JPS6225974A - コラ−ゲンよりなるゲル状組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、細胞培養に関するものである。さらに詳しく
は、大量に細胞培養することＫより、その産生物を取得
する構造体に関する。

（従来の技術） 従来の動物細胞の大量培養法は、はとんどが単層培養の
改良法で、表面積／容積をいかに上げるかが問題となる
。これに対して、コラーゲンゲル内に細胞を埋め込みプ
ラスチック基質上に接着させると、細胞は三次元的に増
殖し、表面培養法に比して高い細胞密度を得ることがで
きる。しかしながら、この場合、培地が一方向からしか
浸透しない友め、増殖速度が遅いという欠点がある。ま
た、ゲルを培地中に浮遊させた場合、培地は三方から浸
透するが、細胞が増殖するとゲル収縮が起こり、細胞が
死滅してしまう。

（発明が解決しようとする問題点） 上記に示すように、コラーゲンゲルはすばらしいもので
あるが、培地中に浮遊させた場合、ゲル収縮が起こるの
で、これを改良することが要求されていた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、コラーゲンゲル内に支持体を混入すると
、驚ろくべきことに、収縮がおさえられ動物細胞が良好
に生育することを見出し、さらに検討の結果、ヒト正常
二倍体線維芽細胞においても５．ＯＸ　１０丁ｃｅｌＪ
ｓ／ｄの細胞密度を得ることができ、本発明を完成する
に至った。

すなわち、本発明は、動物細胞、該動物細胞の培地、水
不溶性の支持体およびコラーゲ／よシなるゲル状組成物
に関するものである。

本発明でいう動物細胞とけ、昆虫細胞、魚類細胞、両生
類細胞、爬虫類細胞、鳥類に＋１１胞または咄乳知細胞
であり、浮遊性細胞−（゛も、接着依存性細胞でもよい
。また、正常油］胞でもガン細胞でもよい。哨乳類細胞
のなかでも、マウス、ラット、ヒト、ウマ、サル、ウシ
等の卸１胞がよく用いられる。

ヒトの中でもヒト線維芽様細胞が】Δしている。

本発明に卦ける培地成分は、通常、動物細胞培養に使用
される一般的な培地をいう。

具体的には、Ｍ　Ｅ　Ｍ、　　１９９Ｍｅｄｉｕｍ、　
ＨＡＭ。

ＲＰＭＩ−１６４０培地、マツコイ５Ａ培地、Ｌ−１５
培地、ウェイマウス培地等゛またけそれらの混合物が好
′ましい。場合によってＶ↓、これに動物血清およびビ
タミン等の補填液を加えることもある。

本発明におけるコラーゲンけ、Ｉ型コシーゲンが主に用
いられる。Ｉ型コラーゲンの中でも中性塩ｉｉｆ溶性コ
ラーゲン、酸可溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン
、アテロコラーゲンが用いられる。

Ｉ型コラーゲンの濃度は０．１〜０．５％が一般的であ
るが、符に０．２％が適している。０．１〜０．５俤を
はずれると、細胞の増殖に影響を与える。

本発明の支持体は、培地中で溶解したり、化学変化した
りすることなく安定で、旬時間に沈降あるいは凝集した
すせず、また、動物細胞の生育に障害を与えないもので
あればよい。

本発明の支持体は、ステープル状のもの、スポンジ状の
もの、へちま状のもの、布状のもの、網目状のもの、ニ
ードルパンチ状のもの、紙状のもの、糸状のもの、また
１１それらを組合わせた構造体等がよく用いられる。

本発明の支持体は、セルロース等の天然高分子固体、コ
ラーゲン、ケラチン、エラスチン等の生体高分子固体、
ポリウレタンフォーム、ポリエステル、ポリアクリロニ
トリル、ポリアミド等の合成高分子固体が一般に用いら
れる。

