificada o muy viscosa en la que las células son compatibles y crecen hasta conseguir su función deseada, tal como la sustitución del tejido, opcionalmente la sustitución de la
matriz.

Como tales, los materiales, particularmente de tipo polimérico, pueden actuar como análogos para glucosamina-glucanos naturales y los proteoglucanos de la matriz extracelular en el cuerpo. Además, pueden utilizarse para proporcionar matrices gelificadas preformadas o muy viscosas unidas a células que pueden a continuación implantarse quirúrgicamente en un cuerpo. Es una ventaja particularmente sorprendente que los materiales pueden utilizarse para implantar una matriz que no contiene células y posteriormente las células pueden sembrarse en la matriz in vivo. Los materiales opcionalmente pueden proporcionarse, por ejemplo, en forma de gel, en forma de una solución viscosa, como cuerpo relativamente rígido, como hidrogel preformado, dentro de una membrana semipermeable, dentro de microcápsulas, etc., y las propiedades del polímero controlarse como se expuso anteriormente para facilitar dichas aplicaciones. La utilidad de los polímeros para el trasplante de células y la ingeniería tisular es un avance significativo en la técnica, particularmente ya que se consideró anteriormente que no era práctico o posible conseguir dichos resultados con materiales sintéticos; véase C. Ezzell, The Journal of NIH Research, julio 1995, vol. 7, págs.
49-53.

Los materiales también son ventajosamente útiles como vehículos para la administración de fármacos particularmente para la liberación prolongada. Para la aplicación en la administración de fármacos, es útil que la molécula bioactiva, es decir, el fármaco, esté unido al polímero alginato y/o al material análogo mediante un enlace degradable seleccionado para la liberación controlable del sistema. Otra utilidades de los materiales que pueden o no utilizar una molécula biológica unida incluyen, por ejemplo, vendajes para heridas, materiales con matriz para la cicatrización de heridas, matrices para estudios de cultivo celular in vitro, sustituciones para alginatos convencionales industriales utilizados, por ejemplo, como agentes de espesamientos de alimentos y como aditivos para impresión, por ejemplo para tintas espesas y usos similares en los que se desean propiedades descritas anteriormente. Una utilización particularmente ventajosa de los materiales reticulados, que no contiene necesariamente componentes bioactivos, son los materiales muy absorbentes. Particularmente, los materiales con una baja cantidad de reticulación, por ejemplo, aproximadamente del 1 al 20% de reticulación, tiene esta utilidad. La propiedad de absorbancia les hace útiles, por ejemplo, en aplicaciones para pañales de un solo uso. El control de las propiedades de los polisacáridos sintéticos según la invención y la reproducibilidad continua de dichos polisacáridos sintéticos seleccionados les hace particularmente ventajosos en muchas aplicaciones.

La exposición de todas las aplicaciones, patentes y publicaciones, en su totalidad mencionadas anteriormente y a continuación, se incorpora como referencia en la presente memoria.

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Ejemplos

Todas las temperaturas están publicadas sin corregir en grados Celsius; y, a menos que se indique de otro modo, todas las partes y porcentajes se expresan en peso.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Ejemplo 1

El esquema siguiente demuestra un procedimiento de preparación de una forma de realización de los alginatos de la invención modificados con la molécula RGD de adhesión celular:

9

En este esquema de reacción para la conjugación alginato/péptido, se añade la enzima con carbodiimida (EDC) a soluciones al 0,5% de alginato. Se dejan quince (15) minutos para la activación de los grupos de ácido carboxílico en el eje central del alginato. El péptido que contiene RGD se añade a la reacción y se deja reaccionar durante 24 horas a temperatura ambiente. La reacción se enfría mediante la adición de 1N HCL que desactiva la EDC. La solución se retorna a pH 7 con adición de NaOH 1 M y se dializa extensamente durante 3 a 5 días, eliminando los compuestos químicos sin reaccionar. El polímero se redisuelve a continuación en agua y se filtra con esterilización.

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Ejemplo 2

Se utilizó un pentapéptido (GRGDY) como modelo de péptido de adhesión celular. La amina libre del terminal N proporciona un punto para acoplarse al alginato, mientras que la tirosina del terminal C proporciona un punto para la yodación (que forma el péptido marcado con ^{125}I), lo que permite que la reacción de acoplamiento se analice cuantitativamente.

Todos los péptidos fueron sintetizados en la University of Michigan Peptide Core Facility, y el alginato de partida (inalterado) se adquirió en ProNova. El injerto covalente del péptido en el eje central del polímero de alginato se realiza en una solución de alginato al 1% (p/v) en un tampón de ácido 2-(N-morfolino)-etansulfónico (MES) 0,1 M que contiene NaCl 0,5 M. Se utiliza N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) como correactivo que aumenta en gran medida las eficacias de EDC de manera similar a HOBt. Se añade sulfo-NHS a la solución de reacción seguido por el péptido y el EDC. La relación de ácido urónico:EDC:sulfo-NHS es constante, mientras se varíe solamente el péptido disponible para la reacción. Esta química proporciona constantemente del 65 al 75% de eficacia de acoplamiento en comparación con el péptido disponible como se muestra en la Figura 2. Se deja reaccionar la solución durante 14 a 18 horas en cuyo tiempo se añade hidroxilamina para enfriar cualquiera de los sulfo-NHS-ésteres activados sin reaccionar y reestableciendo los carboxilatos. La solución se dializa extensamente frente a agua en tubería de diálisis 3500 MWCO. Los experimentos preliminares que utilizan GRGDY marcado con ^{125}I indican que el <0,5% del péptido sin reaccionar permanece después de la diálisis, lo que sugiere un producto de alginato-péptido relativamente puro. La solución dializada se filtra con esterilización, se liofiliza y se almacena en seco hasta su utilización. Puede utilizarse una técnica descrita recientemente (Klock et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:638-643, 1994) para detectar cualquier contaminante de polifenol en el alginato.

La modificación en la superficie solamente de los hidrogeles de alginato se proporcionará para los experimentos de cultivo celular en dos dimensiones para ahorrar reactivos. Este procedimiento se realiza en condiciones estériles con todos los reactivos en soluciones acuosas filtradas estériles. La reacción puede realizarse en el tampón MES anterior o en H_{2}O bidestilada con pérdida posterior de 10 veces de la eficacia de la reacción. Los experimentos con ^{125}I presentan eficacias de reacción similares al alginato modificado en conjunto. Los geles reticulados de alginato se funden entre placas de vidrio en paralelo con espaciadores de 2 mm y los discos se perforan con punzones circulares. Se añaden diez a doce discos a los tubos de centrífuga de 50 ml con 40 ml de solución de reacción con los reactivos en las mismas proporciones que anteriormente. Los discos se lavan extensamente en agua, y a continuación DMEM antes de colocarse en placas de 24 pocillos para los experimentos con las células.

Las condiciones de reacción se han optimizado por variación del tampón de reacción, pH, relación EDC:ácido urónico, y las eficacias de la incorporación del péptido entre 65 y 75% se obtienen de forma típica. La densidad de los ligandos de adhesión celular, un regulador crítico del fenotipo celular después de la adhesión a un biomaterial puede variarse fácilmente más de 5 órdenes de magnitud de intervalo de densidad. Tanto el acoplamiento en superficie, así como el acoplamiento en la masa de alginato puede obtenerse fácilmente con este método.

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Ejemplo 3

La adhesión de fibroblastos 3T3 y de mioblastos del esqueleto a matrices de alginato se ha confirmado en el cultivo. Véase la Figura 3, aunque no se aprecia ninguna adhesión celular sobre las superficies de alginato de referencia sin ligandos de adhesión, incluso en el medio que contiene suero. Además, los mioblastos del esqueleto presentan un fenotipo diferenciado en estas matrices. Como las superficies del hidrogel del alginato inalteradas no soportan la adhesión celular, estos datos sugieren que la señalización con ECM insoluble para la diferenciación celular puede proporcionarse en parte mediante el acoplamiento de ligandos de adhesión celular.

