JP3135664B2 - 組織培養方法 - Google Patents
組織培養方法Info
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- JP3135664B2 JP3135664B2 JP04053696A JP5369692A JP3135664B2 JP 3135664 B2 JP3135664 B2 JP 3135664B2 JP 04053696 A JP04053696 A JP 04053696A JP 5369692 A JP5369692 A JP 5369692A JP 3135664 B2 JP3135664 B2 JP 3135664B2
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- tissue culture
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、シリカゲルを利用した
ヒト膀胱癌細胞の組織培養方法に関するものである。
ヒト膀胱癌細胞の組織培養方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】一般にヒト膀胱癌細胞などの動物細胞
は、付着依存性を示し、培養容器の壁面に単層で生育す
る性質があり、通常の培養容器では培養細胞の収率が悪
かった。このため、表面積の大きい組織培養担体を培地
中に加えて、この担体上で細胞を増殖させる培養方法が
採られていた。この培養方法に用いられる組織培養担体
としては、有機物系の高分子物質による担体の他、特開
昭６１−１９５６８７に示されるような、シリカ系多孔
材料上に蛋白質をコーティングした組織培養担体が開発
されていた。特に特開昭６１−１９５６８７に示される
組織培養担体は、以下〜の組織培養担体としての基
本的な条件を満たしており、有用なものであった。
は、付着依存性を示し、培養容器の壁面に単層で生育す
る性質があり、通常の培養容器では培養細胞の収率が悪
かった。このため、表面積の大きい組織培養担体を培地
中に加えて、この担体上で細胞を増殖させる培養方法が
採られていた。この培養方法に用いられる組織培養担体
としては、有機物系の高分子物質による担体の他、特開
昭６１−１９５６８７に示されるような、シリカ系多孔
材料上に蛋白質をコーティングした組織培養担体が開発
されていた。特に特開昭６１−１９５６８７に示される
組織培養担体は、以下〜の組織培養担体としての基
本的な条件を満たしており、有用なものであった。
【０００３】担体表面に細胞が付着し易い。 担体と培地の溶液との比重差が小さい。 担体が生物学的に不活性である。 担体は光を透過し、付着した細胞を簡単に顕微鏡観察
できる。
できる。
【０００４】担体の滅菌処理が可能である。 適度の硬度があり、取扱易い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記特
開昭６１−１９５６８７に示されるような組織培養担体
は、細胞を付着し易くするため、担体表面に蛋白質をコ
ーティングして製造するため、製造工程が複雑である上
に、以下に示すような問題点があった。即ち、担体と細
胞とを分離するための蛋白質分解酵素を使用した場合、
シリカ系多孔材料上にコーティングした蛋白質までもが
同時に分解されてしまうといった問題があった。また、
担体の滅菌処理としては１２０℃のオートクレーブ滅菌
は可能であるが、より確実な乾熱滅菌処理（１８０℃，
１時間）を施すと、シリカ系多孔材料上にコーティング
した蛋白質が変質してしまい、組織培養担体として利用
できなくなるといった問題があった。更に、ヒト膀胱癌
細胞のように、実験用に多量の細胞を頻繁に培養しなけ
ればならない場合には、上記従来の組織培養担体を用い
ていては、組織培養の操作が煩雑なものとなるといった
問題があった。
開昭６１−１９５６８７に示されるような組織培養担体
は、細胞を付着し易くするため、担体表面に蛋白質をコ
ーティングして製造するため、製造工程が複雑である上
に、以下に示すような問題点があった。即ち、担体と細
胞とを分離するための蛋白質分解酵素を使用した場合、
シリカ系多孔材料上にコーティングした蛋白質までもが
同時に分解されてしまうといった問題があった。また、
担体の滅菌処理としては１２０℃のオートクレーブ滅菌
は可能であるが、より確実な乾熱滅菌処理（１８０℃，