本発明の支持体は、ステープル状の場合にはゲル内に均
一に分散させて用い、その長さは０．１〜５１が適当で
ある。０．１１より短いと、収縮を防止する効果かうす
く、５關より長いと、細胞の増殖にさまたげとなる。

本発明の支持体がステープル状でない場合は、ゲル内に
包括して用いる。

本発明の支持体は、ゲル状組成物中に１〜４０体積係含
−ませて用いる。１体積係より少ないと、収縮防止効果
がうすれ、４０体体積上り多いと、細胞の増殖にさまた
けとなる。

本発明のゲル状組成物の形状に特に制限はなく、平板状
、球状、六面体状、五面体状、円筒状等のものが用いら
れる。

本発明のゲル状組成物は、たとえば、以下のようにして
製造する。

蒸留水１ｔに培地５０〜２００？および抗生物質０〜１
ｖを加えて溶解し、濾過滅菌してＡ液とする。

０．０５　Ｎ水酸化ナトリウム溶液１００−にアルカリ
１〜５ｖおよびＴ（ＥＰＥＳ２〜５ｒを溶かし濾過滅菌
してＢ液とする。

コラーゲンを１〜５ｍｇ含んだｐ　Ｈ３，０の水溶液５
〜２０−に、水冷下、上記のＡ液０．５〜３−１Ｂ液０
．５〜５−３を順次加え、さらに、単層培養した動物細
胞を常法により、トリプシン−ＥＤＴＡ水溶液あるいけ
トリプシン水浴液ではがした細胞懸濁液０．５〜３　ｍ
ｌを加え攪拌する。混合液に滅菌した支持体を１〜４０
体積係加え、ただちに３７Ｃで０．１〜２時間インキュ
ベートＬ、ゲル化させる。支持体を１〜４０体積係必要
とすることは前述のとおりであり、また、上記製法の試
薬および溶液の量の範囲をはずれると、細胞の増殖に影
響を及ばず。以上の操作は、すべて無菌的に行なう。

この製法は、１０７倍までスケールアップすることがで
きる。また、これより小スケールでもよい。

また、以下のようにしても製造できる。

生体から抽出したコラーゲン溶液に、通常用いられる培
養液の２〜２０倍濃度の濃縮液を加え、アルカリでｐ　
Ｈ７，４に調整する。場合によっては、これに血清を加
えることもある。これに動物細胞を単層培養したものを
、ＥＤＴＡ−１リプシン水溶液またはトリプシン水溶液
ではがした細胞懸濁液を加える。混合液に支持体を加え
て、３７Ｃでゲル化する。以上の操作は、すべて無菌的
に行なう。

以上の操作により製造したゲル状組成物は、培地中に浮
遊させて用いる。ゲル状組成物をプレートまたはシャー
レ状の容器中で用いる場合は、平板状のものを用いる。

また、スピナーフラスコまたは大規模ジャーファーメン
タ−で用いる場合は、球状または六面体等のゲル状組成
物のビーズを複数個用いるのが一般的である。

Ｃ発明の効果） ゲル状組成物を培養液中で浮遊させ細胞を増殖サセルト
、最大５．Ｏｘ　１０”　ｃｅｌｌｓ／−まで増殖し、
さらＫＴＰＡを産生させたところ、１０００Ｕ／ｍ／の
濃度を得た。

（実施例） 実施例１ Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　９６　ｆ、アンピシリン
５ｏｏｍｇを蒸留水１ｔに溶解し、濾過滅菌した。この
溶液をＡ液とした。

０．０５　Ｎ水酸化す）　ＩＪウム浴液に重炭酸ナトリ
ウム２．２　ｆ７１００　ｍ／、ＨＥＰ　Ｅ　８４．７
７Ｖ／１００−を溶かし、濾過滅菌した。この溶液をＢ
液とした。

Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ　Ｉ　（新田ゼラチン社製、３．
０１１Ｉ７／ｄ、ｐＨ３，０）１４−に、水冷下Ａ液２
−とＢ液２−を順次加え、さらに、単層培養したＨｇＬ
細胞を常法により、トリプシン−ＥＤＴＡ水溶液ではが
した細胞懸濁液（Ｉ　Ｘ　１０’細胞／ｌｄ）２ｍｌを
加え攪拌した。混合液を直径５’ａｌｌのオートクレー
ブ滅菌したセルロースよりなるガーゼの上に撒き、ただ
ちに３７［３０分間インキユベートシ、ゲル化させた。

以上の操作は、すべて無菌的に行なった。製造したゲル
状組成物を直径９０１１＋１１のディツシュの中に入れ
、増殖培地中で浮遊させ培養を行なったところ、５．Ｏ
ｘ　１０？　ｃｅｌｌｓ、個の細胞密度を得た。さらに
、ＴＰＡを産生させたところ、１０００　Ｕ／−の一度
を得た。

実施例２ 実施例１のＨＥＬ細胞のかわりにＦｌｏｗ、；　７０　
、口０を使い、ガーゼのかわりに５Ｍｌ１角の正六面体
ウレタンフオームチップ１６０個を用い、ゲル状組成物
を作製した。ゲル状組成物を培地２０ｄを入れたスピナ
ーフラスコ中で浮遊攪拌させたところ、５、ＯＸ　１０
マｃｅｌｌｓ／−の細胞密度を得た。さらに、ＴＰＡを
産生させたところ、トータル１万５千ユニツトのＴＰＡ
を得た。

実施例３ 実施例１のＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ　Ｉのかわ抄にＣｅｌ
１ｍａｔｒｉｘ■（新田ゼラチン社製、３．０■／ｗｌ
、　ｐＨ３，０）を用い、ＨＥＬ細胞のかわりにＭＬｇ
細胞を用い、また、ガーゼのかわりＩｃ　Ｉ　ＩＩＩ長
に切ったポリアクリロニ）　ＩＪル繊維のステープル１
００ｍｇを用いて、ゲル状組成物を作製した。ゲル状組
成物を？　０１１１１径のディツシュ中、増殖培地２０
−を入れ培養を行なったところ、３，０Ｘ１０フ（ｅｌ
　Ｉｓ／−の細胞密度を得た。

　９　一 実施例４ 実施例１のＨＥＬ細胞のかわりにＣＧ　Ｂ　ＱＭ胞を用
い、ガーゼのかわりに、ポリエステルよりなる５　Ｉｌ
ｌ　Ｘ　５　ＩＩＩの布２枚の間に、直角に繊維を張っ
たサンドイッチ構造を持つ５　ｔａｒｓ角の構造体を使
用し、ゲル状組成物を製造した。ゲル状組成物を培養液
２０−を入れたスピナーフラスコ中で培養したところ、
２．５Ｘ１０’　ｃｅｌｌｓ／ゴの細胞密度を得た。

実施例５ Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ　Ｔ　（新田ゼラチン社製、　ｉ
ｎ　ｍｙ／＋＋ｒｌ。

ｐＨ３，０１１４ｔに、水冷上実施例１のＡ液２ｔ。

Ｂ液２ｔを順次加え、さらに、単層培養したＨＥＬ細胞
を常法により、トリプシン−ＥＤＴＡ水溶液ではがした
細胞懸濁液（１ｘ　１０’　ｃｅｌ　Ｉｓ／ａｄ　）２
ｔを加え攪拌した。混合液を５　＋ｕ角のオートクープ
した正六面体ウレタンフオームチップ１６万個にしみ込
ませ、ただちに３７Ｃ２時間インキュベートした。製造
したゲル状組成物を２０１のジャーファーメンタ−で培
養したところ、５．０×１０フｃｅｌｌｓ／−の細胞密
度を得た。