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Ejemplo 4

El esquema siguiente demuestra un procedimiento de preparación de los materiales del eje central polimérico de la invención:

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10

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Este esquema presenta un ejemplo de la serie de reacciones de síntesis que puede utilizarse para la síntesis de los copolímeros de injerto. Se preparó el oligo-guluronato por hidrólisis parcial de alginato con un contenido del 70% en guluronato. Se produjo preferentemente la hidrólisis en la zona alternativa (zona M/G), por consiguiente, se produjo una mezcla de oligo-manuronato y oligo-guluronato. Este último se separó del otro oligómero por solubilidad diferencial en condiciones muy ácidas. Véase Penman A., Sanderson G.R. (1972): A method for the determination of uronic acid sequence in alginates. Carbohydr. Res. 25:273:282 y Haug A., Larson B., Smisrod O. (1966): A study of the constitution of alginic acid by partial acid hydrolysis. Acta Chem. Scand. 20:183-190. Se acopló PVA (poli (vinil alcohol)) a Boc-glicina en presencia de diciclohexil carbodiimida. La cantidad de Boc-glicina en la mezcla de reacción controla la relación de ramificación de los copolímeros de injerto resultantes en las últimas etapas. El grupo protector Boc se eliminó en condiciones ácidas y el injerto posterior de oligo-guluronato por aminación reductora del extremo reductor del carbohidrato con el grupo amino de glicina en PVA proporcionó los copolímeros deseados.

Ejemplo 5 Eje central: hidrocloruro de poli (alilamina) PAM

11

Forma molecular de la unidad que se repite: C_{3}H_{8}NCl

Peso molecular de la unidad que se repite: 93,5

Peso molecular (Mn) comunicado por Aldrich: 50.000-65.000

Es decir, nº de unidades que se repiten en cada molécula de polímero: 535-695

No degradable procedente del eje central

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Cadena lateral: oligo-guluronato (Gul)

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Polímeros PAM-Gul en peine por unión directa del eje central a las cadenas laterales

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La incorporación de las cadenas laterales fue controlada mediante la relación de Gul a PAM a fin de proporcionar polímeros con el 100%, 50% y 10% de puntos en el eje central con cadena lateral.

Ejemplo 6

14

Ejemplo 7

Eje central de polietilenglicol (PEO) (véase el esquema del Ejemplo 8) con el grupo enlazador ramificado para proporcionar polímeros dendríticos cuando se añaden cadenas laterales de polisacárido.

Los polímeros dendríticos pueden formar redes por coordinación de los iones calcio entre las cadenas laterales de dos o más polímeros dendríticos diferenciados. El grupo enlazador es hidrolizable, y por lo tanto degradable.

Ejemplo 8

Se prepararon polilisinas dendríticas en forma de eje central polimérico para la incorporación de las cadenas de alginato del bloque G como se muestra en el esquema siguiente. Los grupos amino de la lisina se protegieron mediante el grupo Boc mientras que el extremo carboxilo se dejó desprotegido para el acoplamiento del péptido que se consiguió por la química DCC/HOBt. Se acopló en primer lugar PEO (Pm 8000) al éster de hidrosuccinamida de la lisina protegida con di-Boc en diclorometano. El polímero lavado con éter se disolvió en TFA al 25% en CH_{2}Cl_{2} para eliminar el grupo Boc. La precipitación en éter proporcionó el péptido desprotegido listo para el siguiente ciclo de acoplamiento. El acoplamiento de las correspondientes poliaminas libres en el soporte de polímero con bi-Boc-lisina activada con DCC/HOBt en exceso proporcionó los dendrímeros G-1, G-2 y G-3 unidos a PEO, respectivamente, tras la cristalización en éter. La escisión de los péptidos de los soportes del polímero se consiguió tratando el conjugado PEO-péptido en metanol con hidrazida durante 1 hora que produce los dendrímeros del péptido con hidrazina con buenos rendimientos. Además, se preparó también el dendrímero G-2 con el extremo hidroxilo libre tratando con solución de hidróxido sódico acuoso en metanol durante 1 hora. PEO-Gn (n=0-3) proporcionó espectros satisfactorios de RMN de protones y carbonos. La pureza y estructura de los dendrímeros G-2 y G-3 se demostró por TLC, análisis elemental y espectroscopia de ^{13}C-RMN.

En resumen, una polilisina dendrítica G-3 (15 unidades de L-lisina) de peso molecular 3096 se sintetizó rápidamente en 7 etapas. Los autores han diseñado estos dendrímeros para acoplar las cadenas del bloque G mediante su terminal hemiacetálico. Esto se consiguió por aminación reductora utilizando cianoborohidruro sódico.

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Síntesis del dendrímero PEO-lisina: a) TFA, CH_{2}Cl_{2} b) L-lisina, DCC, HOBT, CH_{2}Cl_{2}.

Ejemplo 9

Se prepararon polímeros en peine utilizando poli(vinil alcohol) (PVA). PVA pertenece a una clase de polímeros solubles en agua cuyas propiedades pueden variar extensamente. PVA no puede sintetizarse directamente debido a la inestabilidad de su monómero. La desacetilación del poli(vinil acetato) por alcohólisis, hidrólisis o aminólisis conduce a los PVA. La hidrofilia y la solubilidad en agua pueden controlarse fácilmente por la duración de la hidrólisis y el peso molecular del poli(vinil acetato) utilizado. El PVA no es ciertamente biodegradable, debido a la falta de enlaces lábiles, pero el PVA con un peso molecular <20 K puede eliminarse a través de los riñones y ser utilizado como matriz para administración de fármacos y prótesis quirúrgicas.

El PVA (P.M. = 9.000-10.000, hidrolizado al 80%) puede esterificarse en DMF con Boc-glicina utilizando el procedimiento de acoplamiento con DCC, mostrado en el esquema siguiente. Variando la relación de grupos hidroxilo en el PVA a la cantidad de grupos carboxilo en la Boc-glicina pueden obtenerse diferentes grados de injerto (es decir 0,8, 0,25 y 0,16). El grupo amino protector (Boc) puede eliminarse mediante la utilización de ácido trifluoroacético en CH_{2}Cl_{2}. El polímero se caracteriza por los procedimientos normalizados de laboratorio tales como TLC, FT-IR, ^{1}H-RMN y SEC acuoso. En la segunda etapa de la reacción el PVA con grupos funcionales aminos puede acoplarse por enlace covalente mediante aminación reductora al oligoguluronato.

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Esterificación de PVA 1 con Boc-glicina 2 en DMF y desprotección posterior con ácido trifluoroacético en CH_{2}Cl_{2}.

Ejemplo 10

Preparación 1 - Se prepararon cinco soluciones madre de alginatos sódicos acuosos (2%) en matraces Erlenmeyer. Se añadió éster etílico de lisina a cada solución para proporcionar las relaciones siguientes: 0, 25, 50, 100, 150% relación molar lisina: ácido urónico. Se añadieron a cada solución el doble de la cantidad de moles de lisina de cada EDC y HOBT. Se mezclaron las mezclas intensamente y se vertieron sobre placas petri. Se añadió a continuación polvo de sulfato cálcico para gelificar las soluciones durante 24 a 48 horas. Se prepararon discos circulares de cada lote, se lavaron con agua destilada y se liofilizaron. Las dimensiones y pesos de cada disco se midieron antes y después de la liofilización.

Preparación 2 - Se prepararon varias soluciones madre de alginatos sódicos acuosos (2%) en matraces Erlenmeyer. Se añadió a cada solución la cantidad seleccionada de éster etílico de lisina (relación molar de lisina: ácido urónico 0, 25, 50, 100 y 150%) y se agitó durante 24 horas. Se vertió cada solución en una placa petri para formar una capa de 3 mm de diámetro. Se añadió a continuación polvo de sulfato cálcico a la superficie de las capas para producir la gelificación. Una vez endurecidos los geles (24 a 48 h.), se cortaron discos circulares de todos los geles. Cada serie de discos se transfirió a un tubo de ensayo. Se añadieron a continuación EDC y HOBT (relación molar lisina:EDC:HOBT 1:2:2) a cada tubo. Se agitaron los discos durante 24 horas y se enjuagaron con agua destilada. Se registraron las dimensiones y el peso en húmedo de cada disco. Se congeló a continuación cada disco y se liofilizó y se registraron después las dimensiones y el peso en seco de cada disco.

