JPH0581A - 細胞培養担体及び培養方法 - Google Patents
細胞培養担体及び培養方法Info
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- JPH0581A JPH0581A JP3175771A JP17577191A JPH0581A JP H0581 A JPH0581 A JP H0581A JP 3175771 A JP3175771 A JP 3175771A JP 17577191 A JP17577191 A JP 17577191A JP H0581 A JPH0581 A JP H0581A
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- bead
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- carrier
- beads
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Abstract
(57)【要約】
【目的】カラム内に静置させて長期間培養するのに適し
た新規な細胞培養担体に関する。 【構成】粒状のアルギン酸塩よりなるビ−ズ表面にコラ
−ゲンからなる被覆層を設けた細胞担体である。
た新規な細胞培養担体に関する。 【構成】粒状のアルギン酸塩よりなるビ−ズ表面にコラ
−ゲンからなる被覆層を設けた細胞担体である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、付着細胞を培養する際
に使用される細胞培養担体に関し、特に長期間安定に細
胞を保持できる培養系を確立できる培養担体に関する。
に使用される細胞培養担体に関し、特に長期間安定に細
胞を保持できる培養系を確立できる培養担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学の技術を駆使した生理活性物
質の生産は、大腸菌や酵母などの微生物を利用して行な
われている。しかし、微生物を用いて生産したタンパク
性の生理活性物質は、糖鎖の付加や部分的アミノ酸の除
去などの動物細胞に特有な反応を受けておらず、その立
体構造が目的とするものと僅かに異なり生理活性も低い
場合がある。そのため、遺伝子操作をした動物細胞を大
量に培養し、培養液中に産生された生理活性物質を取り
出して精製する手法が採られている。
質の生産は、大腸菌や酵母などの微生物を利用して行な
われている。しかし、微生物を用いて生産したタンパク
性の生理活性物質は、糖鎖の付加や部分的アミノ酸の除
去などの動物細胞に特有な反応を受けておらず、その立
体構造が目的とするものと僅かに異なり生理活性も低い
場合がある。そのため、遺伝子操作をした動物細胞を大
量に培養し、培養液中に産生された生理活性物質を取り
出して精製する手法が採られている。
【０００３】動物細胞は培養液中に浮遊して増殖する浮
遊細胞と固い支持体に接着してはじめて増殖できる付着
細胞とに大分できる。浮遊細胞は一般にタンク培養が行
なわれるが、付着細胞の場合には細胞を何らかの支持担
体に付着させ、細胞を付着させた支持担体を浮遊化培養
する必要がある。この培養方法はマイクロキャリヤ−法
と称され、マイクロキャリヤ−法における支持体（マイ
クロキャリア）としては架橋デキストラン、セルロ−ス
顆粒体などの天然物由来の素材を使用したビ−ズ或いは
（メタ）アクリル酸エステルよりなる重合体粒子表面に
正に荷電し得る化学的残基又は蛋白質を化学結合したマ
イクロキャリア（特開昭６３−７１１７３号公報参照）
等がある。
遊細胞と固い支持体に接着してはじめて増殖できる付着
細胞とに大分できる。浮遊細胞は一般にタンク培養が行
なわれるが、付着細胞の場合には細胞を何らかの支持担
体に付着させ、細胞を付着させた支持担体を浮遊化培養
する必要がある。この培養方法はマイクロキャリヤ−法
と称され、マイクロキャリヤ−法における支持体（マイ
クロキャリア）としては架橋デキストラン、セルロ−ス
顆粒体などの天然物由来の素材を使用したビ−ズ或いは
（メタ）アクリル酸エステルよりなる重合体粒子表面に