１時間）を施すと、シリカ系多孔材料上にコーティング
した蛋白質が変質してしまい、組織培養担体として利用
できなくなるといった問題があった。更に、ヒト膀胱癌
細胞のように、実験用に多量の細胞を頻繁に培養しなけ
ればならない場合には、上記従来の組織培養担体を用い
ていては、組織培養の操作が煩雑なものとなるといった
問題があった。
【０００６】本願は、上記課題を解決し、ヒト膀胱癌細
胞を容易に培養できる組織培養方法を提供することを目
的とする
胞を容易に培養できる組織培養方法を提供することを目
的とする
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の組織培養方法
は、ヒト膀胱癌細胞を平均粒径１〜１０００μｍの光透
過性を有するシリカゲルで培養することを要旨とする。
本発明で使用されるシリカゲルは、平均粒径１〜１００
０μｍの光透過性を有するものならば、キセロゲル及び
ヒドロゲルの何れでも使用できる。通常培養する細胞の
直径が数μｍから数１０μｍであるため、シリカゲルの
平均粒径が１μｍより小さいと、培養及び分離の操作が
困難となる。また、シリカゲルの平均粒径が１０００μ
ｍより大きいと、担体を利用したことによる培地の表面
積拡大の効果が充分得られない。シリカゲルの平均粒径
は、５０〜３００μｍであると、操作性及び表面積拡大
の観点から更に好ましい。更に、細孔容積の大きなシリ
カゲルを使用すると、担体の見かけ比重が培地の溶液の
比重に近づき、緩やかな攪拌によって担体を浮遊状態に
できる傾向にあり、更に好ましい。上記のようなシリカ
ゲルとしては、例えばマイクロビーズ５Ｄ（富士デヴィ
ソン化学（株）社製）が利用できる。また、培地として
は、例えば、ＤＭ−１６０（極東製薬社製）に牛胎児血
清（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を１３重量％加えたも
のを用いることができる。培養容器としては、細菌培養
用ディシュ（直径３５ｍｍ，ファルコン（Ｆａｌｃｏ
ｎ）＃１００８）等が使用できる。また、培養は、例え
ば温度３６．５℃、空気９５％及びＣＯ2５％にセット
した炭酸ガスインキュベーター内で、開放系静置培養で
行うことができる。
は、ヒト膀胱癌細胞を平均粒径１〜１０００μｍの光透
過性を有するシリカゲルで培養することを要旨とする。
本発明で使用されるシリカゲルは、平均粒径１〜１００
０μｍの光透過性を有するものならば、キセロゲル及び
ヒドロゲルの何れでも使用できる。通常培養する細胞の
直径が数μｍから数１０μｍであるため、シリカゲルの
平均粒径が１μｍより小さいと、培養及び分離の操作が
困難となる。また、シリカゲルの平均粒径が１０００μ
ｍより大きいと、担体を利用したことによる培地の表面
積拡大の効果が充分得られない。シリカゲルの平均粒径
は、５０〜３００μｍであると、操作性及び表面積拡大
の観点から更に好ましい。更に、細孔容積の大きなシリ
カゲルを使用すると、担体の見かけ比重が培地の溶液の
比重に近づき、緩やかな攪拌によって担体を浮遊状態に
できる傾向にあり、更に好ましい。上記のようなシリカ
ゲルとしては、例えばマイクロビーズ５Ｄ（富士デヴィ
ソン化学（株）社製）が利用できる。また、培地として
は、例えば、ＤＭ−１６０（極東製薬社製）に牛胎児血
清（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を１３重量％加えたも
のを用いることができる。培養容器としては、細菌培養
用ディシュ（直径３５ｍｍ，ファルコン（Ｆａｌｃｏ
ｎ）＃１００８）等が使用できる。また、培養は、例え
ば温度３６．５℃、空気９５％及びＣＯ2５％にセット
した炭酸ガスインキュベーター内で、開放系静置培養で
行うことができる。
【０００８】更に、シリカゲルの表面の均一性及び機械
的摩耗性の面から、破砕型よりも球型のシリカゲルを使
用することが好ましい。
的摩耗性の面から、破砕型よりも球型のシリカゲルを使
用することが好ましい。
【０００９】
【作用】ヒト膀胱癌細胞は、シリカゲル担体上で良好に
培養可能である。また、本発明の組織培養方法によれ
ば、平均粒径１〜１０００μｍの光透過性を有するシリ
カゲルを担体として使用しているため、例えば１８０℃
の高温下においても物性が変化することがなく、乾熱滅
菌が可能である。また、担体が無機質のみから構成され