Estudio 1: Los geles de alginato preparados utilizando varias combinaciones de reactivos (véase la Tabla A) que utilizan la reparación 2, se probó su capacidad para mantener su estructura después de la quelación del calcio exponiendo a una solución de citrato sódico. Los geles de alginato de referencia (no reticulados) se disolvieron como cabía esperar. Se utilizó lisina protegida con t-boc como referencia en este estudio ya que los grupos amino en la lisina se protegen y no pueden acoplarse a los grupos de ácido carboxílico del alginato. Los geles de alginato reticulados con lisina que utilizan EDC solo no se disolvieron, pero aumentaron de tamaño después de la quelación del calcio. Los geles de alginato reticulados utilizando EDC y HOBT mantenían sus dimensiones originales. Estos resultados confirman que la reticulación de los geles de alginato conduce a matrices en las que la estructura puede mantenerse independientemente de la reticulación del catión divalente y también sugiere que la presencia del estabilizante de HOBT mejora la reticulación.

TABLA A

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Estudio 2: Se reticularon geles de alginato por el procedimiento 2 utilizando varias relaciones de alginato a lisina a fin de determinar si había una dependencia de la dosis de la estabilidad del gel en el contenido de lisina. Los geles reticulados con EDC solo (sin HOBT) y EDC + HOBT se expusieron a citrato sódico y se examinó el hinchamiento o la disolución. La disolución y la estabilidad del gel era función del contenido en lisina y de las condiciones de reticulación tal como se muestra en la Tabla B.

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TABLA B

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Estudio 3: Geles de alginato reticulados con lisina (100% de contenido en lisina, reticulación con EDC y HOBT) se cortaron en bloques (volumen inicial 576 mm^{3}), se liofilizaron y a continuación se probó su memoria de forma (véase la Figura 4). Las matrices secas (lado derecho de la figura) se comprimieron y se colocaron en la tubería (mitad de la figura) con un diámetro interno de 1,56 mm (aproximadamente un diámetro de tubería de 4,5 French - por lo general utilizado para procedimientos endoscópicos) y se impulsaron a través de una parte de la tubería de 5 cm de longitud. Se colocaron a continuación las matrices en una placa de petri que contenía agua y se observaron a lo largo del tiempo. Estas matrices volvieron a una geometría del bloque (lado izquierdo de la figura) después de 1 hora y se obtuvo un volumen de aproximadamente 400 mm^{3} (aproximadamente 70% del volumen inicial) durante este tiempo. La capacidad de estas matrices para recuperar su tamaño y forma aproximada después de esta compresión severa indica que tienen memoria de forma significativa.

Estudio 4: Una característica importante de las matrices reticuladas es su capacidad para ser sembradas con células después de la preparación. Los geles de alginato reticulados (contenido en lisina del 100%, EDC + HOBT hasta reticulación) se liofilizaron y esterilizaron. El examen de exploración al microscopio electrónico de las matrices puso de manifiesto un material muy poroso con grandes poros (Fig. 5). Las matrices se colocaron en una suspensión de células de músculo liso en medio de cultivo tisular (DMEM enriquecido con suero de ternero al 10%) y se examinó la infiltración celular. La observación de las matrices al microscopio indicó que la suspensión celular absorbida en matrices de alginato reticuladas, y esto produjo una distribución de células a través de las matrices (no representada en la Figura).

Estudio 5: Geles de alginato al 2% se reticularon con lisina (lisina al 100%) utilizando un procedimiento, sin embargo, se utilizaron concentraciones de EDC de 10 veces y de 5 veces HOBT para optimizar la reticulación. Se añadieron 20 g (aproximadamente 20 ml) de solución de alginato al 2% a recipientes cónicos de 50 ml y se seleccionó lisina (0%, 1%, 10%, 25%, 50% y 100% de lisina en comparación con las unidades de monómero de alginato) y se añadieron cantidades de HOBT. Se mezclaron bien las soluciones, a continuación se añadieron cantidades apropiadas de EDC. Inmediatamente después de la adición de EDC, se añadieron 0,168 gramos de sulfato cálcico y los recipientes cónicos se agitaron intensamente durante 10 a 20 segundos antes de verter la solución. Se polimerizaron los geles durante 3 horas entre placas paralelas separadas aproximadamente 2,5 mm. Se perforaron a continuación los discos y se añadió citrato sódico (para eliminar el calcio) o cloruro cálcico 0,1 M durante 10 minutos antes de almacenamiento en agua destilada. La estabilidad del gel con eliminación de calcio y experimentación mecánica se realizó en todas las condiciones.

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La dependencia de la dosis del contenido de lisina del estudio 2 se volvió a confirmar, pero el alcance de la reticulación aumentó tal como sugirió la completa estabilidad del 25% y más de los geles reticulados en la eliminación del calcio. El módulo de compresión de los discos de gel disminuyó al aumentar el contenido en lisina debido probablemente a la destrucción de la lisina de los puntos de unión del calcio en el alginato. Resulta interesante, en la eliminación del calcio con citrato sódico, que el módulo de los discos de gel aumenta al aumentar el contenido en lisina.

Ejemplo 11

La reticulación del alginato con diaminas se realiza en un tampón MES 0,1 M de pH 7 con NaCl 0,3 M. La química se ha optimizado para la reticulación máxima con las variables pH, [NaCl] y la relación EDC:HOTBt:ácido urónico. La EDC reacciona con el grupo carboxilo del ácido urónico creando un producto intermedio de éster activado que es reactivo con las aminas. Una reacción principal de competición con formación de enlace amida es la hidrólisis del producto intermedio de EDC con agua y la vida media del producto intermedio EDC es del orden de segundos (Hermanson, 1996, citado anteriormente). Sin embargo, la adición de correactivos como HOBt o N-hidroxisulfosuccinimida reaccionará con el éster activado por EDC creando productos intermedios de larga duración que conducen a eficacias de reacción mayores (Hermanson, 1996, citado anteriormente).

Ejemplo 12

El esquema de reacción de las moléculas de reticulación PEG, mostrado a continuación implica la adición de cantidades equimolares a base de grupos alcohol de poli(etilenglicol) (1) y aminoácido protegido con N (2) y la esterificación por acoplamiento directo por DCC y DMAP en CH_{2}Cl_{2}. La desprotección del grupo protector BOC en el compuesto (3) se realiza mediante la utilización de ácido trifluoroacético (TFA). Las reacciones de reticulación entre el grupo del alginato y los grupos amino primario de la molécula PEG modificada se realizan mediante la formación de un éster activo de hidroxibenzotriazol in situ y la adición posterior del agente de acoplamiento EDC. Los grupos funcionales de PEG se purificaron por cromatografía en columna de líquido y se caracterizaron utilizando métodos de laboratorio normalizados tales como TLC, FT-IR, ^{1}H-RMN y análisis elemental. La distribución del peso molecular así como la información de la estructura de los polímeros se determinará por mediciones de GPC en solución acuosa. Los autores están utilizando una nueva tecnología analítica conocida como SEC^{3} (RI, viscosímetro, RALLS) para obtener pesos moleculares absolutos eliminando de este modo la suposición de que el patrón y la muestra tienen la misma estructura molecular.

Se obtuvo poli(etilenglicol) con pesos moleculares P.M. de 200, 400, 600 y 1.000 en Lancaster Synthesis Inc., PEG con P.M. 3.400 y 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC) se adquirió en la compañía química Aldrich. La N-t-boc-glicina (98%), el ácido trifluoroacético y la 1-etil-3-[3-dimetilamino-propil] carbodiimida (EDC) se adquirieron en Sigma, St. Louis, MO.