正に荷電し得る化学的残基又は蛋白質を化学結合したマ
イクロキャリア（特開昭６３−７１１７３号公報参照）
等がある。
【０００４】しかして、天然物由来の素材からなるビ−
ズは非常に高価であり、その点（メタ）アクリル酸エス
テル重合体を使用したマイクロキャリアは有利ではある
がキャリア内部から養分を供給できないという欠点があ
った。また、これらのビ−ズを使用したマイクロキャリ
ヤ−法にあってはビ−ズに付着した細胞は培地中で浮遊
させて撹拌するためビ−ズに付着した細胞が機械的なダ
メ−ジを受けるという問題がある。
ズは非常に高価であり、その点（メタ）アクリル酸エス
テル重合体を使用したマイクロキャリアは有利ではある
がキャリア内部から養分を供給できないという欠点があ
った。また、これらのビ−ズを使用したマイクロキャリ
ヤ−法にあってはビ−ズに付着した細胞は培地中で浮遊
させて撹拌するためビ−ズに付着した細胞が機械的なダ
メ−ジを受けるという問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
点を解決すべく種々検討した結果、本発明を完成したも
ので、本発明の目的はカラム内に静置させて、長期間培
養するのに適した新規な細胞培養担体を提供するにあ
る。
点を解決すべく種々検討した結果、本発明を完成したも
ので、本発明の目的はカラム内に静置させて、長期間培
養するのに適した新規な細胞培養担体を提供するにあ
る。
【０００６】
【問題点を解決するための手段】本願発明の要旨は直径
１〜５ｍｍの粒状のアルギン酸塩よりなるビ−ズ表面に
コラ−ゲンよりなる被覆層を設けたことを特徴とする細
胞培養担体であり、該細胞培養担体に細胞を付着、これ
をカラム中に充填し、該カラムに培地を供給して細胞を
培養する方法である。
１〜５ｍｍの粒状のアルギン酸塩よりなるビ−ズ表面に
コラ−ゲンよりなる被覆層を設けたことを特徴とする細
胞培養担体であり、該細胞培養担体に細胞を付着、これ
をカラム中に充填し、該カラムに培地を供給して細胞を
培養する方法である。
【０００７】すなわち、本発明においては、細胞培養担
体を構成する母体としてアルギン酸塩を使用するもので
あり、該塩を使用することによって高含水性のビ−ズを
作製することができ、担体内部からも養分の供給が可能
となり、また、このビ−ズは、従来のものに比して、そ
の大きさが大きく、この担体に細胞を付着後これをカラ
ム内に充填した状態でも定期的に培地を交換することに
よって細胞を長期間安定に生存させることが可能となっ
た。
体を構成する母体としてアルギン酸塩を使用するもので
あり、該塩を使用することによって高含水性のビ−ズを
作製することができ、担体内部からも養分の供給が可能
となり、また、このビ−ズは、従来のものに比して、そ
の大きさが大きく、この担体に細胞を付着後これをカラ
ム内に充填した状態でも定期的に培地を交換することに
よって細胞を長期間安定に生存させることが可能となっ
た。
【０００８】更に本発明を詳細に述べる。本発明におけ
るアルギン酸塩は高含水性ゲルであり、その塩としては
カルシウム塩、ストロンチウム塩等のアルカリ土類金属
塩である。そして、このアルギン酸塩の実質重量は全体
の約１％程度であって、残余の約９９％は培地が含有さ
れた状態である。このビ−ズの平均粒径は含水状態で１
〜５ｍｍ範囲であり、特に好ましい平均粒径は約３ｍｍ
である。
るアルギン酸塩は高含水性ゲルであり、その塩としては
カルシウム塩、ストロンチウム塩等のアルカリ土類金属
塩である。そして、このアルギン酸塩の実質重量は全体
の約１％程度であって、残余の約９９％は培地が含有さ
れた状態である。このビ−ズの平均粒径は含水状態で１
〜５ｍｍ範囲であり、特に好ましい平均粒径は約３ｍｍ
である。
【０００９】コラ−ゲンは動物の結合組織を構成してい
るタンパク質であり不溶性であるが、特に本発明で使用
するのに好ましいコラ−ゲンとしては、その分子末端に
存在し抗原性を発揮するテロペプチドをペプシンで処理
して得られるアテロコラ−ゲンである。また、本願発明
においては可溶化コラ−ゲンより誘導されるもの、例え
ばサクシニル化コラ−ゲン、メチル化コラ−ゲン等も使
用できる。
るタンパク質であり不溶性であるが、特に本発明で使用