ているため、蛋白質分解酵素によって分解されることも
ない。従って、乾熱滅菌処理及び蛋白質分解酵素の使用
が可能となり、培養操作を簡便化でき、ヒト膀胱癌細胞
を容易に培養できる。
培養可能である。また、本発明の組織培養方法によれ
ば、平均粒径１〜１０００μｍの光透過性を有するシリ
カゲルを担体として使用しているため、例えば１８０℃
の高温下においても物性が変化することがなく、乾熱滅
菌が可能である。また、担体が無機質のみから構成され
ているため、蛋白質分解酵素によって分解されることも
ない。従って、乾熱滅菌処理及び蛋白質分解酵素の使用
が可能となり、培養操作を簡便化でき、ヒト膀胱癌細胞
を容易に培養できる。
【００１０】
【実施例】以下本発明を、実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実
施例の記述内容に限定されるものではない。 ［実施例１］組織培養担体として、球状シリカゲル（マ
イクロビーズ５Ｄ、富士デヴィソン化学（株）社製、平
均粒径１４６μｍ）を準備した。この組織培養担体を用
いて、以下のようにしてヒト膀胱癌細胞の培養を行っ
た。
明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実
施例の記述内容に限定されるものではない。 ［実施例１］組織培養担体として、球状シリカゲル（マ
イクロビーズ５Ｄ、富士デヴィソン化学（株）社製、平
均粒径１４６μｍ）を準備した。この組織培養担体を用
いて、以下のようにしてヒト膀胱癌細胞の培養を行っ
た。
【００１１】培養細胞としては、ヒト膀胱癌細胞株ＪＴ
Ｃ−３２（日本組織培養学会登録株）を用いた。培地と
しては、ＤＭ−１６０（極東製薬社製）に牛胎児血清
（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を１３重量％加えたもの
を用いた。また、培養容器としては、細菌培養用ディッ
シュ（直径３５ｍｍ，ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）＃１
００８）を使用した。上記細菌培養用ディッシュに高圧
滅菌（２気圧、１２０℃）した組織培養担体を５０．４
ｍｇ入れ、更に培養細胞を１．５２×１０5個／ディッ
シュとなるように調整し播種した。その後、温度３６．
５℃、空気９５％及びＣＯ2５％にセットした炭酸ガス
インキュベーター内で、開放系静置培養した。 ［培養結果の評価］細胞播種後、１，３，５，７及び１
０日目にそれぞれ細胞数を算出した。細胞数の算出方法
は、以下のように行った。培養細胞をクリスタルバイオ
レット溶液（クエン酸２１g，クリスタルバイオレット
０．５ｇ／ｌ）で３０分以上処理すると、細胞質は分解
されて裸核となり、その核はクリスタルバイオレットで
染色される。この核浮遊液をピペットで血球計算盤に注
入し、光学顕微鏡下で核数を算定する。１実験群につき
３枚のディッシュの核数平均値を細胞数とした。 ［比較例１］組織培養担体として、特開昭６１−１９５
６８７の実施例１と同様の方法により、蛋白質コーティ
ングしたシリカゲルを用意した。即ち、球状シリカゲル
（製品名：マイクロビーズ、富士デヴィソン化学（株）
社製、平均粒径１２５〜５０μｍ、細孔径６２ｎｍ、細
孔容積０．９９ｃｍ3／ｇ）２０ｇを、ゼラチンＧ−１
２５３（新田ゼラチン社製）の１％水溶液に酢酸を加え
てｐＨ３とした溶液１００g中に加え、３０℃の温度で
１２時間攪拌した。その後、０．２Ｍグルタールアルデ
ヒド２０ｍｌを加え３０℃の温度で５時間攪拌し、ゼラ
チンを不溶化した。次いで、ゼラチンを吸着・不溶化し
たシリカゲルをガラスフィルターに移し、脱イオン水を
用いて洗液がコーマシー・ブリリアント・ブルー試薬に
よる発色反応が生じなくなるまで洗浄した。
Ｃ−３２（日本組織培養学会登録株）を用いた。培地と
しては、ＤＭ−１６０（極東製薬社製）に牛胎児血清
（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を１３重量％加えたもの
を用いた。また、培養容器としては、細菌培養用ディッ
シュ（直径３５ｍｍ，ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）＃１
００８）を使用した。上記細菌培養用ディッシュに高圧
滅菌（２気圧、１２０℃）した組織培養担体を５０．４
ｍｇ入れ、更に培養細胞を１．５２×１０5個／ディッ