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(A) Síntesis de poli(etilen glicol)es terminado(s) en amino con varias unidades de repetición n comprendidas entre 4,5 y 77,3 (PM= 200, 400, 600, 1.000, 3.400).

(B) Reacción de la molécula de reticulador con PEG con alginato sódico.

Las soluciones de reacción se funden entre placas de vidrio en paralelo durante 12 a 16 horas y las formas definidas pueden cortarse en estas láminas además hidrogel. Las formas definidas pueden también formarse fundiendo la solución de reacción en un molde del tamaño deseado y dejando que se produzca la reacción de reticulación. En los hidrogeles resultantes se caracterizan las propiedades mecánicas (módulo elástico, módulo de cizallamiento, tensión máxima verdadera, extensión máxima) y las propiedades de hinchamiento. El éster metílico de lisina y el PEG modificado terminado en amino de pesos moleculares 200, 400, 600, 1.000 y 3.400 se utilizó para reticular el alginato en relaciones de grupos amino de grupos carboxilo 3 - 50%.

Ejemplo 13

Alginatos de lisina reticulados. Se reticularon hidrogeles de alginato con el éster metílico de lisina. Se optimizó la química de la carbodiimida para la reticulación eficaz máxima con cualquier contenido de lisina dado variando el pH, la fuerza iónica del tampón de reacción y la relación EDC:HOBt:ácido urónico. Los mecanismos de la red de hidrogel pueden controlarse variando la cantidad de lisina disponible para la reticulación (Figura 6). El módulo elástico de los hidrogeles aumenta al aumentar el contenido de lisina hasta el 35%, pero a continuación disminuye la lisina adicional añadida. Esta disminución en el módulo se atribuye a un aumento en los defectos de la red incluyendo las lisinas colgantes a medio reaccionar y a los bucles ineficaces por su elasticidad que no contribuyen a las propiedades mecánicas de la red, y en este caso realmente desvirtúan a los mecanismos debido al número de defectos de cizallamiento.

Las propiedades mecánicas, incluyendo la rigidez demostrada por el módulo elástico, así como la resistencia y la elasticidad, pueden controlarse variando la cantidad de lisina disponible para la reacción.

Las capacidades de hinchamiento de los hidrogeles reticulados con lisina se determinaron midiendo el volumen de agua una masa conocida de absorciones de alginato reticulado. Se cortaron discos de hidrogel hinchados a 15,7 mm de diámetro, se secaron con un paño y se lavaron para determinar el peso de agua y polímero. Se congelaron a continuación los discos y se liofilizaron para eliminar toda el agua de los hidrogeles, dejando discos vellosos muy porosos tras la liofilización. El peso en húmedo inicial de los hidrogeles se dividió por el peso en húmedo de los discos secos para determinar la reacción de hinchamiento (Figura 7). La capacidad de hinchamiento de los hidrogeles de alginato reticulados con lisina disminuyó con el aumento de reticulación. Los alginatos poco reticulados absorben más de 2.000 veces su masa en agua, lo que sugiere que serán útiles como materiales superabsorbentes (por ejemplo, en pañales de usar y tirar). Los geles más reticulados absorberán aproximadamente 70 veces su peso en agua, con densidades intermedias de reticulación comprendidas entre estos dos extremos. Los discos secos se vuelven a humedecer a continuación con H_{2}O bidestilada durante 48 horas y se pesan para determinar si los discos liofilizados podían absorber cantidades comparables de agua que tenían inicialmente. Los discos liofilizados podían absorber cantidades similares de agua que tenían inicialmente \pm aproximadamente 10%. Los geles más reticulados (75% de lisina) absorbieron aproximadamente 10% menos agua y los geles poco reticulados (1 a 20% de lisina) absorbieron 10% más de la medida inicialmente. En el secado, la fase de red de alginato se separa para hacer una esponja muy porosa. La microestructura de la red hidratada no parece volver a adoptar la forma inmediatamente en la rehidratación, ya que mucha del agua absorbida por las esponjas puede eliminarse colocando la esponja en un paño en las primeras pocas horas después de la rehidratación. Sin embargo, después de 48 horas del empapado, puede eliminarse muy poca agua de la estructura cuando se expone a un paño seco lo que sugiere que la estructura de red hidratada retorna.

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Ejemplo 14

Las matrices de alginato muy reticuladas presentan propiedades ventajosas de memoria de forma en determinadas aplicaciones. Las matrices de alginato liofilizadas actúan como esponjas hidrófilas cuando se exponen al agua, hidratándose casi instantáneamente. Para demostrar las propiedades de memoria de forma, se comprimieron esponjas reticuladas con 50% de lisina, se enrollaron en cilindros impermeables y se les proporcionó a través de una tubería de silicona de 3 mm de D.I. para administrar endoscopia mímica en el banco del laboratorio. Las matrices enrolladas se impulsaron a través de la tubería con cinta de teflón flexible (1,3 mm D.O.) y recobraron su forma y dimensiones iniciales a los segundos de la rehidratación. Las propiedades de absorción de agua de los discos comprimidos son similares a las de los discos no comprimidos (en el estudio de hinchamiento anterior) y absorben aproximadamente 90% del contenido en agua inicial después de 24 horas.

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Ejemplo 15

El peso molecular entre las reticulaciones en la red de alginato se calculó directamente a partir del módulo de cizallamiento y de las mediciones de hinchamiento (Peppas y Merrill, J. Appl. Polym. Sci. 21: 1763-1770, 1977) para evaluar la densidad de las reticulaciones funcionales (entre la cadena). Este número puede compararse a continuación al número total de reticulaciones (dentro y en el interior de la cadena) determinadas químicamente. El cálculo de M_{c} se realizó utilizando la relación:

Ecuación 1G = RTC_{r}/M_{c} (1-2M_{c}/M_{n})Q^{-1/3}

en la que G es el módulo de cizallamiento, R y T son la constante del gas y la temperatura en grados Kelvin respectivamente, C_{r} es la concentración de polímero en la solución de reticulación, M_{c} es el peso molecular entre reticulaciones y M_{n} es el peso molecular medio en número del polímero natural. Q es la relación de hinchamiento definida como

Ecuación 2Q = v_{r} / v_{s}

siendo v_{r} la fracción en volumen del polímero en el gel reticulado sin hinchar y v_{s} es la fracción en volumen en el gel hinchado. G se obtiene a partir de la manipulación de los datos de resistencia-cepa del experimento de compresión representando la resistencia frente a -(\lambda-1/\lambda^{2}) siendo

Ecuación 3\lambda = L / L_{0}

L_{0} y L el espesor del gel antes y durante la compresión respectivamente.

Estos cálculos indican que M_{c} está comprendido entre 1.500 para los alginatos más reticulados con lisina, y aproximadamente 25.000 para los alginatos menos reticulados (1% de lisina).

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Ejemplo 16

Se han realizado también estudios para variar la M_{c} alterando el peso molecular de la molécula de reticulación en alginatos reticulados con polietilenglicol. Estos estudios han utilizado diaminas de PEG sintetizadas en los laboratorios de los solicitantes como molécula de reticulación. El módulo de compresión de los geles de alginato aumentó con el número de unidades repetidas en la molécula de reticulación hasta un peso molecular de 1.000. Véase la Figura 8. Se muestra el módulo elástico en compresión [KPa] frente al número de unidades repetidas en la molécula de reticulación. Una cantidad molar igual de cada monómero se utilizó en cada reacción. Esto puede relacionarse directamente con el peso molecular de la PEG de reticulación o con un aumento de flexibilidad del monómero de reticulación que produce una extensión mayor de la reacción (Allen et al., Macromolecules, 22: 809-816, 1989). Se observó una disminución en el módulo con un aumento adicional en el peso molecular de la molécula de reticulación. Variando la densidad de reticulación (utilizando PEG con un peso molecular de 1.000), de nuevo presentó un efecto fuerte en la rigidez de los geles. Se observaron resultados similares con lisina, un aumento en el módulo para una determinada reticulación, pero después disminuyó con reticulación adicional. La Figura 9 que presenta el modulo elástico frente a la densidad de reticulación [%] que utiliza el PEG de peso molecular 1.000 como molécula de reticulación. Esta disminución en el módulo es de nuevo probablemente atribuible a un aumento en los defectos de la red a concentraciones de PEG diamina mayores, incluyendo más PEG colgantes a medio reaccionar que desvirtúan los mecanismos.