するのに好ましいコラ−ゲンとしては、その分子末端に
存在し抗原性を発揮するテロペプチドをペプシンで処理
して得られるアテロコラ−ゲンである。また、本願発明
においては可溶化コラ−ゲンより誘導されるもの、例え
ばサクシニル化コラ−ゲン、メチル化コラ−ゲン等も使
用できる。
【００１０】本発明にかかる細胞培養担体の製造方法の
一例について示す。アルギン酸金属塩よりなるビ−ズの
製造法としては、水溶性アルギン酸金属塩を注射針など
を用いて粒子状にして塩化カルシウム等の水溶液中に滴
下する。この場合水溶性アルギン酸金属塩水溶液の濃度
としては１〜２％、好ましくは１％程度であって濃度が
高い場合は粘度が高く注射針から細かな粒子状として滴
下することが困難であり、また濃度が低い場合には十分
な強度を保持できるビ−ズが得られない。また、このビ
−ズ表面にコラ−ゲン被膜層を設ける方法は、特に限定
されるものではないが、アルギン酸塩よりなるビ−ズが
高含水状態にあるため被膜層は設けにくい。しかし、例
えばエポキシ化合物を用いて分子間結合させることによ
って容易に被覆層を形成することができる。得られた細
胞培養担体は約７０％エタノ−ル中で保存するか、或い
は、Ｈａｎｋ'ｓ液に浸漬した状態でガンマ線を照射し
て滅菌して保存する。
一例について示す。アルギン酸金属塩よりなるビ−ズの
製造法としては、水溶性アルギン酸金属塩を注射針など
を用いて粒子状にして塩化カルシウム等の水溶液中に滴
下する。この場合水溶性アルギン酸金属塩水溶液の濃度
としては１〜２％、好ましくは１％程度であって濃度が
高い場合は粘度が高く注射針から細かな粒子状として滴
下することが困難であり、また濃度が低い場合には十分
な強度を保持できるビ−ズが得られない。また、このビ
−ズ表面にコラ−ゲン被膜層を設ける方法は、特に限定
されるものではないが、アルギン酸塩よりなるビ−ズが
高含水状態にあるため被膜層は設けにくい。しかし、例
えばエポキシ化合物を用いて分子間結合させることによ
って容易に被覆層を形成することができる。得られた細
胞培養担体は約７０％エタノ−ル中で保存するか、或い
は、Ｈａｎｋ'ｓ液に浸漬した状態でガンマ線を照射し
て滅菌して保存する。
【００１１】次にこの細胞培養担体を用いた培養方法に
ついて説明する。本発明にかかる細胞培養担体は、培地
中に浮遊させて培養するマイクロキャリヤ−法における
ビ−ズとして使用することも出来るが、特にカラム内に
静置させて培養することができる。即ち、約７０％エタ
ノ−ル中で保存してあるビ−ズを使用前にＨａｎｋ'ｓ
液で充分リンスするか、或いは、Ｈａｎｋ'ｓ液に浸漬
した状態でガンマ線を照射して滅菌を行ったのち、培地
に置換し、ビ−ズ表面に細胞を付着させた後、カラムに
充填する。カラム内には培地を流すと、培地はビ−ズ内
をも流動することができる。その結果、ビ−ズ表面に接
着した細胞はビ−ズ内部からも培地中の養分が供給され
長期間安定に生存できる。この培養法はマイクロキャリ
ヤ−法のような培地中で撹拌することがないので、細胞
がダメ−ジを受けることが少ない。
ついて説明する。本発明にかかる細胞培養担体は、培地
中に浮遊させて培養するマイクロキャリヤ−法における
ビ−ズとして使用することも出来るが、特にカラム内に
静置させて培養することができる。即ち、約７０％エタ
ノ−ル中で保存してあるビ−ズを使用前にＨａｎｋ'ｓ
液で充分リンスするか、或いは、Ｈａｎｋ'ｓ液に浸漬
した状態でガンマ線を照射して滅菌を行ったのち、培地
に置換し、ビ−ズ表面に細胞を付着させた後、カラムに
充填する。カラム内には培地を流すと、培地はビ−ズ内
をも流動することができる。その結果、ビ−ズ表面に接
着した細胞はビ−ズ内部からも培地中の養分が供給され
長期間安定に生存できる。この培養法はマイクロキャリ
ヤ−法のような培地中で撹拌することがないので、細胞
がダメ−ジを受けることが少ない。
【００１２】図面について説明する。図１は、本発明の
細胞培養担体（ビ−ズ）の説明図であり、図２は、これ
をカラムに充填した培養方法の説明図である。図１にお
いて、アルギン酸塩１よりなるビ−ズ２の表面のコラ−
ゲン被覆層に細胞３が付着している。ビ−ズ２は、高含
水ゲルの状態であって、培地はビ−ズ内を自由に流動す