シュとなるように調整し播種した。その後、温度３６．
５℃、空気９５％及びＣＯ2５％にセットした炭酸ガス
インキュベーター内で、開放系静置培養した。 ［培養結果の評価］細胞播種後、１，３，５，７及び１
０日目にそれぞれ細胞数を算出した。細胞数の算出方法
は、以下のように行った。培養細胞をクリスタルバイオ
レット溶液（クエン酸２１g，クリスタルバイオレット
０．５ｇ／ｌ）で３０分以上処理すると、細胞質は分解
されて裸核となり、その核はクリスタルバイオレットで
染色される。この核浮遊液をピペットで血球計算盤に注
入し、光学顕微鏡下で核数を算定する。１実験群につき
３枚のディッシュの核数平均値を細胞数とした。 ［比較例１］組織培養担体として、特開昭６１−１９５
６８７の実施例１と同様の方法により、蛋白質コーティ
ングしたシリカゲルを用意した。即ち、球状シリカゲル
（製品名：マイクロビーズ、富士デヴィソン化学（株）
社製、平均粒径１２５〜５０μｍ、細孔径６２ｎｍ、細
孔容積０．９９ｃｍ3／ｇ）２０ｇを、ゼラチンＧ−１
２５３（新田ゼラチン社製）の１％水溶液に酢酸を加え
てｐＨ３とした溶液１００g中に加え、３０℃の温度で
１２時間攪拌した。その後、０．２Ｍグルタールアルデ
ヒド２０ｍｌを加え３０℃の温度で５時間攪拌し、ゼラ
チンを不溶化した。次いで、ゼラチンを吸着・不溶化し
たシリカゲルをガラスフィルターに移し、脱イオン水を
用いて洗液がコーマシー・ブリリアント・ブルー試薬に
よる発色反応が生じなくなるまで洗浄した。
【００１２】この組織培養担体を用いて、実施例１と同
様にして、ヒト膀胱癌細胞の培養及び培養結果の評価を
行った。 ［比較例２］組織培養担体を用いず、細菌培養用ディッ
シュの代わりに組織培養用ディッシュ（直径３５ｍｍ，
ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）＃３００１）を使用して、
その他の培養条件は実施例１と同様にしてヒト膀胱癌細
胞を単層培養した。その後、実施例１と同様にして培養
結果の評価を行った。
様にして、ヒト膀胱癌細胞の培養及び培養結果の評価を
行った。 ［比較例２］組織培養担体を用いず、細菌培養用ディッ
シュの代わりに組織培養用ディッシュ（直径３５ｍｍ，
ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）＃３００１）を使用して、
その他の培養条件は実施例１と同様にしてヒト膀胱癌細
胞を単層培養した。その後、実施例１と同様にして培養
結果の評価を行った。
【００１３】実施例１及び比較例１，２の培養結果の細
胞数を表１及び図１に示した。
胞数を表１及び図１に示した。
【００１４】
【表１】
【００１５】図１から、対数増殖期は、細胞播種後１〜
５日目にあたり、この期間での細胞集団倍加時間は、比
較例２が６２．４，実施例１が４１．７及び比較例１が
３９．８時間である。従って、比較例２に比べて実施例
１は高い増殖率を示し、また、実施例１及び比較例１の
細胞増殖率の間には、有意の差は認められなかった。
５日目にあたり、この期間での細胞集団倍加時間は、比
較例２が６２．４，実施例１が４１．７及び比較例１が
３９．８時間である。従って、比較例２に比べて実施例
１は高い増殖率を示し、また、実施例１及び比較例１の
細胞増殖率の間には、有意の差は認められなかった。
【００１６】更に、比較例２では、細胞が密集状態にな
ると細胞シートが基質（ディッシュ）から遊離してしま
うが、実施例１では比較例１と同様にそのような現象は
認められなかった。また、実施例１の組織培養の過程を
倒立位相差顕微鏡で観察したところ、細胞播種後、細胞
は次々と担体を巻き込んでクラスターを形成した。その
クラスターは次第に大きくなり、１０日目で最大幅約５
ｍｍにもなった。比較例１についても同様の観察を行っ
たところ、クラスター形成過程における実施例１と比較
例１との間に、有意の差はなかった。
ると細胞シートが基質（ディッシュ）から遊離してしま
うが、実施例１では比較例１と同様にそのような現象は
認められなかった。また、実施例１の組織培養の過程を
倒立位相差顕微鏡で観察したところ、細胞播種後、細胞
は次々と担体を巻き込んでクラスターを形成した。その
クラスターは次第に大きくなり、１０日目で最大幅約５
ｍｍにもなった。比較例１についても同様の観察を行っ
たところ、クラスター形成過程における実施例１と比較