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Ejemplo 17

Alginatos de polialdehído reticulados (PAA). Un método adicional para reticular los alginatos con enlace covalente consiste en oxidar el alginato y reticularlo con un reticulador bifuncional para formar hidrogeles. De este modo, el alginato, 1, se modificó mediante oxidación con peryodato sódico, como se muestra a continuación, a temperaturas ambiente para proporcionar el producto 2 oxidado al límite. La reacción se controló por la aparición de la banda aldehídica de vibración simétrica (carbonilo) por FTIR. El alginato oxidado al límite se retículo a continuación por los grupos aldehído con dihidrazida adípica para formar hidrogeles, 3. Este procedimiento fue seguido por la desaparición de la banda de vibración simétrica a 1.735 cm^{-1}.

21

Además, los alginatos oxidados al límite se reticularon con dihidrazida adípica a varios % de alginatos p/p. El módulo de compresión de los geles resultantes se midió y se evaluó (Figura 10). La gelificación se fijó en 3% p/p de alginatos con un módulo de 200 kPa y aumentó con el porcentaje de alginato hasta alcanzar 900 kPa con un contenido de alginato de 10% p/p. El procedimiento de reticulación proporciona un amplio intervalo de control (700 kPa) sobre la resistencia mecánica de los biomateriales a base de alginato.

La resistencia mecánica de los alginatos reticulados oxidados al límite depende también de la concentración de reticulador así como del contenido en ión calcio en el gel final. El módulo de compresión aumentó con la concentración de dihidrazida adípica en el gel (Figura 11). Por ejemplo, para una hidrazida adípica 25 mM, el módulo fue de 200 kPa y aumentó hasta 100 kPa a 150 mM. No se observó ninguna diferencia a concentración superior del reticulador. Un aumento significativo de 250 kPa se observó también para el módulo de compresión a medida que la concentración en ión calcio aumentaba desde 10 mM a 30 mM (Figura 12).

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Ejemplo 18

Se aisló, se modificó y se reticuló la secuencia de poliguluronato responsable de la gelificación del alginato para formar hidrogeles, análogos al esquema mostrado en el Ejemplo 17, pero para un material no reticulado. Por lo tanto, se aisló el poliguluronato, 1, a partir de los alginatos por hidrólisis ácida siguiendo un procedimiento modificado (Haug, A.; Larsen, B.; Smidsrod, O. Acta Chem. Scand. 1966, 20, 183-190; y Haug, A.; Larsen, B.; Smidsrod, O. Acta Chem. Scand. 1967, 21, 691-704). Se caracterizó el producto por FTIR, H-RMN y ^{13}C-RMN y se correlacionó bien con las caracterizaciones indicadas (véase también Penman, A.; Sanderson, G.R. Carbohyd. Res. 1972, 25, 273-282). Se modificó el poliguluronato sódico por oxidación con peryodato sódico a temperaturas ambiente para dar el guluronato del polialdehído (PAG), 2. El grado de oxidación se controló mediante el peryodato equivalente molar utilizado en cada reacción. Se controló la reacción mediante la aparición de la banda de vibración simétrica aldehídica (carbonilo) por FTIR. Se reticuló a continuación el PAG mediante grupos aldehído con dihidrazida adípica para formar hidrogeles, 3. Este procedimiento fue seguido por la desaparición de la banda simétrica de vibración a 1.735 cm^{-1}.

Un método frecuente para la inmovilización de sondas moleculares y proteínas en los proteoglucanos es la oxidación parcial con peryodato de la parte del polisacárido del proteoglucano seguido de acoplamiento mediante la formación de una base de Schiff o el enlace hidrazona. El mismo método básico se utilizó para acoplar el reticulador bifuncional a los poliguluronatos sódicos parcialmente oxidados. Esta reticulación proporciona un nivel adicional de control, en comparación con la reticulación iónica, sobre la estabilidad mecánica y la resistencia del hidrogel en investigación.

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Ejemplo 19

Para conseguir una comprensión sobre los factores detrás de las propiedades de gelificación de determinados materiales, era esencial investigar el efecto de la variación de la concentración de polialdehído guluronato, dihidrazida adípica e iones calcio en los geles resultantes. Por consiguiente, se reticularon los geles a varias concentraciones de guluronato de polialdehído y se midió el módulo de compresión y se representó frente al % p/p de PAG (véase la Figura 13). Mientras que no se formaron hidrogeles con 4% p/p de PAG y menos, aún después de un intervalo de 48 horas, el polialdehído guluronato reticulado gelificó partiendo del 5% p/p de PAG con un módulo de compresión de 82 kPa. El módulo de compresión aumentaba a continuación a medida que el contenido en PAG en el gel final aumentaba para alcanzar 880 kPa a 10% p/p de PAG. Esto resultaba previsible ya que el número de grupos funcionales aldehídicos aumentó con el contenido de PAG en el gel. Por consiguiente, la eficacia del reticulador aumenta y produce un módulo mayor. Como resultado, la variación del % p/p de PAG en el gel final, puede proporcionar un control sobre la elasticidad así como la resistencia del gel correspondiente.

La resistencia mecánica de los geles puede aumentarse incrementando el grado de reticulación. Por consiguiente, el 6% p/p de PAG se reticuló a diferentes concentraciones de dihidrazida adípica y se evaluó el módulo de compresión. Se observó que aumentando la concentración de dihidrazida adípica se producía un aumento en el módulo de compresión del 6% p/p de PAG. Un valor óptimo de 560 kPa se obtuvo para el módulo a una concentración de 150 mM de dihidrazida adípica. A medida que aumentaba más la concentración de dihidrazida adípica, disminuía el módulo hasta 350 kPa (véase la Figura 14). Teóricamente, la eficacia de reticulación disminuiría cuando la cantidad de grupos funcionales hidrazida supere el número de aldehídos en el polímero. En otras palabras, a concentraciones altas de dihidrazida adípica, el reticulador reacciona solamente con un grupo aldehído mientras que el otro terminal no reacciona. Como resultado, el grado de reticulación funcional disminuirá aun cuando el grado de incorporación de dihidrazida adípica también haya aumentado.

En comparación con los alginatos inalterados, los glucuronatos de polialdehído reticulados también pueden controlarse por la cantidad de iones calcio presente en estos materiales. PAG (6% p/p) se reticuló con dihidrazida adípica (150 mM) a varias concentraciones de calcio y de cloruro sódico (tales como 10, 20, 40, 80 y 100 mM). El módulo de compresión de los geles resultantes aumentó al aumentar las concentraciones de calcio hasta un valor óptimo de 600 kPa a cloruro de cálcico 40 mM (véase la Figura 15), en el que el bloque blanco, \boxempty, es cloruro sódico y el bloque negro, \ding{110}, es cloruro cálcico). Por encima de esta concentración, no había diferencias estadísticas en el módulo de compresión. Esto indica que la reticulación iónica, similar a la de los alginatos, podría proporcionar otro nivel de control sobre las propiedades mecánicas de estos materiales. Para eliminar la contribución de la resistencia iónica al aumento del módulo de compresión, se reticuló también PAG en presencia de cloruro sódico a las mismas concentraciones que anteriormente. Aun cuando se observó inicialmente un ligero aumento en el módulo a medida que el contenido de iones sodio aumentaba, el valor del módulo se niveló a 390 kPa. Existía una diferencia significativa de 210 kPa entre el módulo óptimo en presencia de iones calcio y sodio. Esta diferencia en el módulo de compresión (150 kPa), demuestra claramente que la presencia de calcio contribuye de hecho a la resistencia mecánica de estos materiales.