−１ロ　− 実施例６ ウシ皮膚をペプシン処理して抽出したアテロコラーゲン
を１を中に５．０〜含むＩ）Ｈ・５の溶液１４１！７！
に、実施例１のＡ液２−を加え、ＮａＯＨ１”　ｐ　Ｉ
（７，４に調整し、さらに、ＣＶ−１細胞全率層培養し
。

トリプシン−ＥＤＴＡ処理した細胞ａ／！ｊｉｌ液（２
０口Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／ｍ　）　２−を加え、さ
らに１ウシの皮粉１００〜を混ぜ、よく攪拌した。混合
液′ｆｃ５ｍｌ　Ｘ　５　ｍｍ角のオートクレーブ滅菌
したポリウレタンフォーム１６０個にしみ込ませ、５７
Ｃで１時間インキュベートした。製造したゲル組成物を
、培養液２０−を加えたスピナーフラスコ中で培養し、
２．ＯＸ　１０マｃｅｌｌｓ／ゴの細胞密度を得た。

実施例７ 実施例６のウシ皮膚をペプシン処理して抽出したアテロ
コラーゲンのかわりに、ラット速ヲ酢酸で抽出して得た
酸可溶性コラーゲンを用してゲル状組成物を作製した。

実施例８ １９９Ｍｅｄｉｕｍ１００ｆ、ゲンタマイシン５００Ｉ
ｎ＆を蒸留水１ｔに溶解し、濾過滅菌した。この溶液を
Ｃ液とした。

Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ　Ｉ（新田ゼラチン社Ｍ　１３．
ｏ　ｔｖ／ｌｎｔ。

ｐＨ３，０）１４−に、水冷下Ｃ液２−５Ｂ液２ゴを順
次加え、さらに、単層培養したＡＶ、細胞全常法により
、トンプシン水溶液でけがした細胞懸濁液２ｄを加え、
よく攪拌し、ただちに直径９０１１ｍのオートクレーブ
滅菌したガーゼ上に撒き、３７Ｃで１時間インキュベー
トした。以上の操作は、すべて無菌的に行なった。この
ように製造したゲル状組成物を、直径９０ｍｍのディツ
シュの中で、培養液２〇−中に浮遊させて培養したとこ
ろ、２、Ｏｘ　１０７ｃｅｌｌｓ／１ＩＬｔの細胞密度
を得た。

実施例９ 実施例８のＡＶ、細胞のかわりに、［、−１３２細胞を
用いて、ゲル状組成物を作製した。

実施例１０ 実施例２のＦｌｏｗ７０００のかわりにＨＥ　Ｌ　細胞
を用いて、ゲル状組成物を製造した。培養を行ったとこ
ろ、６．ＯＸ　１０’　ｃｅｌｌｓ／−の細胞密度を得
た。さらに、ＴＰＡの生産を行なったところ、１力月間
生産を続け、トータル２万ユニツトのＴＰＡを取得する
ことができた。

実施例１１ 実施例５のＭＬｇ細胞のかわりにＨＥ　Ｌ細胞を用い、
ゲル状組成物を作製した。ゲル状組成物をディツシュ中
で浮遊培養したところ、４．０ＸＩＯ？ｃｅｌｌｓ／−
の細胞密度を得た。さらに、ＴＰＡの生産を行なわせた
ところ、１００ＯＵ／ｇ＋／のＴＰＡｔ−取得すること
ができた。

実施例１２ 実施例４のＣＧＢＱ細胞のかわりにＨＥＬ細胞細胞−用
ゲル状組成物を作製した。ゲル状組成物を培養液２０−
を入れたスピナーフラスコ中で培養し友ところ、　　２
．５　Ｘ　１０７ｃｅｌｌｓ／−の細胞密度を得、さら
に％ＴＰＡの生産を行なったところ、トータル１万ユニ
ツトのＴＰＡを得ることができた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 動物細胞、該動物細胞の培地、水不溶性の支持体および
   コラーゲンよりなるゲル状組成物。