ることが出来る。図面の矢印はその状態を示す。図２お
いて、細胞３を付着したビ−ズ２をカラム４の中に充填
し、培地を一方の口５より注入し、他方の口６より注出
する。注出口６には弁７を設けてカラム中を流れる培地
の量をコントロ−ルすることができる。
細胞培養担体（ビ−ズ）の説明図であり、図２は、これ
をカラムに充填した培養方法の説明図である。図１にお
いて、アルギン酸塩１よりなるビ−ズ２の表面のコラ−
ゲン被覆層に細胞３が付着している。ビ−ズ２は、高含
水ゲルの状態であって、培地はビ−ズ内を自由に流動す
ることが出来る。図面の矢印はその状態を示す。図２お
いて、細胞３を付着したビ−ズ２をカラム４の中に充填
し、培地を一方の口５より注入し、他方の口６より注出
する。注出口６には弁７を設けてカラム中を流れる培地
の量をコントロ−ルすることができる。
【００１３】
【実施例】次に実施例をもって本発明を説明する。
実施例１
ビ−ズの製造法
１％アルギン酸ナトリウム水溶液を注射器を使用して、
０．５％の塩化カルシウム水に撹拌しながら注射器を使
用して滴下して粒径３ｍｍ程度のアルギン酸カルシウム
よりなるビ−ズを作製した。過剰なカルシウムを除去す
るためイオン交換水で充分に洗滌した後、ビ−ズ表面の
水を除去後、ｐＨ４に調整した１％アテロコラ−ゲン水
溶液に浸漬し、適量のアテロコラ−ゲン水溶液がビ−ズ
表面に付着した状態で離型紙にのせ、室温で３時間放置
して表面を乾燥させた後、メタノ−ル中にビ−ズを移し
て撹拌した。
０．５％の塩化カルシウム水に撹拌しながら注射器を使
用して滴下して粒径３ｍｍ程度のアルギン酸カルシウム
よりなるビ−ズを作製した。過剰なカルシウムを除去す
るためイオン交換水で充分に洗滌した後、ビ−ズ表面の
水を除去後、ｐＨ４に調整した１％アテロコラ−ゲン水
溶液に浸漬し、適量のアテロコラ−ゲン水溶液がビ−ズ
表面に付着した状態で離型紙にのせ、室温で３時間放置
して表面を乾燥させた後、メタノ−ル中にビ−ズを移し
て撹拌した。
【００１４】得られたビ−ズをｐＨ１０に調整した１％
の水溶性エポキシ化合物（ＥＸ３１３）に一昼夜浸漬し
て架橋を導入した。ビ−ズ表面のアテロコラ−ゲンより
なる被覆層を均一にするために上述の操作を繰返して行
い被覆層を設けた。次いでこのビ−ズをイオン交換水で
充分洗浄した後、７０％エタノ−ル中で保存した。得ら
れたビ−ズの平均粒径は３．０１ｍｍであった。続いて
このビ−ズを用いて細胞培養試験を行った。
の水溶性エポキシ化合物（ＥＸ３１３）に一昼夜浸漬し
て架橋を導入した。ビ−ズ表面のアテロコラ−ゲンより
なる被覆層を均一にするために上述の操作を繰返して行
い被覆層を設けた。次いでこのビ−ズをイオン交換水で
充分洗浄した後、７０％エタノ−ル中で保存した。得ら
れたビ−ズの平均粒径は３．０１ｍｍであった。続いて
このビ−ズを用いて細胞培養試験を行った。
【００１５】細胞培養試験
７０％エタノ−ル中で保存してある上記のビ−ズをオ−
トクレ−ブで滅菌した蒸留水で充分洗滌した後、Ｈａｎ
ｋ’ｓ液で置換し、更にＤＭＥＭ液に一昼夜浸漬した。
培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）で置換したビ−ズ２０
ｍｌ相当を５０ｍｌのプラスチック遠心管に移し細胞懸
濁液を添加し、更に培地を添加して４５ｍｌに調整した
後、遠心管を室温で３時間ゆっくりと回転させ、浮遊し
ている細胞をビ−ズに接着させた。そして、その後３７
℃、５％ＣＯ2のインキュベ−タ内で培養した。
トクレ−ブで滅菌した蒸留水で充分洗滌した後、Ｈａｎ
ｋ’ｓ液で置換し、更にＤＭＥＭ液に一昼夜浸漬した。
培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）で置換したビ−ズ２０
ｍｌ相当を５０ｍｌのプラスチック遠心管に移し細胞懸
濁液を添加し、更に培地を添加して４５ｍｌに調整した
後、遠心管を室温で３時間ゆっくりと回転させ、浮遊し
ている細胞をビ−ズに接着させた。そして、その後３７
℃、５％ＣＯ2のインキュベ−タ内で培養した。
【００１６】使用した細胞はラット由来の線維芽細胞
（３Ｔ３細胞）で、播種した細胞数は遠心管１本当り５
×１０5ｃｅｌｌとした。細胞播種後２日、１週間、２