Una aplicación potencial para estos materiales es su utilización como matrices tridimensionales para el trasplante celular como se mencionó anteriormente. Por consiguiente, para asegurar la supervivencia y proliferación de las células en estos materiales, era necesario investigar su comportamiento en la gelificación en condiciones fisiológicas (pH 7,4). Ajustando el pH de estos materiales a 7,4, se observó una ligera disminución en el módulo de compresión. Por ejemplo, a un pH de 7,4, no se formó ningún gel a 5% p/p de PAG, mientras que a un pH inferior de gelificación se situó partiendo de 5% p/p de PAG (véase la Figura 16), en el que el bloque blanco, \boxempty, está a pH 7,4, y el bloque negro, \ding{110}, está a pH <7). Además, el módulo era de 600 kPa a 10% p/p de PAG en comparación con 880 kPa para la condición del gel original. Esto era de esperar ya que es bien conocido que la reactividad de los grupos de hidrazina con aldehídos es óptima a pH inferiores. En condiciones ácidas, los aldehídos se protonizan y, por consiguiente, son más susceptibles al ataque nucleofílico por los grupos hidrazida. En condiciones neutras a básicas sin embargo, existen en efecto cinéticas más lentas y se requiere un intervalo de tiempo más prolongado para completar la reacción. Esto produce un grado inferior de reticulación que origina directamente una disminución en el modulo de compresión.

El grado de reticulación en estos materiales puede controlarse también variando el grado de oxidación de las cadenas de poliguluronato (véase Painter, T.; Larsen, B. Carbohyd. Res. 1969, 10, 186-187; Painter, T.; Larsen, B. Acta Chem. Scand. 1970, 24, 813-833; y, Ishak, M.F.; Painter, T. Acta Chem. Scand. 1971, 25, 3875-3877). Esto proporcionó otro control sobre el número de unidades aldehídicas en la cadena de poliguluronato que están disponibles para la reticulación. Como resultado, se oxidó el poliguluronato utilizando varias cantidades de peryodato sódico y se reticuló al 10% p/p de PAG con dihidrazida adípica a la concentración óptima de 150 mM en placas de 24 pocillos. Todos los materiales gelificaron, partiendo al 20% de oxidación teórica con un módulo de compresión de 500 kPa (véase la Figura 17). El módulo aumentó con el porcentaje de oxidación de poliguluronato para alcanzar un valor máximo de 1.000 kPa a una oxidación teórica del 100%. Estos resultados indican claramente que podría conseguirse un amplio intervalo de estabilidad mecánica variando el grado de oxidación de los poliguluronatos. Mientras que el PAG oxidado al 20% reticulado presentaba geles débiles comparables con los alginatos, el PAG oxidado al 80% y por encima era rígido y quebradizo con módulos de compresión elevados. Estas características son muy deseables en los biomateriales del procedimiento para la inmovilización celular y también como sistemas de administración de fármacos. Dependiendo del grado de oxidación del polímero, pueden proporcionarse dispositivos con tamaños de poro específico y resistencia mecánica para administrar células o fármacos terapéuticos en el punto de implantación.

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Ejemplo 20

Una cuestión crítica, desde el punto de vista del trasplante de células, es si las células presentes en los monómeros no reticulados estarán dañadas por la reacción de reticulación. Las células de músculo liso (procedentes de la aorta de rata) se colocaron en una solución de PAG, y a continuación la reticulación mediante la adición de dihidrazida de ácido adípico. La incorporación de células de músculo liso dentro de los geles fue aproximadamente del 100%, y el número de células y la actividad metabólica de las células se mantuvo durante los 7 días del experimento. Estos resultados indican que las células pueden trasplantarse en los materiales reticulados con esta química (los polímeros PAA también utilizan alguna reticulación). Los autores no esperaban que las células proliferasen en estas matrices, ya que no contienen ligandos de adhesión celular, y los autores no observaron ninguna proliferación. Los péptidos que contienen RGD y otros de adhesión celular pueden acoplarse fácilmente a estos polímeros descritos anteriormente para aumentar la interacción celular. Se han conseguido eficacias de acoplamiento de aproximadamente 70% utilizando la química de acoplamiento optimizada para el alginato.

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Ejemplo 21

Se investigó asimismo la idoneidad de estos polímeros como vehículo de administración de factores angiógenos. Se mezcló VEGF con el PAG, y a continuación se reticuló el PAG. Se controló la liberación de VEGF añadiendo cantidades en trazas de ^{125}I-VEGF. Se reticuló el PAG (20% p/p) con hidrazida de ácido adípico que contenía VEGF marcado con ^{125}I en presencia de cloruro cálcico y la mezcla se dejó gelificar durante una hora y a continuación se incubó a 37ºC en medio DMEM. Se sustituyó el medio por medio reciente y se hizo recuento de su radioactividad. Se observó poca o ninguna liberación repentina de VEGF en alguna de las condiciones experimentales (véase Fig. 18), en las que el bloque blanco, \boxempty, es con heparina, y el bloque negro, \ding{110}, es sin heparina). En presencia de heparina, se liberó VEGF a una velocidad del 7% total incorporado de factor de crecimiento/día durante 5 días, a continuación una liberación más lenta del 2%/día para los próximos 14 días. En ausencia de heparina, se observó una liberación inicial mayor de 9%/día durante 5 días, seguido otra vez de una liberación menor de 2%/día durante los siguientes 14 días.

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Ejemplo 22

Se reticuló también el guluronato de polialdehído con dihidrazida adípica en ausencia de cloruro cálcico a un 10% p/p de PAG. Se observó una liberación menor de ^{125}I-VEGF de estos materiales en ambos casos, con y sin heparina. En presencia de heparina, se liberó inicialmente VEGF a una velocidad del 4%/día durante 5 días, seguido de una liberación menor a una velocidad de 0,2%/día durante 14 días (véase Fig. 19), en la que el bloque blanco, \boxempty, es con heparina y el bloque negro, \ding{110}, es sin heparina). En ausencia de heparina, se liberó VEGF a un ritmo de 6%/día durante cinco días, seguido de 0,8%/día durante los próximos 14 días. Estos experimentos sugieren que es posible controlar la velocidad a la que se libera el VEGF de estos materiales controlando la presencia de calcio y heparina. Los autores prevén que la liberación dependerá mucho de la concentración de PAG y de la densidad de reticulación a medida que estas variables regulen el tamaño del poro en el hidrogel. Es posible conseguir velocidades de liberación a lo largo de un intervalo muy amplio alterando estas variables.

Ejemplo 23

Un ligando de adhesión celular, GRGDY, se acopló al poli(guluronato) sódico y se utilizó PAG con este mismo tipo de química de EDC para acoplarse al alginato. Para controlar el grado de acoplamiento, se mezcló ^{125}I-GRGDY en trazas con el péptido de adhesión y la mezcla se dializó frente a agua destilada dos veces. Se hizo el recuento en el dializado en un contador de centelleo líquido para determinar la cantidad de material reactivo presente. En ausencia de EDC, solamente el 1,5% de GRGDY estaba presente en el poli(guluronato) sódico, mientras que, en presencia de EDC, se incorporó el 61% de péptido (véase la Figura 20). En el material PAG, se incorporó 55% de GRGDY con EDC en comparación con el 24% en ausencia de EDC.

Se utilizó también la química diferente para acoplar este ligando a PAG. Este método utiliza el acoplamiento con aminación reductora de los grupos funcionales amino en el terminal de péptido y el grupo aldehídico abundante en el material PAG. Esencialmente, la amina reaccionó con el aldehído para formar un enlace débil de imina que se redujo utilizando cianoborohidruro sódico (NaCNBH_{3}) para formar un enlace amina estable. El grado de incorporación del péptido en el material de PAG fue del 65%. El enlace imina entre el terminal amino del péptido y el grupo aldehído de PAG formado con esta reacción es probablemente también el que se forma cuando se utiliza la química de EDC para acoplar al péptido. Esta reacción liga alguno de los péptidos y les impide reaccionar con los grupos de ácido carboxílico activados, por consiguiente, produciendo un grado inferior de incorporación del péptido (55%). Esta misma reacción explica esencialmente la razón subyacente a la incorporación del péptido en ausencia de cualquier aditivo (24%).