例１との間に、有意の差はなかった。
【００１７】以上述べたように、本実施例の組織培養方
法は、従来行われてきた比較例１の組織培養方法と同様
に、ヒト膀胱癌細胞を良好に培養できた。また、本実施
例の組織培養方法により組織培養を行えば、細胞が密集
状態になってもクラスターを形成して増殖を続けるた
め、細胞の大量培養も可能である。
法は、従来行われてきた比較例１の組織培養方法と同様
に、ヒト膀胱癌細胞を良好に培養できた。また、本実施
例の組織培養方法により組織培養を行えば、細胞が密集
状態になってもクラスターを形成して増殖を続けるた
め、細胞の大量培養も可能である。
【００１８】上述のように、本実施例の組織培養方法に
よれば、ヒト膀胱癌細胞を良好に培養することができ
た。また、本実施例の組織培養方法によれば、乾熱滅菌
の実施が可能であるためより確実な滅菌を施すことがで
き、さらに蛋白質分解酵素の使用が可能であるため培養
した細胞の分離操作が行い易い。このため、ヒト膀胱癌
細胞を容易に培養することができる。
よれば、ヒト膀胱癌細胞を良好に培養することができ
た。また、本実施例の組織培養方法によれば、乾熱滅菌
の実施が可能であるためより確実な滅菌を施すことがで
き、さらに蛋白質分解酵素の使用が可能であるため培養
した細胞の分離操作が行い易い。このため、ヒト膀胱癌
細胞を容易に培養することができる。
【００１９】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
ヒト膀胱癌細胞を容易に培養できる組織培養方法を提供
できる。
ヒト膀胱癌細胞を容易に培養できる組織培養方法を提供
できる。
【図１】ヒト膀胱癌細胞の培養結果を示すグラフであ
る。
る。
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒト膀胱癌細胞を平均粒径１〜１０００
μｍの光透過性を有するシリカゲルで培養することを特
徴とする組織培養方法。 - 【請求項２】 上記シリカゲルが球状であることを特徴
とする請求項１記載の組織培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04053696A JP3135664B2 (ja) | 1992-03-12 | 1992-03-12 | 組織培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04053696A JP3135664B2 (ja) | 1992-03-12 | 1992-03-12 | 組織培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05252944A JPH05252944A (ja) | 1993-10-05 |
| JP3135664B2 true JP3135664B2 (ja) | 2001-02-19 |
Family
ID=12949981
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04053696A Expired - Fee Related JP3135664B2 (ja) | 1992-03-12 | 1992-03-12 | 組織培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3135664B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2886529A1 (en) * | 2013-12-20 | 2015-06-24 | Evonik Industries AG | Process for producing methyl methacrylate |
| JP6711424B2 (ja) | 2017-02-01 | 2020-06-17 | 株式会社島津製作所 | 細胞培養用ゲル組成物およびその製造方法、細胞培養方法ならびに細胞培養用基板 |
-
1992
- 1992-03-12 JP JP04053696A patent/JP3135664B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05252944A (ja) | 1993-10-05 |
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