週間及び３週目にトリプシン処理によりビ−ズより細胞
を回収、血球計算盤を用いて細胞数を測定した。その結
果を図３に示す。回収された細胞は培養シャ−レ上で正
常な増殖挙動を示した。
（３Ｔ３細胞）で、播種した細胞数は遠心管１本当り５
×１０5ｃｅｌｌとした。細胞播種後２日、１週間、２
週間及び３週目にトリプシン処理によりビ−ズより細胞
を回収、血球計算盤を用いて細胞数を測定した。その結
果を図３に示す。回収された細胞は培養シャ−レ上で正
常な増殖挙動を示した。
【００１７】実施例２
実施例１に記載されている７０％エタノ−ル中で保存し
てあるビ−ズを実施例１の場合と同様の方法で細胞培養
試験を行った。使用した細胞はヒト線維芽細胞で、播種
した細胞数は各カラム当り５×１０5ｃｅｌｌとした。
細胞播種後、２日、１週間、２週間及び３週間目にトリ
プシン処理によりビ−ズより細胞を回収し血球計算盤を
用いて細胞数を測定した。その結果を図４に示す。回収
された細胞は培養シャ−レ上で正常な増殖挙動を示し
た。
てあるビ−ズを実施例１の場合と同様の方法で細胞培養
試験を行った。使用した細胞はヒト線維芽細胞で、播種
した細胞数は各カラム当り５×１０5ｃｅｌｌとした。
細胞播種後、２日、１週間、２週間及び３週間目にトリ
プシン処理によりビ−ズより細胞を回収し血球計算盤を
用いて細胞数を測定した。その結果を図４に示す。回収
された細胞は培養シャ−レ上で正常な増殖挙動を示し
た。
【００１８】
【発明の効果】以上述べたように、本発明はアルギン酸
塩よりなるビ−ズ表面にコラ−ゲンよりなる被覆層を設
けた新規な細胞培養担体であって、この担体に付着した
細胞は担体内部からも養分の供給が可能であり、したが
ってビ−ズに付着した細胞の培養に当ってはマイクロキ
ャリヤ−法だけではなく、カラム内に充填した状態で定
期的に培地を交換するだけで長期間安定に細胞を保持す
ることができる等の効果を奏する。
塩よりなるビ−ズ表面にコラ−ゲンよりなる被覆層を設
けた新規な細胞培養担体であって、この担体に付着した
細胞は担体内部からも養分の供給が可能であり、したが
ってビ−ズに付着した細胞の培養に当ってはマイクロキ
ャリヤ−法だけではなく、カラム内に充填した状態で定
期的に培地を交換するだけで長期間安定に細胞を保持す
ることができる等の効果を奏する。
【図１】本発明にかかる細胞培養担体の説明図
【図２】本発明にかかる細胞培養担体を用いてカラム培
養の説明図
養の説明図
【図３】実施例１における培養時間と細胞数の関係図
【図４】実施例２における培養時間と細胞数の関係図
１ アルギン酸塩
２ ビ−ズ
３ ビ−ズ表面に付着した細胞
４ カラム
５ 注入口
６ 注出口
７ 弁
Claims (2)
- 【請求項１】直径１〜５ｍｍの粒状のアルギン酸塩より
なるビ−ズ表面にコラ−ゲンよりなる被覆層を設けたこ
とを特徴とする細胞培養担体 - 【請求項２】直径１〜５ｍｍの粒状のアルギン酸塩より
なるビ−ズ表面にコラ−ゲンよりなる被覆層を設けた細
胞培養担体に細胞を付着、これをカラム中に充填し、該
カラムに培地を供給して細胞を培養する方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3175771A JPH0581A (ja) | 1991-06-21 | 1991-06-21 | 細胞培養担体及び培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3175771A JPH0581A (ja) | 1991-06-21 | 1991-06-21 | 細胞培養担体及び培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0581A true JPH0581A (ja) | 1993-01-08 |
Family
ID=16001977