Esta nueva química de acoplamiento puede utilizarse también para unir químicamente otros péptidos y proteínas (por ejemplo, factores de crecimiento) o fármacos para PAG y alginatos oxidados al límite. Resulta importante, que esta reacción produce la formación de un enlace débil que se degradará y liberará la molécula unida. Esto permitirá que los fármacos se liberen lentamente de las matrices, y esta liberación será controlada por vía química, controlada por difusión o controlada por ambos procesos. El enlace puede reducirse fácilmente utilizando cianoborohidruro sódico para dar un enlace muy estable si se desea que la molécula unida quede unida (por ejemplo ligando de adhesión celular). Cualquier factor de crecimiento que tenga grupos amino pendientes puede acoplarse con esta reacción. Los productos farmacéuticos que podrían utilizarse potencialmente tendrán grupos amino disponibles en la formación del enlace imina según el esquema siguiente, por ejemplo. Además el grupo amina, las hormonas de crecimiento y los fármacos podrían modificarse para incorporar hidrazinas libres, hidrazidas o grupos semicarbazidas que pueden formar enlaces de hidrazona o semicarbazona respectivamente. Esto permitirá una liberación diferente del fármaco o de la hormona y por consiguiente proporciona otro nivel de control sobre la velocidad de liberación.

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Incorporación de VEGF en alginatos oxidados al límite y matrices de PAG.

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Ejemplo 24

Reticuladores de PEG hidrazida. El PAG puede reticularse con dihidrazida de ácido adípico. Los reticuladores de dihidrazida pueden sintetizarse con varias longitudes partiendo de un núcleo de polietilenglicol. El poli(etilenglicol), PEG, con pesos moleculares de 200, 400, 1.000 y 3.400 puede hacerse reaccionar con anhídrido succínico en presencia de N,N-dimetilamino piridina para formar poli(etilenglicol disuccinato).

23

Los enlaces éster formados entre el núcleo de PEG y los grupos succinato son biodegradables. La hidrazina, puede acoplarse a continuación a los terminales de estos polímeros utilizando la química DCC para dar dihidrazidas de polietilenglicol. Partiendo de los PEG con diferentes pesos moleculares, puede sintetizarse reticuladores de dihidrazida con varias longitudes de cadena. Estos polímeros pueden utilizarse para reticular poli(aldehído)guluronatos), PAG.

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Ejemplo 25

Para conseguir más control sobre la degradabilidad de los materiales de PAG, se proporciona un procedimiento para sintetizar reticuladores con núcleos no degradables. El PEG reaccionante con diferentes pesos moleculares con cloroacetatos de metilo formará di-carboximetil-PEG que a continuación se acoplará a la hidrazina en ambos terminales para dar la dihidrazida de PEG.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Estas dihidrazidas tienen un núcleo no degradable con enlaces éter. Como anteriormente, controlar los pesos moleculares de los polímeros PEG de partida proporcionará dihidrazidas de PEG con varias longitudes de cadena.

Estas dihidrazidas pueden utilizarse para reticular PAG y formar materiales solamente con un enlace degradable que es el enlace hidrazona. Este enlace puede estabilizarse más mediante reducción con borohidruro para proporcionar materiales no degradables. Por consiguiente, los polímeros de PAG pueden reticularse con dihidrazidas para formar materiales no degradables, materiales con enlaces degradables de hidrazona o materiales con enlaces de hidrazona y éster los cuales son degradables. Este método proporcionará materiales con varias velocidades de degradación. Además, seleccionando la longitud apropiada de polímeros PEG utilizados, pueden controlarse las propiedades mecánicas del biomaterial reticulado resultante.

Ejemplo 26

Un poliguluronato fotopolimerizable puede sintetizarse a partir de monómeros de hidrazido acrilato acoplado a poliguluronato con bloque G por el terminal aldehídico. Estos materiales pueden inyectarse a continuación en un punto deseado y polimerizarse fotoquímicamente para formar hidrogeles. El hidrazido acrilato puede sintetizarse partiendo de cloruro de acriloílo de t-butilcarbazato para formar el hidrazido acrilato protegido.

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La desprotección utilizando ácido trifluoroacético, TFA, proporcionará el monómero deseado. Esta metodología proporciona un medio de administrar el bloque G en el punto deseado y polimerizarlo después mediante fotopolimerización fotoinducida por radicales libres. La hidrazida reacciona con los aldehídos como en el caso de PAG. En este ejemplo, las hidrazidas reaccionan con el terminal hemiacetal del bloque G para formar un terminal acrílico de hidrazona en la cadena del bloque G. Los hidrazido acrilatos se seleccionaron debido a la facilidad de incorporar estos grupos funcionales en los bloques G.

Estos materiales podrían prepolimerizarse en la forma deseada y utilizarse como matrices tridimensionales para el trasplante de células o alternativamente mezclarse con las células e inyectarse como soluciones en el punto de implantación. La polimerización fotoinducida por radicales libres de los grupos acrilato proporcionaría entonces un eje central no degradable.

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Estos monómeros pueden copolimerizarse con ácido acrílico, acrilamida, MMA, HEMA HPMA, alil amina, dimetilalil amina u otros monómeros con funcionalidad similar. El grado de incorporación del bloque G puede controlarse variando los porcentajes de comonómero utilizado.

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Ejemplo 27

La copolimerización de hidrazido acrilatos con bloque G con monómeros de cloruro de dialildimetil amonio y cloruro de alil dimetilamonio en soluciones acuosas utilizando persulfato amónico como iniciador proporciona el bloque G incorporado en polímeros con varias estructuras rígidas del eje central.

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La unidad de pirrolidina formada después de la polimerización restringe la movilidad del polímero debido a su estructura cíclica y hace más rígido al eje central. La rigidez del eje central se controla a continuación mediante el porcentaje de unidades de cloruro de dialildimetil amonio incorporadas.

Otro método para la síntesis de estos polímeros consiste en prepolimerizar hidrazido acrilatos con monómeros de cloruro de dialildimetil amonio y de cloruro de alildimetilamonio.

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La polimerización se realiza utilizando persulfato amónico en soluciones acuosas. Después, el bloque G se acopla a los grupos hidrazido para formar enlaces de hidrazona degradables. El enlace de hidrazona puede reducirse a continuación con cianoborohidruro sódico para formar los enlaces de hidrazida más estables.

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Ejemplo 28

Un método corriente para controlar la resistencia mecánica de los poliacrilatos y derivados consiste en reticular estos polímeros con reticuladores a base de acrilato (Naghash et al., Polymer, 1187-1196, 1997; Dietzand y Peppas, Polymer, 3767-3781, 1997). El dimetacrilato de etilenglicol, el dimetacrilato de hexaetilenglicol y otros reticuladores bifuncionales y multifuncionales pueden reticular monómeros de hidrazido acrilato con bloque G.

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De nuevo, controlando el porcentaje de reticulador en el producto final, los autores pueden controlar las propiedades mecánicas de los polímeros resultantes.

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Ejemplo 29

Pueden proporcionarse polímeros dendríticos por acoplamiento del bloque G a polímeros dendríticos de PEG-lisina. Es bien sabido que el terminal hemiacetal de los monosacáridos y polisacáridos está en equilibrio con la forma abierta de aldehído.

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Además, la reacción de las aminas con los aldehídos está también en equilibrio. En presencia de cianoborohidruro sódico el enlace imina formado entre la amina y el aldehído se reduce lo que desplaza el equilibrio para formar más aldehídos y dirige la reacción a la terminación. Este proceso es lento, sin embargo, y se necesita un procedimiento más rápido y más eficaz para acoplar el bloque G a diferentes polímeros. De este modo, pueden utilizarse grupos funcionales de hidrazida para conseguir este acoplamiento. Las hidrazinas, hidrazidas y semicarbazidas reaccionan con los aldehídos para formar enlaces pseudoimina. Este procedimiento no depende de la presencia de borohidruros. Los restos de hidrazida son más nucleófilos que las aminas y pueden atacar centros electrófilos como los grupos carbonilo mucho más rápidamente. Además, opcionalmente podría utilizarse cianoborohidruro sódico después para producir estabilidad en el enlace de hidrazona o de semicarbazona.

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Ejemplo 30

Pueden sintetizarse dendrímeros con grupos funcionales reactivos en los terminales para el acoplamiento del bloque G utilizando un procedimiento similar al utilizado para los dendrímeros de lisina y los grupos terminales modificados para terminales de semicarbazida.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Como anteriormente, se empieza con polietilenglicol, PEG, y se acopla a (Boc)_{2}-lisina mediante la química de DCC, y se desprotege con ácido trifluoroacético, TFA, para formar dilisinato de PEG. Al dejar que el dilisinato de PEG reaccione con exceso de diisocianato de alquilo proporcionará polímeros con un grupo isocianato en los terminales. Haciendo reaccionar los grupos isocianato con hidrazina proporcionará finalmente el dendrímero modificado con cuatro grupos semicarbazida disponibles para acoplar el bloque G. La misma metodología puede utilizarse esencialmente para sintetizar el hexalisinato de PEG, el octalisinato de PEG y así sucesivamente.

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Ejemplo 31

Polímeros peine. Se han incorporado con éxito monosacáridos y oligosacáridos en el eje central de poliacrilamidas (Calstrom y Bednarski, MRS Bulletin: 54-59, 1992). Pueden utilizarse metodologías similares para incorporar el bloque G dentro del eje central de varios polímeros sintéticos. Se siguen tres metodologías para la síntesis de nuevos biomateriales. La primera es utilizando un eje central de poli(vinil alcohol) con grupos funcionales hidrazido en el que las cadenas del bloque G están acopladas. El segundo procedimiento utiliza ejes centrales de poli(alilamina) que están también modificados para incorporar grupos hidrazido reactivos para el acoplamiento del bloque G. Estos ejes centrales se seleccionan debido a que son biocompatibles y se excretan fácilmente por el riñón con pesos moleculares de 10.000 o inferiores. El tercer método implica el acoplamiento de poliguluronato a polialdehído guluronato. Esto dará como resultado la formación de un polímero compuesto totalmente por moléculas derivadas de alginato.

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Materiales a base de PVA

El poli(vinil alcohol), PVA, de peso molecular bajo puede modificarse mediante la reacción con el anhídrido succínico y la presencia de N,N-dimetil aminopiridina, DMAP, para proporcionar el compuesto intermedio poli(vinilsuccinato).

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El enlace éster formado de este modo entre PVA y el grupo succinato es un enlace biodegradable susceptible de escisiones enzimáticas en sistemas biológicas. La hidrazina, puede entonces acoplarse a este compuesto intermedio por acoplamiento DCC para formar poli(vinilhidrazido succinato). Por consiguiente, el grado de incorporación de la hidrazida puede controlarse en el producto final controlando el número de moléculas de anhídrido succínico utilizadas en la reacción anterior. El control sobre el grado de incorporación de la hidrazida es crucial ya que esto dictará el grado de incorporación del grado G en la etapa siguiente.

Otros grupos de hidrazida que pueden incorporarse en el eje central de PVA son la oxalil dihidrazida (n=0), la dihidrazida malónica (n=1), la dihidrazida succínica (n=2), la dihidrazida adípica (n=4), la dihidrazida numérica (n=6) y otras. Estas dihidrazidas proporcionarán varias longitudes para las ramas del espaciador que deben incorporarse entre el eje central de PVA y las cadenas del bloque G.

Debido a la reactividad de las hidrazidas para con los grupos aldehídicos, el mismo método puede utilizarse para acoplar las cadenas del bloque G a este polímero por el terminal hemiacetal. Esto proporciona un polímero con eje central sintético en el que el bloque G está unido mediante un enlace degradable.

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este enlace puede estabilizarse más por reducción con cianoborohidruro sódico. El grado de incorporación del bloque G en el material final presentará una relación directa con las propiedades de gelificación así como la resistencia del hidrogel formado.

Materiales a base de poli(alilamina)

Un método similar debe utilizarse para la modificación de la poli(alilamina) haciéndolo reaccionar con el anhídrido succínico seguido de incorporación de hidrazida utilizando la química de la carbodiimida para formar poli(N-alilsuccinamidohidrazidas).

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Como en el ejemplo anterior, los grupos hidrazido reactivos proporcionan un medio para unir el bloque G al eje central del polímero mediante el terminal hemiacetal. En contraste con los materiales a base de PVA, el enlace amida formado entre la poli(alilamina) y el grupo succinato es un enlace no degradable.

El acoplamiento de los bloques G a ambos ejes centrales del polímero formará enlaces biodegradables en forma de hidrazonas.

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Estos enlaces pueden reducirse más con cianoborohidruro sódico para formar un enlace de hidrazina más estable que no es degradable. Por consiguiente es posible adaptar biomateriales con velocidades variables de degradación dependiendo de la metodología de síntesis seguida.

Polímeros peine a base de PAG

Se dejó reaccionar el polialdehído guluronato, PAG, con hidrazina y borohidruro sódico para proporcionar el derivado de polihidrazino guluronato. Se utilizan grupos de hidrazina en este polímero derivado de alginato para incorporar cadenas con bloque G por sus terminales hemiacetal.

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Esto proporcionará materiales biocompatibles y biodegradables procedentes de polisacáridos naturales derivados con enlaces hidrazona hidrolizables. La hidrólisis del enlace de hidrazona en estos materiales conducirá a polisacáridos de cadena corta que pueden ser excretados por el riñón. Además, la reducción del enlace hidrazona por borohidruros puede formar un enlace hidrazina químicamente estable que proporciona materiales no degradables. Esto proporcionará de nuevo biomateriales tanto biodegradables como no degradables derivados de polisacáridos naturales.

Los ejemplos anteriores pueden repetirse con éxito similar sustituyendo los reactivos descritos genérica o específicamente y/o actuando en las condiciones de la presente invención para los utilizados en los ejemplos anteriores.

Claims (12)

1. Solución inyectable o gel para la formación de matrices de trasplante de células que comprende un alginato modificado que comprende por lo menos una sección de cadena de alginato a la que está unida de manera covalente por lo menos una molécula útil para la adhesión celular, en los que la molécula es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), GREDVY, YIGSR o REDV; y que comprende además células viables para dicho trasplante.

2. Solución o gel según la reivindicación 1, en los que la molécula útil para la adhesión celular contiene la secuencia de aminoácidos arginina-glicina-ácido aspártico (RGD).

3. Solución o gel según la reivindicación 1 ó 2, en los que la molécula útil para la adhesión celular está unida mediante un resto de ácido urónico a la sección de cadena de alginato.

4. Solución o gel según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en los que la sección de cadena de alginato presenta un peso molecular inferior a 50.000.

5. Solución o gel según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en los que la sección de la cadena de alginato presenta un peso molecular inferior a 30.000.

6. Solución o gel según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en los que la sección de cadena de alginato presenta un peso molecular de 100.000 o superior.

7. Matriz de trasplante que comprende un hidrogel de un alginato modificado que comprende por lo menos una sección de cadena de alginato a la que está unida de manera covalente por lo menos una molécula útil para la adhesión celular, en los que la molécula es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), GREDVY, YIGSR o REDV; y que comprende además células viables para dicho trasplante.

8. Matriz según la reivindicación 7, en la que la molécula útil para la adhesión celular contiene la secuencia de aminoácidos arginina-glicina-ácido aspártico (RGD).

9. Matriz según la reivindicación 7 u 8, en la que la molécula útil para la adhesión celular está unida mediante un resto de ácido urónico en la sección de cadena de alginato.

10. Matriz según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que la sección de cadena de alginato presenta un peso molecular inferior a aproximadamente 50.000.

11. Matriz según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que la sección de cadena de alginato presenta un peso molecular inferior a 30.000.

12. Matriz según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que la sección de cadena de alginato presenta un peso molecular de 100.000 o superior.