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3175771A Pending JPH0581A (ja) | 1991-06-21 | 1991-06-21 | 細胞培養担体及び培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0581A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2839260A1 (fr) * | 2002-05-03 | 2003-11-07 | Inst Nat Sante Rech Med | Microparticules a base d'un materiau bicompatible et biodegradable, supportant des cellules et des substances biologiquement actives |
| US6821107B1 (en) | 1999-10-29 | 2004-11-23 | Secretary Of Agency Of Industrial Science And Technology | Method of forming a structure having multiple cell layers |
| WO2004020572A3 (en) * | 2002-08-27 | 2005-02-17 | Verigen Ag | Bioreactor with expandable surface area for culturing cells |
| EP0927196B1 (en) * | 1996-09-19 | 2008-11-05 | The Regents Of The University Of Michigan | Polymers containing polysaccharides such as alginates or modified alginates |
| WO2011059112A1 (ja) * | 2009-11-13 | 2011-05-19 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 粒子含有細胞集合体 |
| US9579287B2 (en) | 2002-05-03 | 2017-02-28 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Microparticles supporting cells and active substances |
| WO2022239810A1 (ja) | 2021-05-11 | 2022-11-17 | 大日本印刷株式会社 | 乾燥マイクロキャリアおよびその製造方法 |
-
1991
- 1991-06-21 JP JP3175771A patent/JPH0581A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0927196B1 (en) * | 1996-09-19 | 2008-11-05 | The Regents Of The University Of Michigan | Polymers containing polysaccharides such as alginates or modified alginates |
| US6821107B1 (en) | 1999-10-29 | 2004-11-23 | Secretary Of Agency Of Industrial Science And Technology | Method of forming a structure having multiple cell layers |
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| WO2011059112A1 (ja) * | 2009-11-13 | 2011-05-19 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 粒子含有細胞集合体 |
| WO2022239810A1 (ja) | 2021-05-11 | 2022-11-17 | 大日本印刷株式会社 | 乾燥マイクロキャリアおよびその製造方法 |
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